CC BY
31УДК 632.937.21
БИОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОВЫХ ПРЕПАРАТИВНЫХ ФОРМ БИОИНСЕКТИЦИДА НА ОСНОВЕ BACILLUS THURINGIENSIS ПРОТИВ
КОЛОРАДСКОГО ЖУКА
И.В. Бойкова, И.И. Новикова, С.Р. Фасулати, В.А. Павлюшин
Всероссийский НИИ защиты растений, Санкт-Петербург
На основе штамма Bacillus thuringiensis BT16 T100 - продуцента 5-эндотоксина, обладающего токсическим действием на жесткокрылых насекомых (Coleoptera), методом глубинной ферментации с использованием вспомогательных компонентов получены лабораторные образцы препаративных форм: жидкой (СК), сухой (СП) и пастообразной (П). Изучена их инсектицидная активность в отношении личинок и имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata, принадлежащего к разным экотипам.
Ключевые слова: штамм-продуцент, препаративная форма, ферментация, питательная среда, колорадский жук, экотип.
При разработке современных систем интегрированной защиты растений, обеспечивающих высокий выход высококачественной и экологически чистой сельскохозяйственной продукции, особое внимание уделяется методам биологического контроля численности насекомых. Одним из наиболее эффективных и широко применяемых средств борьбы с ними являются препараты на основе грам-положительной спорообразующей бактерии Bacillus thuringiensis (Bt) (около 90% рынка биопестицидов). Уникальная способность штаммов Bt синтезировать в процессе споруляции параспоральные инсектицидные белковые кристаллы, известные как 5-эндотоксины, содержание которых может достигать 20-30% от сухой массы клетки, обусловливает возможность их использования в качестве природных контролирующих агентов в защите растений.
Необходимость разработки новых эффективных экологически безопасных биологических препаратов против колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata Say) диктуется его значительной вредо-ностностью и широкой распространенностью. Актуальность проблемы контроля численности колорадского жука на экологически безопасном уровне связана с крайне ограниченным ассортиментом эффективных биопрепаратов, что, в свою очередь, обусловлено рядом нерешенных
проблем в сфере их создания и внедрения в производство. Колорадский жук -основной вредитель картофеля - одной из важнейших сельскохозяйственных культур в России, площадь под которой составляет 3 млн га. Заселенность колорадским жуком посадок картофеля в некоторых районах достигает 50-60%, вследствие чего потери урожая от преждевременного уничтожения ботвы составляют 25-30%. В Северо-Западном регионе РФ с 2010 г. идет процесс интенсивного расширения очагов колорадского жука, сформировавшихся до 2007 г. включительно. Численность колорадского жука в таких очагах значительно выше экономического порога вредоносности. Применение химических инсектицидов влечет за собой необратимые негативные последствия для окружающей среды и человека. Формирование резистентности к ним у насекомых вынуждает повышать нормы расхода и кратность применения химических препаратов. Поэтому создание новых безопасных и высокоэффективных биологических препаратов является актуальным.
В настоящее время в ГНУ ВИЗР и ФГУП ГосНИИгенетика накоплен большой теоретический и практический материал для создания нового поколения высокоэффективных биопрепаратов на основе Bt для защиты растений от вредителей. В результате широкого скрининга отобран ряд штаммов, идентифи-
цированных методом секвенирования 16S рДНК и ITS региона, эффективных в отношении личинок колорадского жука. Отобранные штаммы, сохраняемые в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР, перспективны для создания на их основе новых высокоэффективных биоинсектицидов для борьбы с данным вредителем.
Наиболее токсичный в отношении личинок колорадского жука штамм по фи-зиолого-биохимическим свойствам, а также способности синтезировать квадратные кристаллы 5-эндотоксина, отнесен к ВасШus thuringiensis 16-Т100, Н8 серотипу. Штамм выделен в ФГУП Гос-НИИгенетика.
Проведены исследования и подбор условий выращивания штамма ВТ16 T100 в жидкой питательной среде, а также режима сушки культуральной жидкости.
