CC BY
211
УДК 628.33
О. Б. Иванченко, Р. Э. Хабибуллин, Х. Р. Хусаинова БИОТЕСТЫ В МОНИТОРИНГЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ
СТОЧНЫХ ВОД
Представлены результаты оценки токсикологических и генотоксических свойств сточных вод мясоперерабатывающих предприятий методами биотестирования с использованием органов разного уровня организации.
В настоящее время в системе контроля состояния природных сред и экосистем все более важную и самостоятельную роль занимает биотестирование. Традиционно биотестирование использовали для изучения токсичности отдельных химических веществ, однако в последнее время эти методы широко используются для оценки антропогенной нагрузки на природные комплексы: почвы, воды и т.д., а также при контроле безопасности сточных вод, подаваемых на очистные сооружения биологического типа, с целью предупреждения проникновения опасных веществ в биоценозы активного ила.
Суть этого метода заключается в определении действия токсикантов или сложных смесей на специально выбранные организмы в стандартных условиях с регистрацией различных поведенческих, физиологических или биохимических показателей.
Применение биотестирования имеет ряд преимуществ перед физико-химическим анализом, средствами которого часто не удается обнаружить неустойчивые соединения или количественно определить ультрамалые концентрации веществ. Довольно часто химический анализ, выполненный современными средствами, не показывает наличия токсикантов, тогда как реакции биологических тест-объектов свидетельствует об их присутствии в исследуемой среде. Биотестирование дает возможность быстрого получения интегральной оценки токсичности, что делает весьма привлекательным его применение при скрининговых исследованиях [1]. Однако, оценка токсичности далеко не в полной мере отражает опасные, особенно токсикогенетические, последствия загрязнения природных объектов, т.к известно, что наибольшую опасность для здоровья настоящего и будущих поколений представляют соединения, обладающие способностью вызывать отдаленные эффекты: мутагены и канцерогены. Показано, что рекомендуемое существующими нормативами определение токсичности не может заменить оценку генотоксичности в специальных тестах, поскольку между этими показателями не существует прямой корреляции. Поэтому изучение суммарной мутагенной активности представляет собой наиболее перспективный подход к выявлению реального мутагенного потенциала сточных вод [2].
Таким образом, представляется целесообразным комплексный анализ сточных вод в ряде тест-систем с целью изучения не только токсических свойств воды, но и обнаружения мутагенного потенциала. Наиболее приемлемыми инструментами изучения токсичности и мутагенной активности сточных вод являются методы с использованием природных организмов (микроорганизмов, растений, простейших и др.), которые позволяют в короткие сроки получить интегральную оценку воздействия на экосистемы [1].
Материалы и методы
В работе исследованы сточные воды Свияжского мясокомбината (Республика Татарстан), прошедшие локальную механическую очистку и отделение жира в жироловушке. Были изучены как нативная сточная вода, так и ее эфирная и водная фракции.
Эфирную фракцию получали экстракцией сточной воды диэтиловым эфиром в объемном соотношении 5:1, декантацией с последующим выпариванием эфирного слоя досуха и растворением твердого остатка в диметилсульфоксиде (ДМСО). После растворения остатка 1 мл ДМСО содержал экстракт из 5 мл нативной сточной воды.
Водная фракция представляла собой остаток нативной сточной воды после экстракции эфиром.
Стерилизация проб проводилась путем фильтрации через стерильные мембранные фильтры Synpor c диаметром пор 0,45 мкм.
Определение токсичности воды на культуре рачков Daphnia magna
Токсикологические исследования сточных вод мясокомбината проводили согласно руководящего документа РД-118-02-90 и "Методике определения токсичности воды по смертности и изменению плодовитости дафний" ПНДФТ 14. 1:2:3:4.3-99 [3].
Методика основана на определении смертности и изменений в плодовитости ветви-стоусых рачков Daphnia magna при воздействии токсических веществ, присутствующих в исследуемой воде, по сравнению с контролем [4]. Критерием острой токсичности служит гибель 50% и более дафний за 96 часов пребывания в исследуемой воде при условии, что в контроле гибель не превышает 10%. Для определения острой токсичности исследуемой воды рассчитывали процент погибших дафний (А,%) в тестируемой воде по сравнению с контролем после предварительного расчета процента выживших (Ai,%). Процент погибших дафний определяли по формуле:
А = Xk -Xt . 100,
Xk
где Хк - количество выживших дафний в контроле; Xt - количество выживших дафний в тестируемой воде.
