CC BY
75
УДК 615.28:582.682:616.9-089
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И ИХ РЕГУЛЯЦИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ СРЕДСТВАМИ © Фролова А.В., Окулич В.К.
Витебский государственный медицинский университет, Беларусь, 210023, Витебск, ул. Фрунзе, 27
Резюме: Изучены биологические свойства и чувствительность к антибиотикам и растительным лекарственным средствам у возбудителей гнойно-воспалительных процессов в оториноларингологии. Определены степень выраженности патогенного и персистентного потенциала микроорганизмов в зависимости от характера и течения раневого процесса.
Установлено, что затяжной характер хронического гнойно-воспалительного процесса обусловлен высокой адгезивной и антилизоцимной активностью микрофлоры. Выявлена корреляционная связь антибиотикорезистентности стафилококков с уровнем экспрессии антилизоцимной активности (г=0,85, р<0,01). Обоснована целесообразность использования лекарственных растительных средств в качестве перспективных антимикробных агентов в борьбе с полирезистентными к антибиотикам возбудителями раневой инфекции. Показана способность фитопрепаратов проявлять модифицирующую активность в отношении персистентного потенциала микроорганизмов.
Ключевыге слова: возбудители, биологические свойства, антибиотикорезистентность, растительные средства
BIOLOGICAL PROPERTIES OF CAUSERS OF PURULENT-INFLAMMATORY PROCESSES AND THEIR REGULATION BY HERBAL REMEDIES Frolova A.V., Okulich V.K.
Vitebsk State Medical University, Belarus, 210023, Vitebsk, Frunze St., 27
Summary: The biological properties and sensitivity of the causers of purulent-inflammatory processes in otorhinolaryngology to antibiotics and to herbal medicinal remedies has been studied. The exponential expression of pathogenic and persistent potential of microorganisms depending on character and currents of wound process were defined.
It was found that the lingering nature of chronic purulent-inflammatory processes due to the high adhesive and anti-lysozyme activity of the microflora. Correlation of antimicrobial resistance of Staphylococci with the expression level of anti-lysozyme activity was identified (r=0.85, p<0,01). The expediency of the use of medicinal herbal remedies as a promising antimicrobial agents in the fight against multidrug-resistant pathogens of wound infection was justified. The ability of herbal remedies be modifying activity against persistent potential of microorganisms was shown.
Key words: pathogens, biological properties, antimicrobial resistance, herbal remedies
Введение
На сегодняшний день антибиотикорезистентность микроорганизмов, способствующая увеличению числа гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений различной локализации, тяжело протекающих и не поддающихся традиционному лечению, определена Всемирной организацией здоровья как глобальная проблема, требующая незамедлительного и кардинального решения. Селекция полирезистентных инфекций вызвана, прежде всего нерациональным использованием антибиотиков и антисептиков [7, 12, 14]. Почти 75% противомикробных средств назначается необоснованно (при отсутствии показаний к их применению или недостаточности доз), что влечет за собой формирование госпитальных штаммов и неоправданные финансовые потери. Помимо «неадекватного» использования антибиотиков
исследователями отмечается довольное частое назначение средств, уже ставших привычными и в значительной степени потерявших свою эффективность [2, 13].
С конца XX в. на научных конференциях и национальных конгрессах все острее стали подниматься вопросы об ускорении исследований в области создания новых лекарственных препаратов из растительного сырья с антимикробным, фунгицидным и противовирусным эффектами, что объясняется и значительными финансовыми расходами на разработку и внедрение антибиотиков. Включение фитофармакологии в комплекс лечебных мероприятий становится не только патогенетически оправданным, особенно при хронических процессах, но и экономически выгодным [4, 21, 22].
Цель исследования - изучить биологические свойства возбудителей гнойно-воспалительных процессов и обосновать целесообразность использования лекарственных растительных средств в качестве перспективных антимикробных агентов.
Методика
Определение продукции протеина А стафилококком
Способность стафилококка продуцировать белок А определяли с помощью иммуноферментного метода последовательного насыщения, используя модификацию H. Fey (1981) [11]. С целью сенсибилизации планшета для иммуноферментного анализа в каждую лунку, за исключением контрольной, вносили по 0,2 мл раствора, содержащего 5 мкл/мл иммуноглобулинов человека на 0,01 М Na-карбонатном буфере с pH=9,6 и выдерживали в холодильнике при t=4°C от 3 до 12 ч. После инкубации планшеты четырехкратно отмывали 0,01 М фосфатным буфером с pH=7,4, содержащим 0,05% раствор детергента ТВИН-20 (ТБФ) и подсушивали на фильтровальной бумаге.
