CC BY
109
УДК 577.154.2 + 542.952+ 579.22; 577.152.1
БИОКАТАЛИЗАТОРЫ С АКТИВНОСТЬЮ ТЕРМОСТАБИЛЬНОЙ ЛИПАЗЫ
ДЛЯ ПРОЦЕССОВ БИОКОНВЕРСИИ ТРИГЛИЦЕРИДОВ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ:
ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СВОЙСТВА
Г.А. Коваленко1'2, Л.В. Перминова1, А.Б. Беклемишев1'3, А.Л. Мамаев3, В.Л. Кузнецов1'2, С.И. Мосеенков1
Институт катализа СО РАН, 630090, Россия, г. Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 5.
2 Новосибирский государственный университет, 630090, Россия, г. Новосибирск, ул. Пирогова, 2.
3 НИИ биохимии СО РАН,
630117, Россия, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2, [email protected]
Проведены исследования свойств биокатализаторов, приготовленных путем включения клеточных лизатов рекомбинантного штамма rE.rnii'/lip, продуцирующего термостабильную липазу из Thermomyces ianuginosus, в композитные матрицы на основе ЭЮ2-ксерогеля. Подобран оптимальный состав многокомпонентных биокатализаторов, изучена функциональная роль каждого вводимого в состав компонента, в том числе наноструктурированного углерода (нанотрубок, нано-сфер). Изучены ферментативная активность и стабильность приготовленных биокатализаторов в процессах биоконверсии триглицеридов растительных масел - гидролиза и переэтерифика-ции, в том числе переэтерификации триглицеридов подсолнечного масла с участием этилаце-тата в этиловые эфиры жирных кислот (биодизель). Показано, что время полуинактивации биокатализаторов в периодическом процессе получения биодизеля составляет 720 ч при 40 оС. Ил. 3. Табл. 2. Библиогр. 14 назв.
Ключевые слова: рекомбинантная термостабильная липаза; биокатализаторы; переэтерифика-циятриглицеридов
BIOCATALYSTS WITH THE ACTIVITY OF THERMOSTABLE LIPASE
FOR THE PROCESSES OF VEGETABLE OIL TRIGLYCERIDES' BIOCONVERSION:
PREPARATION AND PROPERTIES
G.A. Kovalenko1'2, L.V. Perminova1, A.B. Beklemishev1'3, A.L. Mamaev3, V.L. Kuznetsov1'2, S.I. Moiseenkov1
1 Boreskov Institute of Catalysis SB RAS,
5, Acad. Lavrent'ev Ave.,Novosibirsk, 630090, Russia.
2 Novosibirsk State University,
2, Pirogov St., Novosibirsk, 630090, Russia.
3 Biochemistry Research Institute SB RAS,
2, Timakov St., Novosibirsk, 630117, Russia, [email protected]
Comparative investigations of the biocataiysts with activity of lipase are carried out. The biocataiysts are prepared by entrapment of cells' lysates of recombinant strain rE^oii/iip producing thermostable lipase of Thermomyces ianuginosus inside SiO2-xerogei composites. The functions of each component included inside biocataiysts, in particular carbon nanotubes and nanospheres, are investigated. Enzymatic activity and stability of the prepared biocataiysts are examined in the processes of byconversion of vegetable oils' tri-giycerides - hydroiysis and interesterification. The biocataiyst operates in the periodic process of interesterification of sun flower oil' triglycerides with ethyl acetate to ethyl esters of fat acids (biodiesei), and the biocatalyst' haif-iife time is 720 h at 40 oC. 3 figures. 2 tables. 14 sources.
Key words: recombinant thermostable lipase; biocatalysts; triglycerides' interesterification
ВВЕДЕНИЕ
Биокатализаторы, обладающие активностью липазы, имеют важное практическое значение, поскольку активный компонент этих биокатализаторов - фермент липаза (триацил-глицерол эфир гидролаза, К.Ф. 3.1.1.3) осуществляет разнообразные реакции с участием молекул триглицеридов масел и жиров: гидролиз, этерификацию (синтез эфиров из жирной кислоты и спирта), переэтерификацию (внутри - и межмолекулярный обмен остатками жирных кислот в молекуле триглицеридов), алкоголиз, аминолиз. Биокатализаторы с активностью термостабильной липазы применяются для пе-реэтерификации масложировых смесей и получения ценных продуктов для пищевой промышленности - специализированных жиров как
важнейших ингредиентов без-трансовых спрэ-дов и маргаринов, а также заменителей дорогостоящих масел какао и молочных жиров. В настоящее время проводятся исследования по применению липаз в основном и тонком органическом синтезе (получение душистых веществ, разделение рацематов, синтез энантио-меров фармацевтических соединений) [7].
