CC BY
82
Известия Тульского государственного университета Серия Естественные науки 2008. Выпуск 1. С. 169-176
ХИМИЯ
V. I К 543.9:663:664
Л.Д. Асулян, И.Н. Старкова, Н.М. Филатова, А.Н. Решетилов
Тульский государственный университет,
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, Пущино
БИОСЕНСОРЫ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПИРТОВ НА ОСНОВЕ ДРОЖЖЕЙ PICHIA AN GUS ТА И HANSENULA POLYMORPHIA, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРИОГЕЛЬ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА
Аннотация. Разработан способ получения стабильных рецепторных элементов биосенсоров иммобилизацией дрожжей Pichia angusta ВКМ Y-2518 и Hansenula polymorphia NCYC 495 ln в криогель поливинилового спирта. Исследованы основные характеристики биосенсоров с полученными рецепторными элементами: селективность, операционная и долговременная стабильности, минимальный предел обнаружения и экспрессность определения.
Введение. Проблема мониторинга содержания этилового и метилового спиртов в разных производствах относится к важным практическим задачам. Значительная их часть может быть решена с помощью биосенсоров
- анализаторов, позволяющих осуществлять быструю детекцию биологически активных соединений в пробе [1]. Принцип биосенсорной детекции основан на том, что биоматериал, закрепленный на физическом датчике, при взаимодействии с определяемыми соединениями генерирует зависимый от концентрации этих соединений сигнал, который регистрируется преобразователем и после обработки данных представляется в численном виде. Основой микробных биосенсоров являются иммобилизованные клетки микроорганизмов или дрожжи. Иммобилизованные микроорганизмы широко применяются в настоящее время в качестве биокатализаторов в различных биотехнологических процессах [2], однако сведения о включении клеток микроорганизмов в тонкие пленки для создания рецепторных элементов биосенсорных систем носят несистематизированный характер.
Целью данной работы явилось создание стабильных биорецепторных элементов биосенсоров иммобилизацией модифицированных дрожжей Pichia
© Асулян Л.Д., Старкова И.Н., Филатова Н.М., Решетилов А.Н., 2008
angusta ВКМ Y-2518 и Hansenula polymorphia NCYC 495 In для экспресс-определения низших спиртов и изучение основных характеристик биосенсоров на основе полученных рецепторных элементов: селективности, операционной и долговременной стабильности, чувствительности, минимального предела обнаружения определяемого субстрата. В качестве носителя для иммобилизации клеток использовали криогель из поливинилового спирта (ПВС).
Экспериментальная часть. Исследования проводили на биосепсорной
установке, основными элементами которой являются потенциостат IPC 2L, используемый в качестве преобразователя для измерения содержания молекулярного кислорода (фирма «Кронас», Россия), и электрод Кларка (рабочий потенциал -700 мВ).
Между полупроницаемой мембраной электрода и защитным колпачком помещался рецепторный элемент с иммобилизованными микроорганизмами, закрепленный капроновой сеткой. Модифицированные дрожжи Pichia angusta ВКМ Y-2518 и Hansenula polymorphia NCYC 495 In предоставлены лабораторией биосенсоров Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Модификацию проводили методом глубинного культивирования штаммов в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, фосфора и минеральные соли с индукцией метанолом.
При измерениях электрод Кларка с рецепторным элементом погружали в кювету объёмом 5 мл, заполненную 4 мл 0,02 М Na-К-фосфатного буферного раствора (pH = 7). Кювета находилась на магнитной мешалке, и все эксперименты проводились при постоянном перемешивании (200об/мин), между измерениями проводилось промывание кюветы и электрода раствором буфера. Добавление растворов субстратов производили автоматическими пипетками с варьированным объемом (5-50 мкл, 50-200мкл, 200-1000 мкл, 1-5 мл). Данные потенциостата обрабатывались на ЭВМ с помощью программы IPC 2000. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов (нА/мин). Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью компьютерных программ MS Excel 2003 и Sigma Plot 9.