При определении протеина А, связанного с клеточной стенкой, суточную бульонную культуру стафилококка обрабатывали ультразвуком или лизостафином. На ТБФ, содержащем 1% раствор бычьего альбумина (ТБФ-БСА), из полученного материала готовили разведения от 1:2 до 1:16, которые вносили в лунки планшета в дублях. Параллельно также в дублях в ряд лунок вносили по 0,1 мл белка А, очищенного методом аффинной хроматографии, в количестве 50 нг, 20 нг, 15 нг, 12,5 нг, 10 нг, 8 нг, 6 нг, 5 нг, 3 нг. Дополнительно в качестве отрицательного контроля использовали 2 лунки с ТБФ-БСА, в одну лунку вносили стерильный буфер, на котором готовилися исследуемые культуры. После инкубации в термостате при t = 37°С в течение 40 мин., содержимое планшета отмывали трехкратно ТБФ и высушивали. В каждую лунку, за исключением первой лунки в первом ряду, с помощью которой выводят прибор на «0», добавляли по 0,09 мл белка А, меченного пероксидазой хрена, в рабочем разведении на ТБФ-БСА, планшет инкубировали при t = 37°С в течение 40 мин. После промывания и высушивания, как описано выше, в каждую лунку вносили по 0,09 мл раствора, содержащего 5 мг орто-фенилендиамина, приготовленного на 13 мл цитратно-фосфатного буферного раствора с содержанием 0,15% раствора перекиси водорода. Планшеты закрывали, в защищенном от света месте выдерживали при комнатной температуре в течение 15 мин. Затем добавляли 10 мкл серной кислоты фирмы «Roche» или 1,8 н ее раствора, приготовленного из концентрированной кислоты. Результаты учитывали на мультискане АИФ-Ц-01С при X=492 нм.
Для дальнейших расчетов строится график с наибольшей степенью корреляции между содержанием протеина А и оптической плотностью. Содержание белка А приводили к стандартному значению по формуле: F = A х 10 / K, где А - среднее значение протеина А, х10 для пересчета на 1 мл бульона, К - коэффициент для приведения оптической плотности бульона к стандарту, что на спектрофотометре соответствует 0,2 при X = 600 нм (приблизительно 200 млн. частиц для стафилококка). Полученное значение отражает содержание протеина А в 1 мл стандартной взвеси стафилококка.
Приготовление свободного клеточного лизата для определения связанного с клеточной стенкой протеина А стафилококка
Белок из клеточной стенки получали по методике, предложенной A. Warnes et al. в 1986 г. в модификации [11]. Клеточную культуру стафилококка после центрифугирования в течение 10
мин. при 2000 об/мин и удаления супернатанта однократно отмывали стерильным физиологическим раствором натрия хлорида, приводили к стандарту оптической мутности и вновь центрифугировали с удалением надосадка. Осадок ресуспендировали в 1 мл 0,05 М раствора Tris-HCl при pH =8,0, содержащем 25% сахарозы. Затем добавляли 0,15 мл раствора лизостафина, приготовленного из расчета 200 мкг/мл в стерильной дистиллированной воде, и инкубировали в течение 20 мин. при t=37°C, вносили в лизат 1 мл 0,25 М раствора ЕДТА с pH = 8,0 и оставляли на льду в течение 5 мин. После этого быстро добавляли 1,5 мл 1% раствора Triton Х-100, 0,04% раствор дезоксихолата натрия в 0,01 М растворе ЕДТА и оставляли на льду до 30 мин. для прекращения лизиса. Полученный лизат центрифугировали в течение 20 мин. при 3000 об/мин., надосадочную жидкость забирали, хранили при t = 4°C и через 10 дней использовали в ИФА свободный клеточный гидролизат.
Протеин А получали также путем разрушения взвеси стафилококка, приготовленной на 3 мл 0,05 М Tris-HCl с pH=8,0, содержащем 25% сахарозы. Обработку проводили на ультразвуковом приборе и хранили в жидком азоте до использования.
Определение адгезивных свойств возбудителей по методу В.И. Брилиса с соавт. (1986)
Готовили взвесь 109 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл суточной культуры исследуемого микроорганизма на фосфатном буфере. Состав буфера (г/л): натрий фосфорно-кислый 8,01, калий фосфорно-кислый двузамещенный 1,78 (pH=7,2). Сначала свежие эритроциты человека 0 (I) группы Rh (+) трижды отмывали приготовленным 0,1 М раствором фосфатного буфера путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин. Потом к отмытым эритроцитам прибавляли 50% нейтральный формалин и инкубировали смесь в термостате при t = 37°С в течение 2 ч. После этого эритроциты вновь трижды отмывали приготовленным 0,1 М раствором фосфатного буфера путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 10 мин. Полученные эритроциты сохраняют при t=4°C в виде суспензии 108/мл в растворе фосфатного буфера.