Известно, что биодизель представляет собой смесь метиловых или этиловых эфиров жирных кислот, входящих в состав триглицери-дов растительных масел (рапсового, соевого). Благодаря близким к дизельному топливу физико-химическим показателям (вязкости, теплотворности), эту смесь эфиров используют в двигателях внутреннего сгорания, чаще всего, в
смеси с традиционным углеводородным горючим [1]. Наиболее распространенной маркой является смесь В20, в составе которой 20% приходится на биодизель, 80% - на дизель (цифра после буквы «В» обозначает процентное содержание биодизеля в топливе). При применении смесей В5-В20 не требуется технических изменений в двигателях. В настоящее время интенсивно изучают процессы получения эфиров жирных кислот путем ферментативной переэтерификации триглицеридов растительных масел с участием биокатализаторов - иммобилизованных липаз. Процессы проводят, в основном, в периодических реакторах смешения при 40-50 оС в присутствии низших спиртов (метанола, этанола, реже пропанола). Поскольку растительное масло сравнительно плохо растворяется в спиртах, используют со-растворители - гексан, трет-бутанол. После реакции биокатализатор удаляют из реакционной среды фильтрацией или центрифугированием, промывают растворителем и возвращают в следующий реакционный цикл, продолжительность которого составляет десятки часов. Поиск и подбор оптимального состава реакционной среды (масло, ацилирующий реагент и сорастворитель) в каждом конкретном случае представляет непростую научно-практическую проблему. В обзорных работах [5,6,8,12] описаны способы и условия проведения процессов ферментативной переэтерификации, а также свойства используемых биокатализаторов. В 2007 г. одним из первых был реализован периодический процесс метанолиза отработанных пищевых масел мощностью 10 тыс. т с участием биокатализатора, приготовленного путем иммобилизации липазы из Candida sp. [12].
Как отмечалось выше, активным компонентом биокатализаторов процесса получения биодизеля является липаза. В водных средах этот фермент гидролизует эфирные связи в молекулах триглицеридов с образованием жирных кислот, глицерина, моно- и ди-глицеридов. В неводных средах липаза осуществляет обратные реакции синтеза сложных эфиров и/или обмена жирнокислотными остатками, например, реакцию этерификации/переэтерификации с участием молекулы жирной кислоты / тригли-церида и акцептора ацильной группы (спирта). Известно, что низшие спирты быстро инактиви-руют ферменты, поэтому для того, чтобы уменьшить процесс инактивации, метанол в течение реакционного цикла добавляют ступенчато небольшими порциями. В оптимальных условиях метанолиза с участием коммерческого биокатализатора Novozyme® конверсия масла в эфиры жирных кислот составила > 99% за 50 ч при 45 оС [10]. В работе [13] были проведе-
ны исследования реакции ферментативной переэтерификации масел с использованием другого акцептора ацильных групп - метилацетата. Даже при мольном соотношении масло : ме-тилацетат = 1 : 12 этот реагент не снижает активность коммерческого биокатализатора [13]. В оптимальных условиях работы биокатализатора Novozyme® выход эфиров составил 96%, при этом время его полуинактивации увеличилось в 20 раз по сравнению с реакцией в метаноле [13]. При переэтерификации масел с участием метил- или этилацетата образуются различные ацил-производные глицерина, имеющие практическое значение. Например, ацетаты глицерина входят в состав отвердителей. Моно- и триацил производные глицерина используют в качестве топливной добавки. Триа-цилглицерин (триацетин) широко используют в пищевой промышленности благодаря его вла-гоудерживающим свойствам, а также в табачной промышленности для пропитки сигаретных фильтров.
Следует обратить внимание на то, что в процессах ферментативной переэтерификации для получения биодизеля используют цельно-клеточные биокатализаторы, т.е. приготовленные на основе целых или частично разрушенных клеток штаммов-продуцентов, без проведения стадий выделения и очистки индивидуального фермента. Очевидно, что стоимость цельноклеточных биокатализаторов существенно ниже стоимости биокатализаторов, приготовленных на основе ферментов. В работе [14] авторы оценили вклад стоимости активного компонента в стоимость конечного продукта, и показали, что биодизель, полученный с участием цельноклеточного биокатализатора, существенно (на 1-2 порядка) дешевле продукта, полученного с участием коммерческих биокатализаторов Lypozyme® и Novozyme® (NOVO-ZYMES), приготовленных на основе частично очищенной липазы.