При А < 10% считают, что тестируемая вода не оказывает острого токсического действия. Если А > 50% - тестируемая вода оказывает острое токсическое действие [5].
Определение токсичности по скорости прорастания семян растений
Исследование проводили согласно СанПиН 2.1.7.573-96 [6]. В качестве тест-объекта использовали семена редиса красного с белым кончиком и пшеницы сорта «Мироновская 808 среднеустойчивая». В качестве контроля использовали свежую родниковую воду. В опыте брали 50 штук семян. Повторность 4-5 кратная.
Определение содержания растворенного кислорода в воде проводили на оксиметре (HI 9143, Hanna Instruments).
Токсичность по отношению к микроорганизмам
Токсические свойства воды и ее составляющих определялись путем сравнения роста штаммов микроорганизмов на полноценной питательной среде как в присутствии исследуемых образцов (опытные варианты), так в их отсутствие (контрольный вариант).
Оценка мутагенного потенциала в тесте Эймса Saímoneíía/микросомы
В работе использовали ауксотрофный по гистидину тестерный штамм Salmonella typhimurium TA100 (his G46,rfa,uvr, bio, pKM101), регистрирующий мутации типа замены пар оснований. Эксперименты проводили согласно Maron and Ames [7,8] в модификации Фонштейна [9].
Если число колоний-ревертантов в опыте превышает спонтанный фон мутирования в 2.5-10 раз, это говорит о слабой мутагенной активности изучаемого соединения, если в 10-100 раз-то вещество обладает мутагенной активностью средней силы, если в 100 раз и более, то это соединение - сильный мутаген. В качестве позитивного контроля использовали раствор нитрозометилмочевины (5 мкг/мл).
Микросомную активирующую смесь (МАС) для метаболической активации in vitro готовили на основе лиофилизирован-ных микросомных фракций печени крыс, у которых система Р-450 была предварительно индуцирована фенобарбиталом. Микросомные фракции и тестерный штамм Salmonella typhimurium TA100 предоставлены Институтом экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь).
Определение свободного гистидина в образцах СВ методом тонкослойной хроматографии
Повышенное содержание гистидина в пробах может быть причиной ложноположи-тельных результатов в тесте Эймса. Доза гистидина, необходимая для удвоения ревертан-тов, равна 150 нмоль/чашку (232 мкг/мл) (Nylund L., Einisto P., 1992). Количество аминокислоты определяли методом тонкослой хроматографии (ТСХ) [10]. Минимальная обнаруживаемая этим методом концентрация гистидина составляет 7 мкг/мл.
Результаты и обсуждение
Сточные воды мясоперерабатывающих предприятий богаты органическими компонентами, что приводит к интенсивным процессам их микробного и химического окисления, сопряженных с потреблением растворенного в воде кислорода, поэтому вначале работы определяли содержание растворенного кислорода в нативных сточных водах и при их разведении [11,12]. Результаты определений представлены в таблице 1. Как видно из данных таблицы1, исследуемая сточная вода очень бедна растворенным кислородом. Разведение воды биологизированной водой приводило к ее обогащению растворенным кислородом. Для устранения возможного влияния флуктуации растворенного кислорода на результаты определения выживаемости дафний все дальнейшие исследования проводились после насыщения исследуемой воды кислородом воздуха.
Таблица 1 - Содержание растворенного кислорода в сточных водах при их разведении
Исследуемый объект Нативный сток Разведение сточной воды 1:1 1:2 1:3 Контроль
Концентрация О2, мг/л 0,1 1,6 2,2 4,5 7,5
Результаты исследования токсичности сточной воды на ветвистоусых рачках Daphnia magna представлены в таблице 2.