В пробирки вносили по 0,5 мл суспензии исследуемого микроорганизма 109К0Е/мл, 0,5 мл формализованных эритроцитов 108/мл. При определении способности антимикробного средства влиять на адгезивную активность возбудителей в пробирки вносили по 0,5 мл взвеси суточной культуры исследуемого микроорганизма 109КОЕ/мл, 0,5 мл формализованных эритроцитов 10 /мл, 0,1 мл антимикробного средства в соответствующей концентрации. В контрольные пробирки вместо антимикробного средства вносили 0,1 мл раствора фосфатного буфера.
Полученные смеси в обеих случаях инкубировали в термостате при t=37°C, периодически взбалтывая. После этого готовили мазки, высушивали, фиксировали метиловым спиртом, окрашивали по Романовскому-Гимзе. Под световым микроскопом в приготовленных мазках оценивали адгезивную способность микроорганизмов с помощью коэффициента их участия в процессе (К) и по среднему показателю адгезии (СПА) - среднему числу микроорганизмов, адгезировавших на одном эритроците, при подсчете не менее, чем на 25 эритроцитах. Адгезивность считали нулевой при СПА от 0 до 1,0, низкой - от 1,01 до 2,0, средней - от 2,1 до 4,0, высокой - свыше 4,0.
Определение антилизоцимной активности возбудителей [3]
Бактериальную массу исследуемой культуры стандартной бактериологической петлей засевали в 3 мл мясо-пептонного бульона и инкубировали при t=37oC в течение 24 ч. На спектрофотометре СФ-46 при ^=540 нм измеряют оптическую плотность бульонной культуры против питательного бульона (Y). Супернатант отделяли от бактериальных клеток центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин.
В качестве тест-культуры использовали суточную агаровую культуру Micrococcus lysodeikticus (штамм №2665 ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Выросшие бактериальные клетки тест-культуры убивали хлороформом в течение 60 мин., смывали, профильтровывали через крупнопористый фильтр, дважды отмывали 1/15 М фосфатным буфером с динатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилоном Б) (0,372 г/л буфера) и один раз - 1/15 М фосфатным буфером, после чего оптическую плотность суспензии микрококка доводят до 0,300. На 1/15 М фосфатном буфере готовили раствор лизоцима с концентрацией 20 мкг/мл.
0,9 мл супернатанта исследуемой культуры микроорганизма смешивали с 0,1 мл приготовленного раствора лизоцима и инкубировали при t=37oC в течение 60 мин. Затем 0,5 мл смеси супернатанта и лизоцима добавляли к 2,0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и измеряют оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 сек. на спектрофотометре СФ-46 при ^=540 нм против 1/15 М фосфатного буфера.
В контроле смесь питательного бульона с лизоцимом в соотношении 9:1 добавляли к 2,0 мл суспензии тест-культуры Micrococcus lysodeikticus и измеряют оптическую плотность полученной смеси через 30 и 150 сек. на спектрофотометре СФ-46 при ^=540 нм против 1/15 М фосфатного буфера.
Антилизог"шн"ю активность исследуемой культуры рассчитывали по формуле: A=100x(l-^D0/^Dk), где А - антилизоцимная активность, мкг ина"тивированного лизоцима /мл супернатанта *ед. оптической плотности бульонной культуры; - изменение опти1"хкой плотности суспензии тест-культуры в опыте между 30 и 150 с [D0(30") - D0(150")]; -изменение оптической плотности суспензии тест-культуры в контроле между 30 и 150 с [Вк(30'') -DK(150")].
Определение модифицирующей способности антимикробных средства в отношении антилюоцимной активности возбудителей
Готовили суточную культуру исследуемого штамма микроорганизма, затем смесь из 1 части исследуемого растительного извлечения в суббактерицидной концентрации и 3 частей суточного бульона инкубировали в термостате при t=37°C в течение 1 ч. Надосадочную жидкость отделяли от клеток путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 мин. и определяли в ней антилизоцимную активность возбудителей. Затем надосадочную жидкость пересевали на мясо-пептонный агар, инкубировали при t=37°C в течение 16-18 ч. и определяли антилизоцимную активность возбудителей. В качестве контроля вместо исследуемых растительных экстрактов использовали изотонический раствор хлорида натрия. При изменении персистентного признака возбудителя на 20% и более в сравнении с контролем, считали, что извлечению присуща модифицирующая способность.
Результаты исследования и их обсуждение
Литературные данные и собственные исследования подтверждают, что характер и течение раневого процесса определяли видовой состав и биологические свойства возбудителей инфекции, в частности, их патогенность и персистентность. Биологическими свойствами возбудителя во многом обусловлены скорость его элиминации из очага воспаления и прогноз течения инфекционного процесса. Частая смена возбудителей, инициирующих гнойно-воспалительный процесс, их способность инактивировать факторы естественной резистентности макроорганизма, в частности, лизоцим, обусловливали низкую эффективность традиционных препаратов, которые зачастую использовалися без учета фазы раневого процесса [3, 10, 15].