Цель данной работы заключается в систематическом исследовании свойств (активности и стабильности) биокатализаторов, приготовленных путем включения клеточных лизатов рекомбинантного штамма-продуцента гЕ.соН^ в ксерогель диоксида кремния и его композиты. Сконструированный рекомбинантный штамм гЕ.соШ^ продуцировал термостабильную липазу из ТЬвгтотуовв lanuginosus внутриклеточно. В работе изучена функциональная роль вводимых в матрицу SiO2-ксерогеля дополнительных компонентов, в том числе наноструктурирован-ного углерода (нанотрубок, наносфер), подобран оптимальный состав многокомпонентных биокатализаторов. Приготовленные биокатализаторы были исследованы в процессах биокон-
версии триглицеридов растительных масел, а именно, в реакции переэтерификации масло-жировых смесей, а также в реакции образования эфиров жирных кислот (биодизеля) с участием этилацетата.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Рекомбинантный штамм-продуцент термостабильной липазы (обознач. rE.coli/lip) был сконструирован методами клонирования химически синтезированного гена зрелой липазы из Thermomyces Ianuginosus в клетках E. coli BL21(DE3) в составе вектора экспрессии pJexpress401 (DNA2.0, USA). Кодирующая область синтетического гена была оптимизирована для эффективной экспрессии в E. coli с помощью компьютерной программы Gene Designer2 фирмы DNA2.0 (США), а также с применением специально разработанной авторами данной статьи программы поиска пар кодонов, которые по данным [9] затрудняют или останавливают трансляцию мРНК в E. coli. Рекомбинантный штамм rE.col//1ip обеспечивал экспрессию клонированного гена, индуцируемую изопропил - ß - D - 1 - тиогалактопиранозидом (ИПТГ), под контролем промотора бактериофага Т5.
Выращивание клеток rE.coli/lip проводили на орбитальном шейкере (150 об/мин) в ЛБ-среде, рН 7,5, содержащей 30 мкг/мл канами-цина, в течение 12 ч при 30 °С. В качестве посевного материала использовали ночную культуру клеток rE.col//1ip, выращенных в ЛБ-среде в течение 18-20 ч при 37 °С. Затем 10 мл посевного материала вносили в 400 мл ЛБ-среды, и выращивали клеточную биомассу до оптической плотности, равной 1,0 при 600 нм, после чего в культуру вносили ИПТГ до конечной концентрации 1-2 мМ. Культивирование продолжали в течение 18 ч при 30 оС. По окончании культивирования клетки осаждали центрифугированием (5000*g, 20 мин, +4 оС). Суспензию клеток рекомбинантного штамма обрабатывали последовательно лизоцимом, ДНКазой1 и РНКа-зойА и озвучивали в ультразвуковом дезинтеграторе, как описано в [2,11]. Полученные клеточные лизаты rE.coli/lip в виде суспензии с содержанием сухих веществ 6-8% использовали для приготовления биокатализаторов.
Биокатализаторы были приготовлены путем включения клеточных лизатов rE.coli/lip в ксерогель диоксида кремния, как описано в [2,11]. Гидрогель диоксида кремния представляет собой желеобразную массу с содержанием сухого SiO2 и воды, соответственно, 12% и 88%. Гидрогель получали путем взаимодействия силиката натрия с аммонийными солями азотной кислоты при рН 8 и 50 оС, затем полу-
ченный продукт отмывали водой, отфильтровывали и использовали в качестве основного неорганического компонента и связующего. Мальтодекстрин (влагоудерживающий агент) вводили в состав биокатализаторов для того, чтобы обеспечить наличие молекул воды в микроокружении фермента. Роль «внутренней» воды в функционировании приготовленных биокатализаторов в безводных реакционных средах была подробно изучена в работе [2]. В качестве наноуглеродного компонента, вводимого в состав биокатализаторов, использовали тонкодисперсные порошки многослойных углеродных нанотрубок (МУНТ), полученные при пиролизе этилена на нанесенных Fe,Co-катализаторах, а также порошки наносфер углерода луковичной структуры (НУЛС), полученные отжигом наноалмазов. Углеродные нанот-рубки имели длину 1-2 мкм, количество графе-новых слоев составляло 5-9, толщина стенки 2,5-3,0 нм. Для приготовления биокатализаторов использовали МУНТ с диаметром трубки 0 9-11 нм и удельной поверхностью (бУд) 320 м2/г (МУНТ-1, «тонкие»), а также с 0 2022 нм и Буд = 140 м2/г (МУНТ-2, «толстые»). Диаметры наносфер НУЛС также различались: 0 5-6 нм и БУд = 485 м2/г (НУЛС-1, «мелкие»), 0 8-10 нм и БУД = 250 м2/г (НУЛС-2, «крупные»). Для приготовления биокатализаторов использовали МУНТ как в виде агрегатов размером >150 нм, получаемых в пиролитической установке, так и предварительно диспергированные ультразвуком. Диспергирование «тонких» углеродных нанотрубок проводили следующим образом: смешивали порошок агрегированных МУНТ-1 с БЮг-гидрогелем, добавляли дистиллированной воды и проводили диспергирование при частоте 22 кГц и мощности излучения 300 Вт в течение 30 мин. в водоохлаждаемой емкости. Полученную суспензию МУНТ-1 фильтровали, и использовали для приготовления биокатализаторов. Оптимальный состав биокатализаторов был следующим, мас%: клеточные лизаты гЕ.со///Пр - 40-60, мальтодек-трин - 10, наноуглерод - 0-10, остальное -БЮ2. Оптимальная влажность гранул 6-10%. Размер гранул биокатализаторов составил 11,5 мм.