Нативный сток и его разведения 1:1, 1:2 и 1:3 уже через 24 ч вызывали полную гибель дафний. Для определения разведения стока, при котором наблюдается выживаемость дафний, воду разводили в 20, в 40, 60, 80 и 100 раз. Оказалось, что минимальное разведение, при котором сточная вода не оказывает острого токсического действия, составляет 1:100. При разведении 1:80 выявляется слабое токсическое действие, при разведениях 1:20, 1:40, 1:60 данная сточная вода оказывает острое токсическое действие (табл.2).
Результаты опытов оценки токсичности на семенах растений по скорости их прорастания представлены в таблице 3.
Таблица 2 - Определение острой токсичности сточных вод на Daphnia magna
Исследуемые образцы Количество погибших за 48 часов дафний, %
Контроль 0
Сток без разведения 100
Сток в разведении
1:1 100
1:2 100
1:3 100
1:20 99±1,0
1:40 92±2,3
1:60 50±3,2
1:80 20±5,0
1:100 0
Таблица 3 - Фитотоксичность сточных вод на семенах пшеницы и редиса
Объект Число проросших семян, %
исследования Пшеница Редис
Через 24 ч Через 48 ч Через 72 ч Через 24 ч Через 48 ч Через 72 ч
Контроль 97,0 97,0 98,0 96,0 98,0 100,0
Нативный сток 87,4 93,2 96,7 89,5 95,0 96,5
Разведение 1:1 94,7 96,7 96,7 91,1 96,5 96,5
Из приведенных данных видно, что исследуемая сточная вода заметно влияет на прорастание семян пшеницы и редиса лишь в первые сутки проведения опыта. Через 72 часа число проросших семян пшеницы и редиса в опытах с нативном стоком и со стоком в разведении 1:1 практически выравнивается. Ингибирование прорастания семян практически не выявляется и составляет 1,4% для пшеницы и 3,5% - для редиса. Статистическая обработка полученных результатов по критерию Стьюдента показала, что разница статистически недостоверна. Таким образом, сток нативный и в разведении 1:1 не проявил заметной фито-токсичности. Вместе с тем совершенно очевидно, что в сточной воде присутствуют вещества, способные ингибировать прорастание семян пшеницы и редиса в первые сутки воздействия.
Для изучения токсичности сточной воды в отношении микроорганизмов проводились исследования на бактериях Ecsherihia coli и Sarcina sp., имеющих различия в строении покровных клеточных структур, но являющихся естественными обитателями природных биоценозов. Принято считать, что угнетение роста микроорганизмов более чем на 50% является показателем токсичности, и такая сточная вода оказывает на биоценоз, в целом, не-
благоприятное воздействие. В опыте исследовали нативный сток, его эфирную и водную фракции. Результаты исследований представлены в таблице 4.
Таблица 4 - Токсичность стока на бактериях
Микроорганизмы Выживаемость, %
Контроль Нативный сток Эфирная фракция Водная фракция
Escherihia coli 100,0 92,0 95,2 90,0
Sarcina sp. 100,0 93,0 99,0 96,7
Из представленных результатов видно, что сточная вода мясоперерабатывающего комбината практически не влияет на выживаемость микроорганизмов, являющихся естественными обитателями природных биоценозов (р. Sarcina, E. соН). Водная фракция, оставшаяся после удаления из стока эфирной фракции, проявила практически те же токсические свойства, как и эфирная фракция и нативный сток. Вместе с тем, максимальный токсический эффект зарегистрированный в опыте, не превышает 10%.
Результаты экспериментов биотестирования на организмах разных уровней организации, свидетельствуют о различной реакции тест-объектов на комплекс соединений сточной воды. Более чувствительными явились ветвистоусые рачки Daphnia magna, клетки микроорганизмов и растений были толерантны к воздействию.