Степень выраженности антилизоцимной активности проанализирована у микроорганизмов, выделенных при различных видах гнойно-воспалительного процесса в оториноларингологии. Исследования показали, что при «болезни оперированного уха» она составила 0,9+0,05 мкг/мл, при хроническом гнойном мезо- и эпитимпаните (из наружного слухового прохода) - 1,66+0,14 мкг/мл и 1,88+0,11 мкг/мл соответственно, при хроническом гнойном мезо- и эпитимпаните (из барабанной полости) - 1,73+0,09 мкг/мл и 2,22+0,14 мкг/мл соответственно, что имело статистически высоко значимые различия между всеми группами. В полученных результатах четко просматривались высоко значимые различия в показателях у S. aureus и представителей грамотрицательной микрофлоры. Так, например, выделенным из барабанной полости при хроническом гнойном эпитимпаните штаммам S. aureus был свойственен уровень антилизоцимной активности, равный 2,22+0,14 мкг/мл, в то время, как штаммам E. coli - 2,95+0,10 мкг/мл, P. aeruginosa - 2,88+0,11 мкг/мл, P. mirabilis - 3,04+0,09 мкг/мл, что отражало более выраженную патогенность возбудителей.
В то же время необходимо указать на отсутствие статистически значимых различий в значениях признака у штаммов E. coli, полученных из наружного слухового прохода при хроническом гнойном эпитимпаните и из барабанной полости при хроническом гнойном мезотимпаните -2,6+0,14 мкг/мл и 2,65+0,10 мкг/мл, соответственно (p>0,05); у изолятов P. aeruginosa при хроническом гнойном мезо- и эпитимпаните - 2,71+0,11 мкг/мл и 2,78+0,16 мкг/мл, соответственно (p>0,05).
Сравнительное изучение отразило нарастание уровня активности у всех возбудителей, выделенных как из наружного слухового прохода, так и из барабанной полости, при хроническом гнойном эпитимпаните, что сопоставимо с тяжестью процесса.
Степень выраженности антилизоцимной активности также проанализирована у микроорганизмов, выделенных при паратонзиллите и хроническом декомпенсированном тонзиллите (ХДТ). Исследования показали, что у изолятов при паратонзиллите она составила 3,12+0,06 мкг/мл, при хроническом декомпенсированном тонзиллите - 3,35+0,07 мкг/мл, что имело статистически высоко значимые различия (p<0,0001). Проводя межвидовую характеристику стафилококков, необходимо отметить, что при обеих формах патологии штаммы S. aureus и КОС между собой отличались по выраженности антилизоцимной активности: 3,12+0,06 мкг/мл и 3,40+0,10 мкг/мл, соответственно (p<0,0001) при паратонзиллите; 3,35+0,07 мкг/мл и 3,54+0,05 мкг/мл, соответственно (p<0,0001) - при хроническом тонзиллите. Статистически значимых различий не наблюдалось в значениях признака у S. aureus (3,12+0,06 мкг/мл) и Str. pyogenes (3,13+0,08 мкг/мл) при паратонзиллите (p = 0,693), в то время как при ХДТ различия в показателях были высоко значимыми (3,35+0,06 мкг/мл и 3,22+0,08 мкг/мл, соответственно (p<0,0001).
Сравнительная оценка адгезивной способности стафилококка при гнойно-воспалительных процессах в среднем ухе показала, что при всех видах патологии отмечается средний потенциал адгезии. В то же время, минимальные значения присущи возбудителям при «болезни оперированного уха» (2,39+0,14), что статистически высокозначимо (p<0,0001) отличается от показателей при хроническом гнойном среднем отите, как из наружного слухового прохода (3,23+0,21), так и из барабанной полости (3,92+0,23).
Сравнительная оценка адгезивной способности стафилококка при паратонзиллите и хроническом декомпенсированном тонзиллите выявила достоверную разницу в среднем показателе адгезии. Так, при паратонзиллите он составил 1,64+0,46, при тонзиллите - 2,75+0,37, в контроле -0,34+0,07 (p<0,001).
Необходимо обратить внимание на взаимосвязь между тяжестью патологического процесса и биологическими свойствами возбудителей. Также следует отметить, что выделенные в ассоциациях возбудители, характеризовались преимущественно достоверно более высокими показателями адгезивной и антилизоцимной активности. Более частая регистрация антилизоцимной активности у штаммов S. aureus, выделенных при заболеваниях глотки, по нашему мнению и других авторов [6], обусловлена необходимостью микроорганизма в большей степени противостоять лизоциму, уровень которого в слюне значительно выше, чем в любой ране иной локализации.