В данной работе авторы использовали реакцию гидролиза трибутирина до масляной кислоты как тестовую для количественного определения и сравнения активности приготовленных биокатализаторов. Реакцию гидролиза трибутирина проводили при 20-22 оС и интенсивном встряхивании реакционной смеси следующего состава: 0,2 М трибутирин, 1,2 М глицерин, 0,6% гуммиарабик, 0,02 М фосфатный буфер, рН 7,0. Кинетику реакции гидролиза
трибутирина изучали методом отбора проб реакционной среды в начальный период времени (в течение 1-5 мин). Эмульсии триглицеридов не стабильны, и через 15-20 мин. наблюдалось укрупнение «масляных» частиц и расслоение реакционной среды на две фазы. Концентрацию образующейся бутановой (масляной) кислоты определяли титриметрически на установке, состоящей из рН-метра, блока автоматического титрования БАТ-15 и бюретки, заполненной титрантом - раствором NaOH с известной нормальностью. После завершения каждого реакционного цикла биокатализаторы оставляли в реакционной среде на 1-3 сут., затем среду сливали, катализатор отмывали буфером рН 7,0 и заливали свежей эмульсией трибути-рина, и снова следили за кинетикой гидролиза субстрата. За единицу ферментативной активности (ЕА) принимали скорость реакции, равную 1 мкмоль/мин. Активность выражали в ЕА на 1 г биокатализатора.
Переэтерификацию масложировых смесей (МЖС) проводили в периодическом режиме. Состав масложировых смесей был следующим: 23 вес.ч. растительного (подсолнечного, соевого, оливкового) масла и 1 вес.ч полностью гидрированного масла - саломаса. Для определения активности и операционной стабильности приготовленных биокатализаторов переэтерифи-кацию масложировых смесей осуществляли в специально созданной установке, состоящей из проточного стального колоночного реактора, заполненного смесью сухих гранул биокатализатора размером 0,5-1,5 мм и гранул силикаге-ля КСК-Г такого же размера (насадка) в объемном соотношении 3 : 1, резервуара с масложи-ровой смесью, насоса. Температуру в резервуаре МЖС и реакторе поддерживали 70-75 оС. Через неподвижный слой прокачивали субстрат МЖС со скоростью 0,12 мл/мин. в течение 810 ч, собирая пробы для анализа (по 20 мл) в течение 3 ч. Затем поток МЖС останавливали, реактор охлаждали до 20-22 оС, при этом МЖС и биокатализатор застывали непосредственно в реакторе. Через 10-12 ч начинали следующий реакционный цикл, вновь нагревая резервуар и реактор до температуры 70-75 оС. Суммарное время работы активного биокатализатора в реакторе составило 120 ч. Для определения и сравнения активности нескольких катализаторов, приготовленных в абсолютно одинаковых условиях, реакцию переэтерификации проводили следующим образом: в пробирки с масло-жировой смесью, разогретые до 70 °С, вносили навески (0,3-0,5 г) катализаторов и помещали в термостат при 70 °С, периодически перемешивая содержимое пробирок.
Анализ продуктов переэтерификации
МЖС осуществляли следующими методами. Экспресс-анализ проводили по кривым изменения температуры при охлаждении предварительно разогретых на водяной бане (70 оС) исходных масложировых смесей и переэтерифи-цированных продуктов. Для пиков, наблюдаемых на кривых охлаждения, определяли разность температур AT. В процессе переэтерифи-кации уменьшалась твердость продуктов реакции, и соответственно уменьшались температура плавления и величина AT. Содержание твердых триглицеридов (ТТГ) измеряли с помощью импульсной ЯМР-спектроскопии на приборе Proton 20M (Хроматэк, Россия). Конверсию х (в %) определяли по изменению количества ТТГ, измеренном при 35 оС, по уравнению:
х =
Co - C Co '
где С0 - содержание ТТГ в исходной смеси до реакции, мас%;
С - содержание ТТГ в продуктах реакции, мас%.
Конверсию в диапазоне 10-40% оценивали по эмпирической формуле
х = 56 - 11 •ДГ.