Иммобилизация микроорганизмов в криогель ПВС. Для получения криогеля использовали 20% водный раствор поливинилового спирта, приготовленный растворением ПВС (молекулярная масса 100 000 -110 000 а.е.м.), при температуре 00 С и постоянном перемешивании. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры, отбирали необходимое количество микропипеткой и добавляли в него дрожжи Pichia angusta или Hansenula polymorphia (50 мкл биомассы на 500 мкл раствора 20% ПВС). Полученную
смесь переносили на предметное стекло и ставили в морозильную камеру (t = -25 ° С) на 24 часа. Размораживание происходило при температуре 20 С. Затем криогель разрезали на одинаковые части размером 3x3 мм, помещали в 20 мМ Na - К - фосфатный буферный раствор (pH = 7) и ставили в холодильник. Содержание дрожжевой биомассы в одном рецепторном элементе
- 0,2-0,3 мг для Pichia augusta и 1,6-2,0 мг дляHansenula polymorphia.
Результаты и обсуждение. Метилотрофные дрожжи родов Pichia nHansenula обладают ферментативной системой (алкогольоксидазой), окисляющей низшие первичные спирты (метанол, этанол) с потреблением молекулярного кислорода в пропорциональном количестве [3, 4]. Это свойство метилотрофов используется в создании биосенсоров для определения алкоголя с кислородным электродом в качестве преобразователя. Для создания стабильных рецепторных элементов сенсоров дрожжевую биомассу иммобилизуют на подходящем носителе.
Полимер-гелеобразователь поливиниловый спирт может быть использован в качестве матрицы для иммобилизации, так как химически и микробиологически стабилен, нетоксичен и биосовместим. Ранее были получены рецепторные элементы иммобилизацией клеток бактерий Gluconobacter Oxydans sbsp. industrius В-1280 с использованием в качестве носителя криогеля ПВС [5]. Сенсоры на основе таких рецепторных элементов показали хорошие аналитические характеристики при определении углеводов и спиртов.
Для получения рецепторных элементов, содержащих дрожжи, к 20%-ному раствору ПВС добавляли определенное количество биомассы и замораживали полученную смесь при t = -25 ° С. При размораживании получали устойчивый гель, из которого вырезали рецепторные элементы определенного размера, закрепляли их на кислородном электроде и исследовали свойства полученного биосенсора.
Оценка субстратной специфичности иммобилизованных микроорганизмов была проведена по таким субстратам, как низшие спирты, глицерин, глюкоза. Для проведения эксперимента использовались растворы субстратов одинаковой концентрации (0,1 моль/дм3), за 100% принимался ответ биосенсора на метанол. Результаты представлены на рис. 1 и 2.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что дрожжи Pichia augusta и Hansenula polymorphia наиболее чувствительны к низшим спиртам, причем, клетки Pichia augusta обладают особенно высокой специфичностью по отношению к метанолу.
Аналитические и метрологические характеристики биорецепторных элементов и биосенсоров на основе исследуемых микроорганизмов приведены в таблице 1.
i'J-;
Рис. 1. Субстратная специфичность дрожжей Pichia augusta, иммобилизованных в криогель ПВС
Рис. 2. Субстратная специфичность дрожжей Hansenula polymorphia, иммобилизованных в криогель ПВС
Для оценки операционной стабильности рецепторных элементов на основе микроорганизмов Pichia augusta и Hansenula polymorphia, иммобилизованных в криогель ПВС, было проведено по 10 последовательных измерений ответов биосенсоров на 20 мкл 1М растворов этанола и метанола (концентрация в кювете - 5 мМ) с интервалом в 10 минут. Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что результаты, полученные с помощью биосенсора на основе дрожжей Pichia augusta, иммобилизованных в криогель ПВС, обладают лучшей сходимостью при определении метанола по сравнению с этанолом (относительное стандартное отклонение 1,6 и 6,9%, соответственно), а биосенсор, содержащий Hansenula polymorphia дает обратный результат (9,5% для метанола и 4,1% - для этанола).