По мнению ряда авторов, возрастающая этиологическая роль стафилококка в развитии патологии лимфоидного глоточного кольца ассоциируется именно с белком А, который, связываясь с Fc-фрагментом IgG, препятствует иммунному фагоцитозу и активации комплемента по классическому пути [1, 17]. Иммуноферментным методом последовательного насыщения [10] нами выявлен средний уровень продукции свободного протеина А, который при паратонзиллите составил 74,23+15,64 нг/мл на усл. ед. (200 млн. стафилококков в 1 мл по спектрофотометру при ^=600 нм), что достоверно отличалось от значений в контроле - 58,41+14,11 нг/мл на усл. ед. Выделенные штаммы S. aureus при хроническом декомпенсированном тонзиллите отличались достоверно более высокой продукцией протеина А - 317,65+40,25 нг/мл на усл. ед., в сравнении как с контролем, так и с показателями при паратонзиллите. При этом склонность штаммов, выделенных при хроническом тонзиллите, к высокой продукции протеина А подтверждают приведенные в таблице данные. Так, если в контрольной группе преобладали штаммы S. aureus II класса уровня суточной продукции протеина (52,94%), в группе при паратонзиллите - I класса (30,77%), то при хроническом декомпенсированном тонзиллите - биологические варианты-сверхпродуценты протеина А (65,51%). При паратонзиллите по 15,38% штаммов отнесены к III и IV классам, что достоверно их отличало от контроля (0%) и от выделенных S. aureus при хроническом декомпенсированном тонзиллите - 6,9% и 10,34% соответственно, p<0,0001.
Из таблицы четко видно, что штаммам S. aureus, изолированным при хроническом декомпенсированном тонзиллите, присущи более высокий уровень и более частая продукция протеина А, характеризующего вирулентность возбудителя при данной патологии.
Исследование чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам продемонстрировало их полирезистентность. Так, штаммы стафилококков проявили 100% резистентность к ампициллину, гентамицину, цефтазидиму, цефалексину, и были высоко устойчивы к пенициллину (97,61%), тетрациклину (66,66%), оксациллину (52,38%), канамицину (50%), ампициллин+сульбактаму (45,23%). При этом выявлена корреляционная связь антибиотикорезистентности стафилококков с уровнем экспрессии антилизоцимной активности (r=0,85, p<0,01). Неэффективными в отношении
штаммов энтеробактерий оказались канамицин (92,30%), тетрациклин, амоксициллин, амоксициллин+клавуланат (84,62%), цефалотин, левомицетин (76,92%). Высокую чувствительность штаммы энтеробактерий проявили к амикацину, пефлоксацину, офлоксацину, ципрофлоксацину, менее - к имипенему, цефуроксиму, цефокситину, цефотаксиму, цефтазидиму, азтреонаму. Все изоляты псевдомонад проявили устойчивость к пефлоксацину, ко-тримоксазолу, но были чувствительны к гентамицину, к тобрамицину, офлоксацину.
Таблица. Уровни продукции протеина А стафилококком в зависимости от формы патологии
Класс Группа
Паратонзиллит, n=13 хронический декомпенсированный тонзиллит, n=29 Контроль, n=17
Класс I (0 нг/мл усл. ед.) 30,77% 0 47,05%
Класс II (1-50 нг/мл) 23,08% 6,9% 52,94%
Класс III (50-100 нг/мл) 15,38% 6,9% 0
Класс IV (100-150 нг/мл) 15,38% 10,34% 0
Класс V (150-200 нг/мл) 7,69% 10,34% 0
Класс VI (>200 нг/мл) 7,69% 65,51% 0
Очевидно, что в борьбе с полирезистентной к синтетическим антимикробным препаратам микрофлорой актуален поиск эффективных растительных средств. Проведенный ранее in vitro скрининг антимикробной активности официнальных препаратов эфирных масел и спиртовых настоек в отношении стандартных штаммов и клинических изолятов S. aureus, B. subtillis, E. coli, A. baumannii, K. pneumoniae, P. aeruginosa, P. vulgaris и дрожжеподобного гриба C. albicans показал неэффективность используемых в оториноларингологической практике «Можжевельника» и «Хлорфиллипта», и, наоборот, позволил к наиболее перспективным отнести «Березовый деготь», «Фенхель», «Чайное дерево» [17]. Так, например, диаметры зон ингибирования роста превалирующего возбудителя раневой инфекции (S. aureus) эфирными маслами «Базилик», «Березовый деготь», «Кориандр», «Можжевельник», «Мята», «Полынь», «Сосна», «Фенхель», «Чабрец», «Чайное дерево» составили 13,8+0,05 мм, 25,1+0,27 мм, 7,4+0,07 мм, 0,0+0,0 мм, 4,2+0,41 мм, 7,2+0,07 мм, 8,1+0,04 мм, 24,8+0,07 мм, 11,5+0,11 мм, 21,4+0,23 мм, соответственно. В отношении E. coli достоверно (p<0,001) более выраженной активностью обладал «Фенхель», при этом диаметры зон ингибирования возбудителя средствами «Базилик», «Березовый деготь», «Фенхель», «Чайное дерево» составили: 18,5+0,53 мм, 18,7+0,59 мм, 26,3+0,16 мм, 15,1+0,18 мм, соответственно. С учетом наметившейся тенденции к увеличению роли Candida в развитии раневой инфекции и низкого уровня чувствительности возбудителя к имеющимся полиеновым антибиотикам и препаратам класса азолов, обнадеживали показатели эффективности «Базилика», «Березового дегтя», «Кориандра», «Фенхеля», «Чайного дерева». Диаметры зон ингибирования роста C. albicans перечисленными эфирными маслами соответственно равны: 19,2+0,2 мм, 38+0,53 мм, 12,6+0,14 мм, 39,7+0,11 мм, 11,2+0,26 мм.