Для реакции переэтерификации для получения биодизеля использовали смеси подсолнечного масла с этилацетатом в мольным соотношении масла и ацилирующего агента в диапазоне 1 : 2325. В качестве со-растворителя использовали н-гексан. Периодический процесс переэтерифи-кации осуществляли при 40 оС в реакторе смешения следующим образом. Навеску биокатализатора (0,3-0,5 г) заливали реакционной средой (10-20 мл), и при перемешивании с помощью качалки (при 120-150 об/мин), проводили реакцию в течение от 5 ч до 6 сут.
Анализ продуктов реакции переэтерифика-ции - этиловых эфиров жирных кислот - осуществляли методами газовой (ГХ) и тонкослойной (ТСХ) хроматографий, условия проведения данных анализов описаны в работе [3]. В методе ТСХ использовали пластинки с нанесенным тонким слоем SiO2 (марок Silufol, Сорбфил) и хроматографическую камеру с растворителем следующего состава, в об.%: гексан / диэтило-вый эфир / уксусная кислота = 80 / 20 / 1. После хроматографирования исходных и реакционных смесей пластинки высушивали, затем проявляли в 5%-ом растворе фосфомолибденовой кислоты в этаноле с последующим прогреванием. Для полуколичественного определения активности приготовленных биокатализаторов использовали площадь пятна (в мм2) эфиров
жирных кислот на ТСХ-пластинках. Качественный и количественный состав эфиров жирных кислот определяли методом ГХ с использованием внутреннего стандарта - гексанола, и с учетом калибровочных коэффициентов, найденных экспериментально для набора этиловых эфиров жирных кислот - пальмитиновой (16 : 0), стеариновой (18 : 0), олеиновой (18 : 1) и линолевой (18 : 2). Расчет выхода продуктов - эфиров жирных кислот - проводили по данным ГХ, учитывая тот факт, что для приготовления биокатализатора использовали рекомби-нантную липазу Т. /апид/повив, специфичную к 1,3-связям в молекулах триглицеридов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Приготовление биокатализаторов биоконверсии триглицеридов. Было установлено, что сконструированный рекомбинантный штамм гЕ.соИМр обеспечивал индуцируемый ИПТГ синтез термостабильной липазы из Т/апид/повив, М.м. ~30 кДа (рис. 1), в количестве 30-40% от суммарного белка клетки. По данным анализа, до 70% от общего количества синтезированного фермента локализовано в субклеточных фракциях клеток гЕ.со//Л\р в ассоциированной с мембранами форме. В тельцах включения, а также в цитоплазме фермент обнаруживается в количествах ~10% и ~20% соответственно.
Клеточные лизаты гЕ.со//Л\р с активностью липазы 7-10 тыс. ЕА / мл суспензии были использованы для приготовления твердых гранулированных биокатализаторов. Из табл.1 видно, что биокатализаторы, приготовленные на
основе клеточных лизатов гЕ.со///Ир, обладают максимальной активностью, в ~4 и ~2 раза превышающей активность биокатализаторов, приготовленных на основе целых (или частично-разрушенных) клеток рекомбинантного штамма гЕ.со/'//\\р и фермента соответственно.
Следует отметить, что метод приготовления, разработанный авторами данной статьи и основанный на применении золь-гель процессов, позволяет получить новые материалы -неоргано-органические композиты. В данном случае неорганической матрицей является БЮ2-ксерогель. Органическая фаза состоит из частично или полностью разрушенных клеток микроорганизмов, обладающих ферментативной активностью и равномерно распределенных в неорганической матрице как наноразмер-ные включения другой фазы. Именно эти включения придают материалам практически важные свойства, в данном случае, ферментативную активность. Метод является достаточно простым и универсальным по отношению к природе компонентов, вводимым в состав композитных биокатализаторов, а также к таксономической принадлежности микроорганизмов -различные бактерии (кишечная палочка, артро-бактер, родококки), дрожжи. В БЮ2-ксерогель можно вводить компоненты, исполняющие в биокатализаторах определенную функциональную роль:
1) активаторы и/или стабилизаторы ферментов (например, Сох0у для глюкозоизомера-зы);
2) влагоудерживающие агенты;
3) наноструктурированный углерод [11].