Долговременную стабильность работы биосенсоров с полученными био-рецепторными элементами определяли путём ежедневного измерения величины ответа биосенсора на одну и ту же концентрацию растворов этанола и метанола. Концентрация субстрата выбиралась таким образом, чтобы ответ биосенсора на неё составлял половину максимального ответа на линейном участке калибровочной зависимости. За 100% принимается ответ биосенсора на первый день измерений. Во всех полученных биорецепторных элементах в первый день после формирования дрожжи имеют невысокую активность, которая возрастает на второй день работы сенсора. Это можно объяснить адаптацией микроорганизмов к изменившимся условиям внешней среды. Затем активность заметно снижается. Это связано с тем, что плохо закрепленный в матрице биоматериал вымывается, а оставшийся потом уже дает относительно стабильный отклик. На пятый день функционирования биорецептора стабилизируется дыхательная активность иммобилизованных
Таблица 1
Характеристики биорецепторных элементов и биосенсоров на их основе
Характеристика Значение параметра Pichia angusta Hansenula polymorphia
метанол этанол метанол этанол
Операционная стабильность Относительное стандартное отклонение по 10 измерениям, % 1,6 6,9 9,5 4,1
Долговременная стабильность Время стабильной работы биосенсора, суток 40 40 30 30
Чувствительность Тангенс угла наклона линейного участка зависимости ответа сенсора от концентраций субстратов в кювете, нА-дм3/(с • моль) 3106 280 2755 1000
Предел обнаружения Наименьшая концентрация, на которую дает сигнал, отличимый от значения холостого опыта, моль/дм3 0,7-10“е 0,8-10“ь 0,16-10“е 0,45-10“е
Экспрессность Время развития ответа, мин 2-3 2-3 2-3 2-3
Время восстановления активности рецепторного элемента, мин 5-7 5-7 5-7 5-7
Длительность одиночного измерения, мин 7-10 7-10 7-10 7-10
Линейный диапазон зависимо- 0,5-10“е- 2,5-10“е- 2,5-10“е- 0,5-10“е-
сти ответа бисенсора от концентраций субстратов в кювете, моль / дм3 0,5-10“5 1,3-10“5 1,3-10“5 1,0-10“5
микроорганизмов, уровень которой сохраняется на протяжении нескольких дней (стандартное отклонение не превышает 15%). Как было установлено, созданные биорецепторные элементы обладают весьма высокой долговременной стабильностью (от 30 до 40 дней). Этот же метод иммобилизации бактерий Gluconobacter Oxydans дает более низкие результаты [5].
Как правило, выбор наиболее подходящего рецепторного элемента для каждого анализа проводят на основе анализа градуировочных зависимостей ответа сенсора от концентрации определяемого компонента. Градуировочные зависимости ответов сенсоров на основе биорецепторных элементов, полученных иммобилизацией дрожжей Pichia augusta и Hauseuula polymorphia в криогель ПВС, от концентраций определяемых субстратов приведены на рис. 3-6.
S
3
Концентрация этанола в кювете, ммоль/дм
Концентрация метанола в кювете ммоль/дм
Рис. 3. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе дрожжей Pichia augusta, иммобилизованных в криогель ПВС, от концентрации этанола в кювете
Рис. 4. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе дрожжей Pichia augusta, иммобилизованных в криогель ПВС, от концентрации метанола в кювете
Для анализа контрольных смесей, содержащих этанол и метанол, использовали линейные участки градуировочных зависимостей (линейные диапазоны зависимости ответа бисенсора от концентраций субстратов в кювете приведены в таблице 1).
С помощью биосенсора на основе дрожжей РжЫа аидг^а были проанализированы контрольные смеси, содержащие этанол и метанол, с использованием полученных градуировочных зависимостей. Результаты приведены в таблице 2, из которой видно, что с помощью биосенсора с рецепторным
I
г
3
Концентрация метанола в кювете, мМоль/дм
Концентрация этанола в кювете, ммоль/дм
Рис. 5. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе дрожжей Напзепиіа роїутог-рЫа, иммобилизованных в криогель ПВС, от концентрации метанола в кювете
Рис. 6. Градуировочная зависимость ответа сенсора на основе дрожжей Напзепиіа роїутог-рЫа, иммобилизованных в криогель ПВС, от концентрации этанола в кювете
элементом, содержащим клетки Pichia augusta, иммобилизованные в криогель ПВС, можно с достаточно высокой точностью определять метанол при содержании его в пробе от 0,001 до О.ООбмМ, в то время как известно, что иммобилизованная алкогольоксидаза практически не окисляет метанол [6].