Известно, что лечебная активность растений обусловлена содержанием в них комплекса разнообразных и сложных по своему химическому составу [20] и фармакологическому действию [19] биологически активных веществ. Фенолы, входящие в состав перечисленных выше растительных средств, являлися одним из наиболее распространенных и многочисленных классов природных соединений. Согласно литературным данным, фитосубстанции с доминирующим содержанием фенилпропаноидов оказывали ингибирующее воздействие на патогенный и персистентный потенциал микроорганизмов [20]. Фенолосодержащие эфирные масла (тимол, эвкалипт, ментол) входят в состав «Листерина», который в стоматологической практике принято
считать одним из самых эффективных лекарственных средств для лечения кандидоза полости рта
[9].
Однако проведенный нами in vitro сравнительный анализ антимикотической активности «Листерина» и «Орасепта» показал, что они уступают «Березовому дегтю», поскольку диаметры зон ингибирования роста C. albicans ими составили 28,4+0,06 мм, 28,9+0,06 мм (соответственно) против 38,0+0,53 мм. На основании полученных данных для лечения кандидозной инфекции полости рта был предложен состав, выраженность антимикотического и ранозаживляющего эффектов которого зависит от соотношения компонентов «Березовый деготь» и «Витамин А» (1:1, 1:2, 1:3). В частности, максимальный антимикотический эффект отмечен при использовании соотношения 1:1 - диаметр зоны ингибирования роста C. albicans составил 30,1+0,11 мм, в то время как при соотношении 1:2 и 1:3 - 26,6+0,14 мм и 22,8+0,12 мм, соответственно. Проведенное на базе кафедры стоматологии УО «Витебский государственный медицинский университет» исследование показало, что при использовании «Орасепта» полное заживление изъязвлений слизистой оболочки полости рта наступает на 12,2+0,11 сут., что достоверно (p < 0,001) быстрее, чем при традиционном лечении (14,4+0,16 сут.). В то же время при применении под парафиновую повязку состава «Березовый деготь» + «Витамин А» 1:3 происходит снижение грибковой обсемененности очага поражения с 106 до 103 КОЕ/г ткани на 2,4+0,18 сут.; жалобы и клинические признаки инфекции отсутствуют на 3,77+0,02 сут., полное заживление раневой поверхности наблюдается на 8,9+0,08 сут. [16].
Для разработки схем рациональной антимикробной терапии и прогнозирования частоты перевязок в послеоперационном периоде при хроническом гнойном среднем отите использован метод количественной оценки время- и дозозависимого киллинга возбудителя, позволивший определить эффективные разведения и продолжительность активности эфирных масел «Березовый деготь», «Фенхель», «Чайное дерево». Так, установлено, что «Березовый деготь» и «Фенхель» вызывали ингибирование роста возбудителей в разведениях от 1:8 до 1:512, «Чайное дерево» - от 1:2 до 1:128. Продолжительность активности «Березового дегтя» в отношении S. aureus и B. subtilis, C. albicans на протяжении 24-36 ч. позволила рекомендовать одноразовые перевязки в течение 1-2 сут.
Проведенные в отделении оториноларингологии УЗ «Витебская областная клиническая больница» исследования подтвердили, что при лечении послеоперационных ран, контаминированных S. aureus, B. subtilis, C. albicans, эффективны одноразовые перевязки с использованием перечисленных эфирных масел. При наличии в ране A. baumannii или K. pneumoniae процедура должна проводиться 2 раза в сутки, а при более частых перевязках досягаем успех лечения послеоперационных полостей, из которых изолированы P. aeruginosa или P. vulgaris.