12 3 4
Рис. 1. Электрофореграммы фракций лизатов рекомбинантного штамма rE.coli/lip: 1 - белки-маркёры молекулярного веса 17кДа, 22 кДа, 29 кДа и 38 кДа; 2 - цитоплазматическая фракция; 3 - фракция телец включения; 4 - белок рекомбинантной липазы из T. Lanuginosus, очищенный аффинной хроматографией на Ni-NTA-сефарозе CL-6B
Рис. 2. Электронно-микроскопические изображения сколов композитных биокатализаторов
с введенным наноуглеродным компонентом: 1 - МУНТ-2; 2 - МУНТ-1; 3 - НУЛС-2 (на вставке изображена наностуктура НУЛС, полученная с использованием просвечивающего электронного микроскопа)
Выбор оптимального состава многокомпонентных биокатализаторов осуществляли при одновременном выполнении двух основных условий:
1) максимальная биокаталитическая активность в условиях реакции гидролиза (в водных средах рН 7) или переэтерификации (в безводных реакционных средах с содержанием воды ~0,1—1%);
2) высокая механическая прочность гранул, обеспечивающая стабильную работу биокатализаторов в условиях реакционной среды. Например, было показано, что для выполнения описанных выше условий необходимо, чтобы
Гидролиз трибутирина. Были проведены сравнительные исследования по влиянию на-ноуглеродного компонента, вводимого в состав биокатализаторов, на их свойства - ферментативную активность и стабильность. Из табл. 1 видно, что независимо от природы активного компонента (клетки, лизаты, фермент) при введении наноуглерода в состав биокатализаторов их гидролитическая активность уменьшается, причем наиболее сильное снижение активности наблюдается при введении в биокатализаторы диспергированных МУНТ, наиболее равномерно распределенных в объеме SiO2-матрицы. Так, активность биокатализаторов, приготов-
количество связующего SiO2 было не меньше 40%, наноуглеродного компонента - не более 15%. Оптимальный состав исследованных биокатализаторов был следующим, в мас.% по сухим веществам: клеточные лизаты rE.сoli/lip -40 + 60, мальтодекстрины - 5-10, наноуглерод - 0 ^10, остальное SiO2. Содержание «внутренней» воды в биокатализаторах составляло 6-10%.
Электронно-микроскопические исследования композитных биокатализаторов, приготовленных на основе клеточных лизатов rE.сoli/lip, показали, что наноуглеродные компоненты включены в структуру SiO2-ксерогеля (рис. 2). ленных на основе фермента, при введении агрегированных и диспергированных углеродных нанотрубок снижается в ~2-4 и в~20 раз соответственно. Было установлено, что основная причина снижения наблюдаемой ферментативной активности липазы заключается в том, что при адсорбции липазы на гидрофобном углеродном носителе наиболее вероятной является неправильная ориентация фермента, в результате чего активный центр фермента блокируется углеродной поверхностью МУНТ и образование фермент-субстратного комплекса затрудняется. Другой причиной может быть прочная адсорбция гидрофобного субстрата («масла»)
Таблица 1
Активность приготовленных композитных биокатализаторов в реакции гидролиза трибутирина в зависимости от природы активного компонента, _а также от природы и дисперсности наноуглеродного компонента_
Активность биокатализаторов в зависимости
Наноуглерод, введенный в состав от при роды активного компонента
биокатализатора в количестве 10 мас% Частично разрушенные клетки rE.сoli/lip Клеточные лизаты rE.сoli/lip Фермент липаза
Без наноуглерода Агрегаты МУНТ-1 Агрегаты МУНТ-2 НУЛС-1 210 220 250 106 870 1040 870 710 510 120 260
Диспергированные МУНТ-1 50 400 25
цикла
Рис. 3. Стабильность композитных биокатализаторов, приготовленных на основе клеточныхлизатов гЕ.соП/Нр, в реакции гидролиза трибутирина в зависимости от природы и дисперсности наноуглеродного компонента, введенного в состав биокатализатора: 1 - диспергированные МУНТ-1; 2 - НУЛС-1; 3 - без наноуглерода (контроль); 4 - агрегаты МУНТ-2
на гидрофобной поверхности МУНТ. Было обнаружено, что максимальной удельной активностью обладает липаза в плотном монослое, образованной из адсорбированных молекул, а также липаза, адсорбированная на гидрофильной поверхности силикагеля (аэросила) [4].
Было обнаружено, что введение наноугле-родного компонента влияет не только на активность, но и на стабильность биокатализаторов. Стабильность МУНТ-содержащих биокатализаторов была сравнительно высокой. Так, после проведения 7 циклов реакции (по 24 ч каждый), биокатализаторы сохранили > 50% активности свежеприготовленных биокатализаторов (рис. 3). Биокатализаторы, содержащие агрегаты МУНТ-2 и НУЛС-1, а также контрольные (без углерода), монотонно теряли активность в последующих циклах периодического процесса
гидролиза (рис. 3, кривые 2-4). Активность биокатализаторов, содержащих диспергированные МУНТ-1, после 4-го реакционного цикла была постоянной и равной 26 ЕА/г (рис. 3, кривая 1). Интересно, что во 2-ом реакционном цикле для биокатализаторов, в состав которых был введен наноуглеродный компонент, наблюдали скачкообразное повышение активности (рис. 3, кривые 1, 2 и 4). Это можно объяснить тем, что МУНТ способны эффективно адсорбировать триглицериды, в результате чего внутри биокатализаторов, в микроокружении липазы, формируется локальное «депо» субстрата.