Оценка безопасности сточных вод в настоящее время не ограничивается оценкой их токсичности. Изучение суммарной мутагенной активности, характеризующей интегральное воздействие комплекса токсикантов на живые организмы, позволяет оценить возможность возникновения повреждений в молекуле ДНК. Вызванные изменения в геноме приводят к потере свойств клетками, в результате чего, вероятна смена популяций в биоценозе. Кроме того, сточные воды пищевых предприятий и мясоперерабатывающих, в частности, характеризуются высоким содержанием органического вещества, что позволяет их использовать как удобрение, а также они являются потенциальными источниками дешевых вторичных ресурсов - технического жира и белкового концентрата. Разработка таких технологий очистки и утилизации промышленных отходов немыслима без использования экспресс-методик оценки мутагенных характеристик отходов и сточных вод.
Методы тестирования мутагенного действия химических соединений с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов довольно широко распространены в мире. Это обусловлено тем, что микроорганизмы размножаются быстро, содержать их достаточно просто и дешево и в короткие сроки можно не только получить результат, но и предположить механизм действия [13,14]. Тест Эймса в настоящее время широко используется в большинстве лабораторий мира как один из основных методов в просеивающих программах. Исследование сточной воды и ее фракций в тесте Эймса не выявило ее мутагенной активности. Число колоний-ревертантов в опыте и контроле достоверно различаются менее чем в 2,5 раза. Результаты опыта представлены в таблице 5. Модификация теста Эймса с метаболической активацией in vitro используется для выявления генотоксического действия промутагенов, которые проявляют свой мутагенный эффект после биотрансформации в организме млекопитающих.
Таблица 5 - Мутагенная активность сточной воды в тесте Эймса Salmonella/микросомы на штамме ТА 100 с метаболической активацией in vitro и без метаболической активации
Вариант опыта Число колоний-ревертантов/чашку
-S9* Нативный сток 45,0 ± 1,5
Эфирная фракция 47,5 ± 1,5
Водная фракция 62,0 ± 4,0
Негативный контроль 42,5 ± 2,5
Позитивный контроль 150,0 ± 12,0
Нативный сток 10,5 ± 2,5
+S9* Эфирная фракция 4,5 ± 0,5
Водная фракция 10,5 ± 0,5
Негативный контроль 8,0 ± 2,0
Позитивный контроль 120,0 ± 9,0
* -S9 - опыты без метаболической активации; +S9 - опыты с метаболической активацией in vitro
Большинство химических мутагенов являются веществами, чужеродными для живых организмов (ксенобиотиками), и при проникновении в макроорганизм они претерпевают ряд превращений под влиянием ферментов - монооксигеназ смешанных функций, в результате чего могут образовываться реакционноспособные структуры, взаимодействующие с белками и нуклеиновыми кислотами [14]. Чтобы учесть этот процесс, в среду культивирования микроорганизмов, вносят микросомную фракцию (S9), полученную из клеток печени крыс
Метаболическая активация in vitro ферментами клеток печени крыс также не выявила мутагенной активности исследуемой сточной воды.
Методом тонкослойной хроматографии определено количество свободного гисти-дина в пробах сточной воды. Обнаруженная его концентрация - 75мкг/мл не влияет на результаты, полученные в тесте Эймса.
В настоящее время в странах СНГ и за рубежом широко проводятся подобные исследования, направленные на изучение мутагенной опасности стоков промышленных и пищевых предприятий в тест-системах разного уровня организации и практически обосновывающие необходимость введения дополнительного анализа генотоксичности в комплексную программу безопасности сточных вод и оценки природных комплексов [15,16,17,18,19,20]
В заключении необходимо отметить, что исследуемые сточные воды мясоперерабатывающего предприятия дефицитны по кислороду, а биотестирование на организмах разных уровней организации свидетельствуют о различной реакции тест-объектов на комплекс соединений, находящихся в водах. Более чувствительными явились ветвистоусые рачки Daphnia magna, клетки микроорганизмов и растений были толерантны к воздействию. На основании полученной разницы в токсичностях в отношении различных представителей природных биоценозов непосредственный сброс в природные водоемы представляется затруднительным, а более предпочтительным является их использование для орошения почв сельскохозяйственного назначения. Результаты исследований показали, что
анализируемые сточные воды не обладают мутагенной активностью в тесте Эймса, как в условиях метаболической активации, так и без нее.