Выраженный антимикробный эффект в отношении исследуемой как грамположительной, так и грамотрицательной микрофлоры, а также C. albicans, продемонстрировал и настой «ФитоМПа» [8] при соотношении маклейи мелкоплодной и подорожника большого 2:1. Диаметр зоны ингибирования роста S. aureus составил 23,21+0,42 мм, КОС - 22,73+1,02 мм, E. coli - 14,64+0,81 мм, P. aeruginosa - 8,33+0,58 мм, C. albicans - 11,88+0,64 мм. Однако P. mirabilis оказался резистентным к средству.
Установив выраженную антимикробную активность в отношении выделенных возбудителей, представляло интерес выявить возможность растительных извлечений влиять на бактериальный потенциал (антилизоцимную и адгезивную активности). Известно, что угнетение персистентных свойств микроорганизма затрудняет его способность активизировать воспалительный процесс и повышает эффективность лекарственных средств [3].
Исследования продемонстрировали, что совместное инкубирование исследуемых культур S. aureus с эфирным маслом «Фенхель» приводило к снижению антилизоцимной активности у штаммов с 1,70+0,47 мкг/мл до 0,62+0,28 мкг/мл, т.е. в 2,74 раза. Настой «ФитоМПа» обладал менее выраженным ингибированием - до 0,88+0,42 мкг/мл, т.е. в 1,93 раза, и несколько уступал при этом эфирному маслу «Чайное дерево», которое снижало уровень признака у возбудителя до 0,84+0,46 мкг/мл, т.е. в 2,02 раза. Таким образом, средства снижали экспрессию на 63,53%, 48,23% и 52,54% соответственно, что достоверно их отличало между собой. Взятый для сравнения «Хлоргексидина биглюконат» обладал еще менее выраженным ингибированием, достоверно отличался от остальных средств: снижал уровень признака до 1,14+0,28 мкг/мл, т.е. в 1,49 раз; экспрессию - на 32,94%.
Сравнительное исследование показало, что максимальное снижение адгезивной активности выделенных штаммов S. aureus при «оперированном ухе» наблюдалось после инкубации с эфирным маслом «Фенхель» - на 61,51%, что статистически отличало его от остальных средств. Под действием «ФитоМПа», «Чайного дерева» и «Хлоргексидина биглюконата» коэффициент участия эритроцитов в адгезии снижался на 43,10%, 39,75% и 24,69% соответственно в сравнении со значениями до инкубации (p<0,001). Средний показатель адгезии после инкубации с эфирным маслом «Фенхель» снизился с 2,39+0,14 до 0,92+0,86, что достоверно отличало это средство от остальных. Статистически достоверные отличия в показателях от изначального получены при использовании «ФитоМПа» - 1,36+0,95, «Чайного дерева» - 1,44+0,96, «Хлоргексидина биглюконата» - 1,80+0,87.
При хроническом гнойном мезо- и эпитимпаните положительный эффект у средств был менее выражен. Так, при мезотимпаните под действием «Фенхеля» адгезивная способность возбудителя снижалась на 35,66%, «ФитоМПа» - на 30,07%, «Чайного дерева» - на 25,87%, «Хлоргексидина биглюконата» - 20,28%. Средний показатель адгезии после инкубации с эфирным маслом «Фенхель» снизился с 2,86+0,14 до 1,84+0,90, что достоверно отличало это средство от остальных. Статистически достоверные отличия в показателях от изначального получены при использовании «ФитоМПа» - 2,0+0,82, «Чайного дерева» - 2,12+0,73, «Хлоргексидина биглюконата» - 2,28+0,61.
При хроническом гнойном эпитимпаните снижение адгезивной активности S. aureus под действием «Хлоргексидина биглюконата» выявлено лишь на 5,88%, при этом средний показатель адгезии возбудителя снизился с 3,23+0,21 до 3,04+0,89 (p<0,001).
После инкубации с эфирным маслом «Фенхель» по-прежнему наблюдалось максимальное снижение адгезивной активности выделенных штаммов S. aureus - на 21,98% и среднего показателя адгезии - до 2,52+1,00. Под действием «ФитоМПа» и «Чайного дерева» коэффициент участия эритроцитов в адгезии снижался на 13,31% и 10,84% соответственно (p<0,001). Статистически достоверные отличия получены и в средних показателях адгезии - 2,80+1,00 и 2,88+0,93, что статистически значимо отличалось от изначального значения.
Заключение
Анализ полученных данных показал, что затяжной характер хронического гнойно-воспалительного процесса обусловлен высокой адгезивной и антилизоцимной активностью микрофлоры. При этом, при всех видах патологии просматривается более высокая антилизоцимная активность у грамотрицательных микроорганизмов, чем у грамположительных, что коррелирует с симтоматикой вызываемого ими заболевания.