Методика
Для получения препаративных форм штамм BT16 T100 культивировали в течение 72 ч на питательной среде следующего состава: панкреатический гидролизат кильки - 10.05 г/л; натрия хлорид
- 4.95 г/л; СаС12 - 3 г/л; дрожжевой ферментолизат
- 10 г/л; в колбах Эрленмейера, объем среды 100 мл, при температуре +28оС, при постоянном перемешивании на качалке. Перед пересевом на ферментационную среду проверяли стерильность. По окончании ферментации показатель КОЕ составлял 1.9х109 кл/мл.
В лабораторных условиях получили следующие препаративные формы: жидкую - суспензионный концентрат (СК), смачивающийся порошок (СП), пасту (ПС).
Получение жидкой препаративной формы (образец №1) осуществляли методом концентрирования культуральной жидкости штамма BT16-Т100(Н8) в 2 раза с добавлением в качестве консерванта 0.2% бензоата натрия.
Для получения смачивающегося порошка (образец №2) в культуральную жидкость вносили 7.0% хлористого натрия и лиофильно высушивали.
Пасты двух видов (образцы №3 и №4) готовили следующим образом.
Образец №3: простерилизованную защитную среду №1 (глицерин - 150 мл/л, сахароза - 150 г/л, натрий хлористый - 27.5 г/л) смешивали с культураль-ной жидкостью в соотношении 1:2 и лиофильно высушивали. Полученный биоматериал имел густую текучую консистенцию. Титр клеток в образце высушенной препаративной формы составил 4,2х1010 КОЕ/г.
Образец №4: второй вариант пасты отличался составом защитной среды: желатин - 5%, сахароза
- 25%, тиомочевина - 1.25%. Смешивали защитную среду с культуральной жидкостью в соотношении 1:5 (400 мл защитной среды: 2000 мл культураль-ной жидкости) и лиофильно высушивали. Получили
Вестник защиты растений, 4, 2012 Эффективность применения биологического препарата в большой степени зависит от его препаративной формы и условий, при которых это химическое соединение вступает в контакт с вредными организмами. Наиболее эффективная и экономичная в данных конкретных условиях препаративная форма выбирается в зависимости от физико-химических свойств действующего вещества, назначения препарата и способа его использования (Sabbour et al., 1986-1992, 2012).
В задачу настоящих исследований входило разработать состав препаративных форм на основе отобранного штамма BT16 T100, получить лабораторные образцы путем глубинной ферментации с использованием вспомогательных компонентов и изучить их инсектицидную активность в отношении личинок и имаго колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say.
исследований
пастообразный образец светло-кремового цвета. Титр клеток в образце №4 составил 5.5х1010 КОЕ/г.
Водные суспензии полученных лабораторных образцов тестировали на имаго и личинках колорадского жука при содержании и кормлении насекомых согласно методикам лабораторных опытов (Павлюшин и др., 2005). В опыт брали личинок 1-2 возрастов или имаго. Личинок выводили из кладок яиц, собранных в Ставропольском крае, Ленинградской Воронежской областях. В вариантах с имаго использовали жуков молодого поколения 2012 г., собранных в окрестностях г. Ессентуки и Ленинградской области и успевших после своего окрыле-ния частично пройти нажировочное питание. В опытных вариантах листья картофеля обрабатывали изучаемой формой препарата - образцы №№ 1-4 - в концентрациях 1.0%, 0.5% и 0.25% (СК разводили водой), путем окунания листа в сосуд с рабочим раствором на 2 сек. В контрольных вариантах листья окунали в чистую воду. В подготовленные таким образом чашки с листьями подсаживали насекомых: личинок - по 10-20 штук (4 повторности, в целом по 55-80 личинок в каждом опытном или контрольном варианте), взрослых жуков - по 8 штук (4 или 8 повторностей, в целом по 32 или 64 жука в каждом варианте). Экспериментальный материал содержали при комнатной температуре (22-24°С) в месте, защищенном от прямых солнечных лучей, а в сентябре-октябре - в термостате при температуре 24-25°С. Первое добавление корма проводили через 2-3 дня после подсадки личинок, добиваясь практически полного поедания ими первых листьев, обработанных изучаемыми препаратами. В дальнейшем при смене или добавлении корма в чашки клали необработанные листья. Учеты выживших и погибших особей проводили согласно общепринятым методикам..
