CC BY
92
HayKOBMM BiCHMK ^tBiBCtKoro Ha^OHa^tHoro yHiBepcMTeTy
BeTepMHapHoi Megw^HM Ta öioTexHO^oriw iMem C.3. I^M^Koro
Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies
ISSN 2519-268X print ISSN 2518-1327 online
doi: 10.32718/nvlvet9012 http://nvlvet.com.ua/
UDC 637.1.075.579.66
Characteristic features of Enterococcus faecalis film formation on the stainless steel AISI 321 depending on the surface roughness
K.U. Kravcheniuk
Ternopil Ivan Puluj National Technical University, Ternopil, Ukraine
Article info
Received 14.09.2018 Received in revised form 12.10.2018 Accepted 15.10.2018
Ternopil Ivan Puluj National
Technical University,
Ruska Str., 56, Ternopil,
46001, Ukraine.
Tel.: + 38-035-251-97-01
E-mail: [email protected]
Kravcheniuk, K. U. (2018). Characteristic features of Enterococcus faecalis film formation on the stainless steel AISI 321 depending on the surface roughness. Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies. 20(90), 58-62. doi: 10.32718/nvlvet9012
At the present .stage of milk products manufacture, the most important factor affecting their safety and reducing their storage time is a microbiological one. Despite all complex of measures including washing, disinfection, heat processing to eliminate microbes on production equipment and in the finished products it is very difficult to achieve good results. This deals with the fact that microorganisms can survive on the production equipment thanks their ability to form biofilms and also treatment-resistant microorganisms strains appear in the process of continuous sanitary treatment. The aim of the paper was to study the biofilms Enterococcus faecalis formation on the stainless steel AISI 321 depending on their initial quantity and surface roughness. The plates made of the stainless steel AISI 321of surface roughness Ra = 0.955 mkm, Ra = 0.63 mkm and Ra = 0.16 mkm were used for the investigation. It was found that during 9 hours Enterococcus faecalis was forming the biofilms of weak density less than 0,5 units on the stainless steel surface of AISI 321 of roughness Ra = 0.955 mkm. After the 12th hour the intensive film formation process was noticed in the options with initial number of cells E.f from 2000 to 10 000 and 20-50 thousand/ cm2, the biofilm was getting of high density - 1.246 and 1.415 respectively with initial number of cells less than 1000 per 1 cm2 of steel surface and it was of medium density - 0.672 cells. The process of film formation on the steel surface of roughness 0.63 mkm was rather decelerating, in comparison with the surface of roughness 0.955 mkm. Though, despite this, in the options with initial number of E.f. cells from 2000 to 10 000 and 20-50 thousand/cm2 the biofilms were of high density after the 12th hour of incubation, i.e. it was the same as for the surface of 0.955 mkm roughness. The process of film formation at such initial numbers of E.f. on the surface of roughness 0.63 mkm was finishing after the 24'h hour while at roughness 0.955 mkm - after the 18th hour of incubation. It was found that on the steel surface of roughness 0.16 mkm the process of film formation was greatly getting slower comparing to the surfaces of roughness 0.955 and 0.63 mkm. During 12 hours of E.f. incubation in case when the initial number of E.f. was less than 1000 per 1 cm2 the film was of weak density but in cases when the initial number was 2000 - 10 000 and 20-50 thousand/cm2 the biofilms were of medium and high density - 0.917 and 1.025 units. After 18 hours of incubation the film was of medium density only in case when the initial number was less than 1000 E.f. per 1 cm2 of the surface. At larger initial number of bacteria it was of high density. Only after 24 hours of E.f. incubation biofilms in all options were of high density. Thus, we came to the conclusion that E.f. biofilms formation on the stainless steel AISI 321 is influenced by the surface roughness and initial number of bacteria. The results have shown that on the plates of roughness 0,16 mkm the film formation process is slower than on the surface of roughness 0.955 and0.63 mkm.
Key words: roughness, microbial biofilm, formation, Enterococcus faecalis, density, stainless steel, processing equipment.