Таблица 2
Результаты анализа стандартных растворов спиртов
№ п/п Систинная ■> ммоль/ ДМ3 метанол этанол Сполученная ■> ммоль/ ДМ3 метанол этанол Ошибка относительная, % метанол этанол
1 0,0011 0,0012±0,0001 8,33
0,0040 0,0061±0,0003 33,71
2 0,0025 0,0028±0,0002 12,00
0,0050 0,0072±0,0005 40,72
3 0,0059 0,0069±0,0004 38,00
0,0090 0,0120±0,0010 42,60
Полученные градуировочные зависимости были использованы также для определения чувствительности (таблица 1). Как видно из приведенных в таблице данных, полученные биосенсоры обладают более высокой чувствительностью по отношению к метанолу по сравнению с этанолом. Высокие
значения коэффициента чувствительности исследуемых биосенсоров позволяют определять низкие концентрации субстратов .Предел обнаружения этанола и метанола биосенсором с иммобилизованными дрожжами Pichia augusta составил 0,8-10"“5 и 0,7-10"“6 моль/дм3, соответственно, и с Hansenula polymorphia - 0,45-10”“6 и 0,16-10-6моль/дм3, соответственно. Известно, что пдк метанола 0,156-10 6моль/л. Полученные результаты свидетельствуют о том, что с помощью биосенсора на основе микроорганизмов Pichia augusta и Hansenula polymorphia, иммобилизованных в криогель ПВС, содержание метанола можно контролировать на уровне ПДК.
Выводы.
Найдены приемлемые условия иммобилизации дрожжей Pichia augusta и Hansenula polymorphia в криогель ПВС для получения стабильных биоре-цепторных элементов биосенсоров.
Получены биосенсорные устройства на основе иммобилизованных дрожжей Pichia augusta и Hansenula polymorphia, обладающие хорошей операционной и долговременной стабильностью, а также высокой чувствительностью и низким пределом обнаружения метанола и этанола.
На основании проведенных исследований, биосенсор с рецепторным элементом, полученным иммобилизацией дрожжей Pichia augusta и Hansenula polymorphia в криогель ПВС, может быть рекомендован для экспресс-определения метанола на уровне ПДК.
Библиографический список
1. Биосенсоры: основы и приложения: Пер. с англ./ Под ред. Э.Тернера, И. Краубе, Дж. Уилсона. - М.: Мир, 1992. - 616с.
2. Иммобилизованные клетки микроорганизмов/ Синицын А.П. [и др.]- М.: Изд-во МГУ, 1994. - 288с.
3. Грузман М.Б. Множественные молекулярные формы алкогольоксидазы метило-трофных дрожжей Pichia methanolica / М.Б. Грузман [и др.]. // Биохимия. -1996. -Т. 61. -№ 12. -С. 2131-2139.
4. Bystrykh L. V. Alcohol oxidase of methylotrophic thermo- and acidotolant yeast Hansenula sp. / L.V. Bystrykh, J. Dvorakova, O. Volfova. // Folia Microbol. -1989. -V. 34. -№ 1. -P. 233-2370.
5. Арляпов В.А. Иммобилизация клеток Gluconobacter Oxydans для создания стабильных рецепторных элементов биосенсоров / В.А. Арляпов [и др.]. // Известия ТулГУ. Серия «Химия». Вып. 6 - Тула: Изд-во ТулГУ. - 2006.- С. 137-144.
6. de Maria C.G. Selective flow-injection determination of methanol using immobilized enzyme reactors / C.G. de Maria, T. Manzano, R. Duarte et al. // Analytica Chimica Acta. -1995. -V. 309. -№ 1-3. -P. 241-250.
Поступило 08.02.2008