Результаты
Полученные результаты исследований показали эффективность образца жидкой препаративной формы №1 в отношении личинок и молодых имаго северного экотипа колорадского жука. Их выживаемость через 10 суток после обработки составляла 35.3% и 37.5% соответственно.
Высокую эффективность против личинок южного экотипа (северокавказской популяции вредителя) проявил образец №2 СП, вызывая 100% гибель особей при концентрациях 1.0% и 0.5% и окрыление единичных жуков при концентрации 0.25%. Однако ее воздействие на личинок замедленно и высокий процент смертности личинок наблюдается лишь на 7-10-й день (табл. 1).
Низкую эффективность в отношении
исследовании
личинок обнаружил образец №3, гибель особей всех трех экотипов вредителя наблюдали преимущественно в фазе предкуколки и куколки, однако и при этом процент окрылившихся жуков был достаточно высокий, в пределах 13-49%, и мало зависел от концентрации препарата и экотипа вредителя.
Образец №4 в концентрациях 1.0% и 0.5% на личинок северного экотипов жука действовал замедленно и не вызывал полной гибели особей; выход имаго составлял 13-32% (табл. 2).
Особенно эффективен против центрального экопа вредителя (воронежская популяция): гибель личинок на 10 день после обработки составила 89%, при этом выхода имаго не отмечали.
Таблица 1. Выживаемость особей колорадского жука южного экотипа при воздействии препаративных форм №1 и №2, 2012 г.
Исходное Выживаемость особей (на день), % Выход имаго, %
Варианты кол-во особей На 3-й день На 5-й день На 7-й день На 10-й день***
Личинки. Контроль 40 100 100 100 100 92.4 ± 4.2
Образец №1 (разведение х2) 68 72.6 ± 2.4 52.9 ± 2.2 41.2 ± 5.0 35.3 ± 2.7 2.6 ± 1.9
Имаго. Контроль 48 100 100 100 100
Образец № 1 (разведение х2) 64 42.2 ± 4.8 39.1 ± 5.9 39.1 ± 9.8 37.5 ± 6.0
Контроль 55 100.0 88.3 ± 6.0 78.3 ± 8.3 76.7±8.3 68.2 ± 9.4
Образец №2, 1.0% 55 65.8 ± 7.1* 38.4 ± 5.5** 16.6 ± 7.3** 16.6 ± 7.3** 0**
Образец №2, 0.5% 55 65.0 ± 6.1* 50.8 ± 5.9* 20.8 ± 4.5** 19.2 ± 4.8** 0**
Образец №2, 0.25 % 55 84.1 ± 9.9 69.2 ± 6.2* 45.8 ± 5.1* 34.1 ± 4.8* 7.3 ± 4.6**
Различия между вариантами опыта существенны при *Р > 0.95, **Р > 0.99. ***Личинки старших возрастов + предкуколки.
Имаго колорадского жука, принадлежащие к северному экотипу (Ленинград-
ская область), оказались невосприимчивы к образцам №3 и №4 (табл. 2).
Таблица 2. Выживаемость личинок колорадского жука северного экотипа при воздействии препаративных форм №3 и №4, июнь-июль 2012 г.
Варианты Исходное кол-во особей Выживаемость личинок (%) Выход имаго, %
На 3-й день На 5-й день На 7-й день На 10-й день***
Контроль 80 97.5 ± 2.2 95.0 ± 1.8 95.0 ± 1.8 95.0 ± 1.8 65.0 ± 3.5
Образец №3, 1.0% 60 81.7 ± 1.5** 76.7 ± 2.9** 71.6 ± 5.5* 70.0 ± 6.9* 26.7 ± 10.3*
Образец №4, 1.0% 60 88.3 ± 4.9 81.7 ± 3.6* 76.7 ± 5.5* 75.0 ± 6.4* 31.7 ± 6.8*
Образец №3, 0.5% 60 93.4 ± 3.3 86.7 ± 5.3 81.7 ± 7.2* 81.7 ± 7.2* 43.4 ± 6.0*
Образец №4, 0.5% 60 85.0 ± 5.9 75.0 ± 6.0* 55.0 ± 14.0* 50.0 ± 15.9* 13.3 ± 6.2**
Образец №3, 0.25% 60 96.6 ± 1.7 93.3 ± 2.4 90.0 ± 3.7 90.0 ± 3.7 41.7 ± 7.9*
Образец №4, 0.25% 60 61.7 ± 8.6* 46.7 ± 6.3** 25.0 ± 4.9** 13.3 ± 2.4** 3.3 ± 2.9**
Различия между вариантами опыта существенны при *Р > 0.95, растов + предкуколки.