Характеристика процесу плiвкоутворення Enterococcus faecalis на нержав^чш сталi AISI 321 залежно ввд шорсткост поверхш
Х.Ю. Кравченюк
Тернопшьський нaцiонaльний техтчний ymieepcumem iMem !вана Пулюя, м. Тернопшь, Укрта
На сучасному emani виробництва молочних npodyKmie найбтьш важливим чинником, який впливае на ïx безпеку, а також зни-жуе стштсть при зберкант е мiкробiологiчний. Незважаючи на запровадження всього комплексу захоЫв таких, як миття, дез-тфекщя, теплова обробка, щодо знищення мiкрооргaнiзмiв на mexнологiчномy устаткувант та в готовому nродyкmi дуже важко досягти ефективного результату. Це пов 'язано з тим, що мтрооргатзми виживають на технолог1чному устаткуванш завдяки здamносmi формувати бiоnлiвки, а також в процеd посттног санобробки залишаються стшт штами мiкрооргaнiзмiв. Метою роботи було до^дити формування бiоnлiвок Enterococcus faecalis на нержавтчт сmaлi марки AISI 321, залежно вiд ïx початко-воХ кiлькосmi i шорсmкосmi поверхт. Для до^дження були викорисmaнi пластинки з нержавючог сmaлi марки AISI321, з шорсттстю поверхн Ra = 0,955 мкм, Ra = 0,63 мкм та Ra= 0,16 мкм. Встановлено, що протягом 9 год. Enterococcus faecalis формував бiоnлiвки слабког щiльносmi до 0,5 од. на поверхн нержавючог сmaлi з шорсттстю 0,955 мкм. На 12 годину було виявлено ттен-сивний процес nлiвкоymворeння у вaрiaнmax з початковою ктьтстю клтин Е. f. вiд 2 до 10 тис. та 20-50 тис./см2 площi, бiоnлiвкa ставала високог щiльносmi - 1,246 та 1,415 од. вiдnовiдно, з початковою ктьтстю до 1 тис. клтин на см2 nлощi сmaлi - вона була середньог щiльносmi - 0,672 од. Процес формування бiоnлiвки на поверхн сmaлi з шорсттстю 0,63 мкм, був дещо сповтьнений, nорiвняно з поверхнею iз шорсттстю 0,955 мкм. Однак, незважаючи на це, у вaрiaнmax з початковою ктьтстю клтин Е. f. 210 тис. i 20-50 тис. на см2 nлощi бiоnлiвки були високог щiльносmi починаючи з 12 годин ткубацп, тобто aнaлогiчно, як на поверх-ж iз шорсттстю 0,955 мкм. Процес nлiвкоymворeння за таких початкових ктькостях Е. f. на поверхн з шорсттстю 0,63 мкм завершувався на 24 год., в той час же час, як за шорсmкосmi 0,955 мкм на 18 год. ткубацп. Виявлено, що на поверхн сmaлi з шорсттстю 0,16 мкм процес nлiвкоymворeння значно сповтьнився, nорiвняно з поверхнями, ят мали шорсттсть 0,955 та 0,63 мкм. Протягом 12 год. ткубацп Е. f. у вaрiaнmi з початковою ктьтстю до 1 тис. на см2 nлощi бiоnлiвкa була слабког щтьно-стi, а у вaрiaнmax з початковою ктьтстю 2-10 тис. i 20-50 тис. на см2 nлощi - середньог та високог щiльносmi - 0,917 i 1,025 од. За 18 годин ткубацп бiоnлiвкa була середньог щiльносmi ттьки у вaрiaнmi з початковою ктьтстю до 1 тис. E. f. на см2 поверхт. За бтьшог початковог кiлькосmi бактерш вона була високог щiльносmi. Ттьки через 24 год. ткубацп E. f. бiоnлiвки у вЫх вaрiaнmax були високог щтьности Отже, можна вiдзнaчиmи, що на процес формування бiоnлiвок E. f. на нержавтчт сmaлi марки AISI 321впливае шорсттсть поверхн та початкова ктьтсть бактерш. Результати вказують, що на пластинках з шорсттстю 0,16 мкм процес nлiвкоymворeння проходить повтьнше, nорiвняно з шорсттстю поверхн 0,955 та 0,63 мкм.