Таким образом, используемые в работе биотесты, включающие представителей различных трофических уровней, позволили в короткий срок всесторонне оценить безопасность исследованных сточных вод мясоперерабатывающего предприятия при выборе способа их отвода и утилизации и могут быть рекомендованы в качестве тест-систем в мониторинге экологической безопасности сточных вод.
Литература
1. Дятлов С.Е. Роль и место биотестирования в комплексном мониторинге морской среды // Экология моря. 2000. № 5. С. 83-87
2. (Saffiotti V. Evolution of mixed exposure to carcinogens and correlation of in vivo and in vitro sys-tems//Environm.Health Perspect. 1983. V.47. P.319-324
3. Методическое руководство по биотестированию воды РД-118-02-90. М., 1991.48с.
4. Исакова Е. Ф., Колосова Л. В. проведение токсикологических исследований на дафниях. В сб.:методы биотестирования качества водной среды. М.: Изд. МГУ, 1989.С.51-62.
5. Крайнюкова А.Н. Биотестирование в охране вод от загрязнения // Методы биотестирования вод. Черноголовка: Мир, 1988. С. 4-14.
6. СанПиН 2.1.7.573 - 96 «Гигиенические требования к использованию сточных вод и их осадков для орошения и удобрения» (2.1.7.Почва, очистка населенных мест, бытовые промышленные отходы, санитарная охрана почвы). М., 1997. 36с.
7. Maron DM., AmesB.N. Revised metods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. 1983. № 113. Р. 174- 210
8. Nylund L., Einisto P. Mutagenicity testing of protein-containing and biological samples using the Ames/Salmonella plate incorporation test and the fluctuation test // Mutat. Res. 1992 V. 272. № 3. P. 205-214.
9. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Метод. указания/Сост.: Л.М. Фонштейн, С.К. Абилев, Е.В. Бобринев и др. М., 1985. 34 с.
10. КирхнерЮ. Тонкослойная хроматография. М.:Мир, 1981. Т. 1. 482 с.
11. Caixeta CE, Cammarota MC, Xavier AM. Slaughterhouse wastewater treatment: evaluation of a new three-phase separation system in a UASB reactor // Bioresour Technol. 2002. V.81. №.1. Р.61-69.
12. Thayalakumaran N, Bhamidimarri R, Bickers P.O. Biological nutrient removal from meat processing wastewater using a sequencing batch reactor // Water Sci. Tecnol. 2003. V.47. №.10. P.101-108.
13. Quillardet P. and Hofnung M. The SOS-chromotest, a colorimetric bacterial assay for genotoxins: procedures // Mutat. Research. 1985. V. 147. P. 65-78.
14. Абилев С., Порошенко Г. Ускоренные методы прогнозирования мутагенных и бластомогенных свойств химических соединений / Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. «Токсикология». 1986. Т. 14. 171 с.
15. Мишин В.М., Ляхович В.В. Множественные формы цитохрома Р-450. М.:Наука, 1985.180с.
16. Tang F. Study on mutagenicity and identification of organic pollutants in wastewater of industrial area/ F. Tang, Z. Huang, D.Q. Ouyand// J Tongji Med Univ. 1991. 187 p.
17. Abe A., Urano K. Influence of chemicals commonly found in a water environment on the Salmonella mutagenicity test// Sci Tjtal Environ. 1994. 169 p.
18. Nielsen M.H., Rank J. Screening of toxicity and genotoxicity in wastewater by the use of the Allium test // Hereditas. 1994. 121 p.
19. Гольд З.Г. Оценка токсичности природных вод пруда Бугач по биотестам/ З.Г. Гольд, Л.А. Глу-щенко, И.И. Морозова, И.А. Шадрин// Токсикологический вестник. 2000. № 5. С. 28-33.
20. Авчинников А. В. Оценка мутагенной активности питьевой воды, кондиционированной по электроимпульсной технологии/ А. В. Авчинников, В. С. Журков, Р.И. Михайлова// Токсикологический вестник. 2001. № 2. С. 7-9.
© О. Б. Иванченко - канд. биол. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КГТУ; Р. Э. Хабибуллин -канд. техн. наук, доц. технологии пищевых производств КГТУ; Х. Р. Хусаинова - асс. той же кафедры.