*Р > 0.99. *** Личинки старших воз-
Таким образом, в результате проведенных исследований подобраны составы препаративных форм на основе штамма ВТ16 Т100 - продуцента нового биоинсектицида, обеспечивающие высокую инсектицидную активность в отношении личинок и имаго колорадского жука. Получен ряд препаративных форм: жидкая
- суспензионный концентрат (СК), сухая
- смачивающийся порошок (СП) и два вида паст (ПС), содержащие глицерин и желатин. Наибольшую инсектицидную активность показала препаративная форма СП (смачивающийся порошок), выживаемость личинок через 10 дней после обработки водной суспензией образца №2 в концентрации 1.0%; 0.5 и 0.25% составила 16.6%, 19.2% и 34.1% соответственно. В отношении имаго данная форма активности не проявила.
Жидкая препаративная форма (образец №1) была одинаково эффективна против личинок и молодых имаго. Выживаемость личинок через 10 дней после обработки разбавленным вдвое образцом
№1 составила 35.3%; имаго - 37.5%. Препаративная форма в виде пасты с глицерином (образец №3) была менее эффективна в отношении личинок и имаго колорадского жука.
Показана высокая эффективность образца №4 против центрального экотипа колорадского жука (воронежская популяция): после обработки водной суспензией в концентрации 1.0% и 0.5% преима-гинальная гибель особей составила 89100% (в таблицах данные не проведены).
Оценка эффективности полученных препаративных форм в отношении личинок и имаго колорадского жука, принадлежащего к южному, северному и центральному экотипу, позволила выявить разную чувствительность аллопатриче-ских форм (экотипов) колорадского жука к биопрепарату, что обусловливает необходимость строгого соблюдения принципа зонального подхода при разработке биологических и интегрированных систем защиты картофеля от колорадского жука с использованием нового биоинсектицида.
Литература
Павлюшин В.А, Сухорученко Г.И., Фасулати С.Р., Вил-кова Н.А Колорадский жук: распространение, экологическая пластичность, вредоносность, методы контроля // Защита и карантин растений, 2009, №№ 3 (Приложение), с. 69-100 (1-32).
Павлюшин В.А., Вилкова Н.А., Сухорученко Г.И., Фасулати С.Р., Надыкта В.Д., Исмаилов В.Я. Яковлева И.Н., Скрябин К.Г., Дорохов Д.Б. Методические рекомендации по индикации и мониторингу процессов адаптации
колорадского жука к генетически модифицированным сортам картофеля. СПб, РАСХН, ВИЗР, 2005. 41 с.
Sabbour M.M., Abdou W.L., Abdel-Hakim E.A. Role of some additives in enhancing the formulation of bacteria Bacillus thuringiensis against Phthorimaea operculella and Heli-coverpa armigera. 1-Impact of Tween-80, Arabic gum, Molasses, cellulose, starch and Talc powder. Journal of Appl. Sc. Research. 8(4): 1986-1992, 2012.
НИР выполнена в соответствии с календарным планом Государственного контракта № 16.М04.12.0027.
BIOLOGICAL EFFICIENCY OF THE NEW BIOINSECTICIDE FORMULATIONS ON THE BASIS OF THE BACILLUS THURINGIENSIS AGAINST THE COLORADO
POTATO BEETLE I.V.Boykova, I.I.Novikova, S.R.Fasulati, V.A.Pavlyushin On the basis of Bacillus thuringiensis BT16 T100 strain - a producer of S-endotoxin possessing toxic action on insects Coleoptera, different formulations: liquid, dry and paste were obtained. Their insecticidal activity against Leptinotarsa decemlineata was studied.
Keywords: producer strain, formulation, fermentation, nutrient medium, Leptinotarsa decemlineata, ecotype.
И.В.Бойкова, к.б.н., [email protected] И.И.Новикова, д.б.н.; С.Р.Фасулати, к.б.н. В.А.Павлюшин, академик РАСХН