Ключовi слова: шорсттсть, мтробна бiоnлiвкa, формування, Enterococcus faecalis, щтьтсть, нержавюча сталь, технологi-чне обладнання.
Вступ
Виготовлення стшко1 при збертанн молочно1 продукцп визначаеться яшстю сировини i санггарним станом обладнання (Kukhtyn et al., 2017). Важливу роль у мжробюлопчному забрудненн продукпв ввд-грае поверхня технолопчного обладнання, осшльки саме поверхня е найважлившим джерелом мжробно1 контамшацп продукци (Bremer et al., 2009; Kukhtyn et al., 2017). Результати наукових дослщжень вказують, що мжрооргашзми виживають на технолопчному устаткуванш завдяки специфiчнiй властивосп - це здатносп формувати бiоплiвки (Marchand et al., 2012).
Вщомо, що процес формування бюшнвок на пове-рхнях технолопчних лшш молочного устаткування мае сво1 особливосл. Це пов'язано з наявшстю велико! шлькосп згишв, з'еднань, рельефу та шорсткосп поверхш молочного обладнання (Perni et al., 2013; Hcevar et al., 2014).
У молочнш промисловосп шорстшсть поверхш нержавшчо1 стал не повинна перевищувати Ra=0,8 мкм (EHEDG, 2004) i вважаеться, що чим вона менша, тим буде бшьш ппешчна. Проте, в процеа експлуа-тацп поверхня нержавшчо1 стал зазнае змш i на тй появляються мшротрщини, потертости подряпини, як збшьшують шорстшсть i тим самим площу контакту з мшрооргашзмами (Hcevar et al., 2014). Отже, рельеф, шорстшсть та структура поверхш обладнання мають значний вплив на процес формування мжроб-них бiоплiвок.
Метою роботи було дослцщти формування бюп-лiвок Enterococcus faecalis на нержаыючш стал марки AISI 321, залежно ввд гх початково1 шлькосп та шорсткосп поверхш.
MaTepia™ та методи дослщжень
Для дослвдження були використаш пластинки з нержавшчо1 корозшно-стшко1 сталi марки AISI 321, розмiром 30^30 мм та товщиною 5 мм, з шорстшстю поверхш Ra = 0,955 мкм, Ra = 0,63 мкм та Ra = 0,16 мкм.
З метою визначення впливу шорсткосп поверхш нержавшчо1 сталi на процес формування бiоплiвки Enterococcus faecalis, дослщження роздшили на три варiанти. У першому варiантi в стерильш чашки Петрi ставили стерильш пластини з нержавшчо1 стал з ввдповщною шорстшстю поверхш i вносили в чашку МПБ з концентрашею Е. f., щоб на 1 см2 площ пластини припадало, в середньому до 1 тис. клггин. У другому варiантi у чашки Петрi з пластинами нержа-вшчо1 сталi вносили МПБ з концентрашею Е. f. ввд
2 тис. до 10 тис. клтшн на 1 см2 площт У третьому варiантi у чашки Петрi з пластинами нержавшчо1 стал вносили МПБ з концентрашею Е. f. ввд 20 тис. до 50 тис. клгшн на 1 см2 площт Через 3, 6, 9, 12, 18 та 24 годин шкубацп за температури 37 °С пластини витягували з чашок Петр^ триразово ввдмивали ввд планктонних (неприкршлених) мiкроорганiзмiв фос-фатним буфером та фжсували утвореш бiоплiвки Е. f. 96° етиловим спиртом. Шсля фжсування бiоплiвки фарбували, у 0,1% розчиш кристалiчного фюлетово-го. Попм кожну пластинку окремо заливали 7,0 см3 96° етиловим спиртом та залишали на 10 хв. Шсля експозицп 10 хв ввдбирали 5 см3 промивного розчину
3 бiоплiвок та визначалий його оптичну густину спек-трофотометрично за довжини хвилi 570 нМ.