При исследовании МУНТ было обнаружено, что при увеличении количества трибутирина в воде углеродные нанотрубки, изображенные на рис. 4 а, при встряхивании быстро агрегируют и образуют крупные агрегаты округлой фор-
Рис. 4. Углеродные нанотрубки и их гидрофобность: а - электронно-микроскопический снимок МУНТ-1, полученный с использованием просвечивающего электронного микроскопа; б - абсорбция трибутирина тонкодисперсными порошками МУНТ при увеличении количества трибутирина в воде
12 3 4
Реакционные циклы (по 5 час каждый) Рис. 5. Стабильность композитных биокатализаторов, приготовленных на основе клеточныхлизатов гЕ.соП/Пр, в реакции переэтерификации масложировых смесей в зависимости от природы и дисперсности наноуглеродного компонента, введенного в состав биокатализатора: 1 - диспергированные МУНТ-1; 2 - агрегаты МУНТ-2;
3 - без наноуглерода (контроль)
Таблица 2
Сравнительная активность (в отн. ед) приготовленных биокатализаторов в реакции _переэтерификации триглицеридов растительного масла_
Наноуглерод, введенный в состав биокатализатора в виде агрегатов* Переэтерификация масложировых смесей Синтез этиловых эфиров жирных кислот подсолнечного масла
Без наноуглерода 1,0 1,0
МУНТ-2 0,9 1,0
МУНТ-1 0,9 0,8
НУЛС-2 - 0,8
НУЛС-1 0,5 0,4
* наноуглеродный компонент не повергался предварительному диспергированию
мы (рис. 4, б). Это значит, что углеродные на-нотрубки способны эффективно ад(б)сорби-ровать гиброфобное соединение - трибутирин. По-видимому, при введении в гидрофильную силикатную матрицу агрегатов гидрофобных МУНТ был достигнут оптимальный гидрофобно-гидрофильный «баланс» внутри биокатализаторов, что привело к увеличению гидролитический активности в 1,3-1,5 раз по сравнению с биокатализаторами без углерода. В дальнейшем, для приготовления биокатализаторов использовали агрегированные формы наноугле-родного компонента.
Переэтерификация масложировых смесей. При исследовании влияния наноуглеродного компонента, вводимого в состав биокатализаторов, приготовленных на основе клеточных лизатов гЕ.со/i/lip, в реакции переэтерификации масложировых смесей было показано, что максимальной начальной активностью об-
ладали биокатализаторы без наноуглерода (рис. 5, табл. 2). Кривые инактивации данных биокатализаторов хорошо описывались экспо-нентой 1 -го порядка с константой инактивации 1,7-10"4-1,5 10-3 с-1 (рис. 5).
Переэтерификация растительного масла этилацетатом. Было установлено, что максимальная скорость переэтерификации наблюдалась при мольном соотношении масла и этилацетата, равном 1 : (15 + 20) [3]. Максимальной активностью в изученных условиях обладали биокатализаторы, в составе которых не было наноуглерода и биокатализаторы, содержащие агрегаты МУНТ-2 (табл. 2). Для определения операционной стабильности приготовленные биокатализаторы тестировали в течение 5 реакционных циклов (720 ч) (рис. 6). Биокатализаторы, в состав которых был введен НУЛС-1 («мелкий»), проявляли самую низкую начальную активность и стабильность. Так, этот
эфиры жирных кислот
глицериды масла
Продолжительность работы биокатализаторов, ч
Рис. 6. Операционная стабильность биокатализаторов в реакции получения эфиров жирных кислот с введенным наноуглеродным компонентом: 1 - НУЛС-2; 2 -МУНТ-1; 3 - МУНТ-2; 4 - без наноуглерода. ТСХ-пластинка реакционной среды после 720 ч работы биокатализаторов
Состав среды: 0.1 М масло; 2.3 М этилацетат, гексан. 150 об/мин, 40 оС Состав биокатализаторов,%: клеточные лизаты - 57; наноуглерод - 7; SiO2- 36
Продолжительность работы биокатализатора, час Продолжительность работы биокатализатора, час
Рис. 7. Операционная стабильность биокатализаторов: а - в процессе переэтерификации масложировой смеси б - в процессе переэтерификации подсолнечного масла этилацетатом Состав биокатализаторов, в %: клеточные лизаты гЕ.соИ/Ир - 30-38, мальтодекстрин - 10-12, остальное Э102
композитный биокатализатор потерял активность в течение 1-го реакционного цикла (144 ч), и во 2-ом реакционном цикле скорость реакции была равной нулю. Биокатализатор, в состав которого были введены агрегаты МУНТ-2; сохранил до 75% первоначальной активности (рис. 6, кривая 3). Результаты ТСХ-анализа продуктов реакции, в том числе эфиров жирных кислот, после 720 ч работы биокатализаторов приведены на рис. 6.