Исследования продемонстрировали, что лекарственные растения, как источник биологически активных соединений, способны проявлять необходимую модифицирующую активность в отношении персистентного потенциала возбудителей раневой инфекции, что позволяет их использовать в качестве эффективных антимикробных средств для борьбы с раневой микрофлорой, проявляющей полирезистентность к синтетическим антимикробным препаратам.
Литература
1. Акатов А.К. Белок А золотистого стафилококка // ЖМЭИ. - 1977. - №5. - С. 5-10.
2. Бархатова Н.А. Динамика резистентности возбудителей локальных и генерализованных форм инфекций мягких тканей // Казан. мед. журнал. - 2009. - Т. 90, № 3. - С. 385-390.
3. Бухарин О.В. Механизмы персистенции бактериальных патогенов // Вестник РАМН. - 2000. - №2. - С. 44-49.
4. Валь Е.И. Препараты из растительного сырья: отраслевая проблема // Ремедиум. - 2001. - №1-2. - С. 3840.
5. Золотарев П.Н. Выявление и определение антибактериальных свойств фитопрепаратов, содержащих фенилпропаноиды, и чистых веществ // Мед. вест. Башкортостана. - 2006. - №1. - С. 131-135.
6. Касатов А.В., Горовиц Э.С., Тимашева О.А. Видовой пейзаж и биологические свойства микроорганизмов рода Staphylococcus, выделенных от больных стерномедиастинитами // Мед. альманах. - 2013. - №2. - С. 107-110.
7. Козлов P.C. Клиническое значение резистентности грамположительных бактерий // Инфек. в хирургии. -2009. - Т.7, прил.1. - C. 3-10.
8. Косинец А.Н., Фролова А.В., Бузук Г.Н. Состав лекарственного препарата // BY 7728. - 2004.
9. Курчанинова М.Г. Сравнительное изучение эффективности различны« методов гигиены полости рта при проведении ортодонтического лечения: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - М., 2010. - 26 с.
10. Малеев В.В. Особенности клиники, диагностики и лечения особо опасных инфекций на современном этапе // Вест. РАМН. - 2002. - №10. - С. 45-47.
11. Окулич В.К. Иммуноферментный анализ протеина А стафилококка в биологических объектах: Автореф. дис. .канд. мед. наук. - Мн., 1994. - 24 с.
12. Ортенберг Э.А., Демин А.А., Петроченкова Н.А., Андреева И.В. Самостоятельное применение антимикробных препаратов населением: результаты многоцентрового исследования // Клин. фармакол. и терапия. - 2002. - Т.11, №2. - С. 25-29.
13. Решедько Г.К., Козлов Р.С. Состояние резистентности к антиинфекционным химиопрепаратам в России. - Смоленск: МАКМАХ, 2007. - С. 49-51.
14. Страчунский Л.С., Пешере Ж.К., Дедлинджер П.Э. Политика применения антибиотиков в хирургии // Клин. микробиол. антимикроб. химиотерапии. - 2003. - Т.5, №4. - С. 302-317.
15. Фролова А.В. Антимикробный эффект маклейи мелкоплодной при местном лечении хирургической инфекции (экспериментальное исследование): Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Мн., 2007. - 21 с.
16. Фролова А.В., Сахарук Н.А. Обоснование использования фенолосодержащих препаратов в местном лечении кандидоза полости рт // Совр. стоматология. - 2010. - №2. - С. 59-62.
17. Фролова А.В. Эфирные масла - перспективные источники при разработке антимикробных лекарственный средств для местного лечения гнойнык ран // Вестник ВГМУ. - 2010. - Т.9, №1. - С. 104110.
18. Boyle M.D.P. Bacterial immunoglobulin-binding proteins // Encyclopedia of immunology. 2-d ed. New-York: Acad. Press. 1998. - P. 323-327.
19. Eloff J.N. Which extractant should be used for the screening and isolation of antimicrobial components from plants? // J. Ethnopharmacol. - 1998. - N60. - P. 1-8.
20. Hamburger H. The link between phytochemistry and medicine // Phytochemistry. - 1991. - N30. - P. 38643874.
21. Lewis K., Ausubel F.M. Prospects for plant-derived antibacterials // Nat. Biotechnol. - 2006. - V.24, N12. - P. 1504-1507.
22. Klink B. Alternative medicines: is natural really better? // Drug Top. - 1997. - N141. - P. 99-100.
Информация об авторах
Фролова Аэлита Валерьевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры клинической микробиологии УО «Витебский государственный медицинский университет». E-mail: [email protected]
Окулич Виталий Константинович - кандидат медицинских наук, доцент кафедры клинической микробиологии УО «Витебский государственный медицинский университет». E-mail: [email protected]