За оптично1 густини промивного розчину до 0,5 од. щшьшсть сформованих бiоплiвок вважали низькою, в1д 0,5 до 1,0 од. - середньою та при густиш розчину б№ше 1,0 од. щ№шсть сформованих бюпль вок вважали високою (Kukhtyn et al., 2017).
Шорстшсть поверхонь пластин нержавшчо! стал визначали за допомогою профшометра марки 296, згадно ГОСТ 2789-73 (GOST 2789-73, 1973).
Результати та ix обговорення
Результати дослвджень формування бюпл1вки на нержавшчш стал! марки AISI 321 з шорстшстю поверхш 0,955 мкм, залежно ввд початково!' шлькосп кль тин E.f. протягом 24 годин наведено на рис. 1.
На рис. 1 показано, що за початково! шлькосп E.f. на поверхш до 1 тис./см2 площ! через три години щшьшсть бюпл!вки була практично така ж, як у конт-
роле У той же час за початково! юлькосп E.f. вщ 2 до 10 тис./см2 площ!, щшьшсть бюпл1вки зросла в 1,5 рази (Р < 0,05), а за початково! шлькосп E.f. вш 20 до 50 тис. в 2,1 раза (Р < 0,05). Упродовж шести та дев'яти годин шкубацп бюпл1вка Е. f. у вах вар1антах ставала щшьшша, однак протягом 9 годин вирощу-вання вона ще була слабкою до 0,5 од. На 12 годину спостерпаеться штенсивний процес пл1вкоутворення у вар1антах з початковою шльшстю клгтин Е. f. вш 2 до 10 тис. та 20-50 тис./см2 площ1, б1опл1вка ставала високо! щ1льност1 - 1,246 та 1,415 од. в1дпов1дно, з початковою шлькютю до 1 тис. клггин на см2 площ1 стал1 - вона була середньо! щ1льност1 - 0,672 од.
Рис. 1 Формування бюпл1вки Е. f. на нержавшчш стал1 марки AISI 321 шорстк1стю Ra= 0,955 мкм при
температур! 37 °С
На 18 годину шкубацп Е. f. на поверхш стал! з шорстшстю 0,955 мкм процес пл!вкоутворення практично завершився у вар!антах з початковою шльшстю клгшн Е. f. в!д 2 до 50 тис. на см2 площ!, а у вар!аш1 до 1 тис. клтшн б!опл!вка стала високо! щшьносп -1,295 од. У цьому вар!ант! процес пл!вкоутворення завершився на 24 годин!, тобто щшьшсть бюпл!вок зр!внялася, як у вар!антах два та три.
За результатами проведених дослвджень встанов-лено, що при сприятливш температур! E. f. протягом 9-12 год. здатний формувати бюпл!вки середньо! та
високо! щ1льност1 на поверхн1 нержавгючо! стал1 з шорстшстю 0,955 мкм. Проте щ!льшсть бюпл!вок за початково! к!лькост! кл!шн E. f. до 1 тис. на см2 площ! була в середньому в 1,5-2,1 раза (Р < 0,05) нижчою, пор!вняно з бюпл!вкою сформованою у вар!антах з початковою шльшстю кл!шн 2-10 тис. та 20-50 тис. на см2 площ1 стал1.
На рис. 2 наведено дан! щодо формування б!опл!в-ки Е. f. на поверхн! нержавшчо! стал! з шорстк^стю Ra= 0,63 мкм.
Рис. 2. Формування бюпл!вки Е. f. на нержавшчш стал! марки AISI 321 шорстшстю Ra = 0,63 мкм
при температур! 37 °С
На риа 2, виявлeнo cпoвiльнeння iнтeнcивнocтi фoрмyвaння бioплiвки на пoвeрxнi cтaлi з шoрcткicтю 0,63 мкм, пoрiвнянo з пoвeрxнeю iз шoрcткicтю 0,955 мкм. Пoчинaючи з 12 годин щ№нють бioплiвки y вaрiaнтax з пoчaткoвoю кiлькicтю клiтин E. f. 210 тиc. i 20-50 тиа на cм2 плoщi 6ули виcoкoï щ№ш-cтi, як на пoвeрxнi iз шoрcткicтю 0,955 мкм. ^o^c
фoрмyвaння мiкрoбниx бioплiвoк E. f. на пoвeрxнi з шoрcткicтю 0,63 мкм зaвeршyвaвcя на 24 год., в той жe 4ac, як за шoрcткocтi 0,955 мкм на 18 год. шкубацп.
На риc. 3 нaвeдeнo дaнi щoдo фoрмyвaння бioплiв-ки E. f. на пoвeрxнi cтaлi з шoрcткicтю 0,16 мкм.
Рис. 3. Фoрмyвaння бioплiвки E. f. на тержавточт cтaлi марки AISI 321 шoрcткicтю Ra = 0,16 мкм при
тeмпeрaтyрi 37 °С
Дaнi риа 3 вказують на тe, щo шoрcткocтi пoвeрxнi cтaлi 0,16 мкм ^o^c плiвкoyтвoрeння знaчнo cпoвiльнивcя, пoрiвнянo з пoвeрxнями, як1 мали шoрcткicть 0,955 та 0,63 мкм.
Чeрeз дeв'ять гoдин iнкyбaцiï E. f. на cram з шoрc-ткicтю 0,16 мкм бioплiвки були, в ceрeдньoмy в 1,11,7 раза (Р < 0,05) cлaбшoï щiльнocтi, пoрiвнянo з шoрcткicтю 0,955 мкм i, в 1,4 раза (Р < 0,05), пoрiвня-нo з шoрcткicтю 0,63 мкм нeзaлeжнo вiд пoчaткoвoï кiлькocтi E. f.
Прoтягoм 12 год. шкубацп E. f. у вaрiaнтi з шчат-кoвoю кiлькicтю дo 1 тиc. на cм2 плoщi бioплiвкa була cлaбкoï щiльнocтi, а у вaрiaнтax з пoчaткoвoю шлькю-тю 2-10 тиc. i 20-50 тиа на cм2 плoщi - ceрeдньoï та виcoкoï щiльнocтi - 0,917 i 1,025 oд. в^тав^та.
За 18 гoдин iнкyбaцiï бioплiвкa була ceрeдньoï щiльнocтi тiльки у вaрiaнтi з пoчaткoвoю кiлькicтю дo 1 тиc. E. f. на cм2 пoвeрxнi. За бiльшoï пoчaткoвoï кiлькocтi бaктeрiй вoнa була виcoкoï щiльнocтi. Тшь-ки чeрeз 24 год. шкубацп E. f. бioплiвки у вcix вaрiaн-тax були виш^ щiльнocтi.
Таким чинoм, мoжнa ввдзначити, щo на прoцec фoрмyвaння бioплiвoк E. f. на ^ржав^ч^ cтaлi марки AISI 321впливае шoрcткicть пoвeрxнi та пoчaткoвa кшькють бaктeрiй. Так, на плacтинкax з шoрcткicтю 0,16 мкм прoцec плiвкoyтвoрeння прoxoдить швшь-нiшe, пoрiвнянo з шoрcткicтю пoвeрxнi 0,955 та 0,63 мкм. У той жe 4ac згiднo дocлiджeнь (Kravcheniuk and Kukhtyn, 2017) вcтaнoвлeнo, щo за rax caмиx yмoв бioплiвкa E. coli мала мeншy щшь-нicть пoрiвнянo з E. f. на пoвeрxнi нeржaвiючoï cтaлi AISI 321. Ймoвiрнo, цe пoв'язaнo з тим, щo прoцec плiвкoyтвoрeння зaлeжить вiд рoзмiрiв бaктeрiй, вe-личина E. f. в два рази мeншa, шж E. coli, на нашу
думку цe дoзвoляe швидшe зaпoвнити западини шoрc-ткocтi i фoрмyвaти щшьшшу бioплiвкy на пoвeрxнi з мaлoю шoрcткicтю прoтягoм кoрoткoгo пeрioдy 4acy. Тoмy для пoпeрeджeння фoрмyвaння бioплiвoк виш-кoï щiльнocтi нeoбxiднo прoвoдити рeтeльнy caнiтaр-ну oбрoбкy пoвeрxнi тexнoлoгiчнoгo oблaднaння з мeтoю ж дoпycкaння вeликoï кiлькocтi бaктeрiй на ньoмy.
Висновки
Вcтaнoвлeнo, щo на raacramax з шoрcткicтю 0,16 мкм ^o^c плiвкoyтвoрeння E. f. прoxoдить гоэ-вiльнiшe, пoрiвнянo з шoрcткicтю пoвeрxнi 0,955 та 0,63 мкм. Чeрeз дeв'ять гoдин iнкyбaцiï E. f. на cram з шoрcткicтю 0,16 мкм бioплiвки були, в ceрeдньoмy в 1,1-1,7 раза (Р < 0,05) cлaбшoï щiльнocтi, пoрiвнянo з шoрcткicтю 0,955 мкм i, в 1,4 раза (Р < 0,05), пoрiвня-нo з шoрcткicтю 0,63 мкм нeзaлeжнo ввд пoчaткoвoï кiлькocтi E. f. На 12 годину бyлo виявлeнo imera™-ний ^o^c плiвкoyтвoрeння, на плacтинкax з шoрcт-кicтю 0,63 мкм та 0,955 мкм з пoчaткoвoю шлькютю клiтин E. f. вiд 2 дo 10 тиc. та 20-50 тиа/ш2 плoщi, бioплiвкa була вито^' щiльнocтi, а з шoрcткicтю 0,16 мкм - ceрeдньoï.
Перспективи подальших до^джень гоэлягають у дocлiджeннi впливу caнiтaрнoï oбрoбки мoлoчнoгo oблaднaння з рiзнoю шoрcткicтю пoвeрxнi на мiкрoб-нe зaбрyднeння.
References
Kukhtyn, M., Berhilevych, O., Kravcheniuk, K., Shynka-ruk, O., Horyuk, Y., & Semaniuk, N. (2017). For-
HayKOBHH bîchhk .nHYBME iMeHi C.3. iW^Koro, 2018, T 20, № 90
mation of biofilms on dairy equipment and the influence of disinfectants on them. Eastern-European Journal of Enterprise Technologies, 5, 11(89), 26-33. doi: 10.15587/1729-4061.2017.110488.
Bremer, P.J., Seale, B., Flint, S., & Palmer, J. (2009). Biofilms in dairy processing. Biofilms in the food and beverage industries. Oxford, Cambridge, New Delhi: Woodhead Publishing Limited, 396-431. doi: 10.1533/9781845697167.4.396.
Marchand, S., De Block, J., De Jonghe, V., Coorevits, A., Heyndrickx, M., & Herman, L. (2012). Biofilm Formation in Milk Production and Processing Environments; Influence on Milk Quality and Safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 11(2), 133-147. doi: 10.1111/j.1541-4337.2011.00183.x.
Perni, S., Callard Preedy, E., & Prokopovich, P., (2013). Succes and failure of colloidal approaches in adhesion
of microorganisms to surface. Advances in Colloid and Interface Science, 206, 265-274. doi: 10.1016/j.cis.2013.1L008.
Hcevar, M., Jenko, M., Godec, M., Drobne D. (2014). An overview of the influence of stainless-steel surface properties on bacterial adhesion. Materials and technology, 48(5), 609-617. http://mit.imt.si/Revija/ izvodi/mit145/hocevar.pdf.
Hygienic equipment design criteria (Guideline Document No. 8), Brussels: EHEDG 2004. ENEDG.
GOST 2789-73 (1973) Surface roughness. Parameters and characteristics. Moscow: GosStandard USSR, 6.
Kravcheniuk, K., & Kukhtyn, M., (2017). Biofilms formation on the stainless steel AISI 321 surface in terms of surface roughness and E.coli initial number. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(75), 144-148. doi: 10.15421/nvlvet7529.