Были проведены сравнительные исследования операционной стабильности приготовленных биокатализаторов, обладающих оптимальным составом, в процессах переэтерифи-кации триглицеридов растительных масел. Процесс переэтерификации МЖС проводили в течение 120 ч, процесс получения эфиров жирных кислот - более 1000 ч (рис. 7). Время полуинактивации биокатализатора в условиях реакции переэтерификации мЖс составило ~70 ч
при 70-75 оС (рис. 7, а). Если оценить время стационарной работы биокатализатора до его полной инактивации, то продолжительность работы в изученных условиях составит ~600 ч. В условиях получения биодизеля (40 оС) константа инактивации (кин) биокатализатора составила 1,6 10-5 с-1, что на ~2 порядка меньше кин в реакции переэтерификации в масложиро-вых смесях (70оС). Время полуинактивации биокатализатора в этом процессе ~720 ч при 40 оС (рис. 7, б). По данным газовой хроматографии, суммарные выходы эфиров жирных кислот (14 : 0, 16 : 0, 18 : 1, 18 : 2), через 260 ч и 600 ч работы биокатализатора составили 60% и 35% соответственно.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Были проведены систематические исследования твердых биокатализаторов, приготовленных для процессов биоконверсии триглеци-ридов растительных масел в ценные продукты. Для данных исследований были получены следующие результаты.
Методами генетической инженерии был сконструирован рекомбинантный штамм rE.co//>lip, продуцирующий термостабильную липазу из Thermomyces /anuginosus в количестве 30-40% от суммарного белка. Синтезируемая штаммом rE.co/i/lip фермент локализован в
1. Девянин С.Н., Марков В.А., Семенов В.Г. Растительные масла и топлива на их основе для дизельных двигателей. М., 2008. 400 с.
2. Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Беклемишев А.Б., Ткаченко В.И. // Биотехнология. 2013. № 6. С. 35.
3. Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Беклемишев А.Б., Яковлева Е.Ю., Пыхтина М.Б. // Катализ в промышленности. 2014. № 6. С. 71.
4. Коваленко Г.А., Перминова Л.В., Чуенко Т.В., Рудина Н.А., Мосеенков С.И., Кузнецов
B.И. // Кинетика и катализ. 2013. Т. 54. № 6.
C. 792.
5. Akoh C.C., Chang Shu-Wei, Lee Guan-Chiun, Shaw Jei-Fu // J. Agr. Food Chem. 2007. V. 55 (22). Р. 8995.
6. Akhil Bajaj, Purva Lohan, Prabhat N. Jha, Rajesh Mehrotra // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2010. V. 62. P. 9.
7. Ching T. Hou. Handbook of industrial catalysis. Taylor&Francis Group, 2005. 500 p.
ассоциированной с мембранами субклеточной фракции (до 70%). Клеточные лизаты rE.co/i/lip были использованы для приготовления твердых биокатализаторов с активностью термостабильной липазы.
Биокатализаторы были приготовлены путем включения клеточных лизатов rE.co/i/lip в композитные матрицы на основе SiO2-ксерогеля. Изучена функциональная роль каждого вводимого компонента, в том числе нано-структурированного углерода, и подобран оптимальный состав многокомпонентных биокатализаторов, в масс% : клеточные лизаты -40-60, мальтодекстрин (влагоудерживающий агент) - 10, многослойные углеродные трубки в агрегированном состоянии - 0-10, остальное SiO2 до 100.
Ферментативная активность и стабильность биокатализаторов были изучены в процессах гидролиза трибутирина и переэтерифи-кации триглицеридов растительных масел. Было найдено, что время полуинактивации приготовленных биокатализаторов в периодических процессах переэтерификации триглицеридов подсолнечного масла этилацетатом с образованием этиловых эфиров жирных кислот (биодизеля) и в масложировых смесях составили, соответственно, 720 ч и 70 ч при 40 оС и 70 оС.
ЖИЙ СПИСОК
8. DiCosimo R., McAuliffe J., Poulose A. J., Bohlmann G. // Chem Soc Rev. 2013. V. 42 (15). P. 6434.
9. Hatfield G. W., Roth D.A. // Biotechnology Annual Review. 2007. V. 13. P. 27.
10. Hernandez-Martin E., Otero C. // Bioresource Technol. 2008. V. 99 (2). P. 277.
11. Kovalenko G.A., Beklemishev A.B., Perminova L.V., Mamaev A.L., Rudina N.A., Moseenkov S.I., Kuznetsov V.L. // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2013. V. 98. P. 78.
12. Stoytcheva M., Montero G., Toscano L., Gochev V., Va/dez B. // Biodiesel - Feedstocks and Processing Technologies. 2011. P. 397.
13. Wei Du, Yuanyuan Xu, Dehua Liu, Jing Zeng // J. Mol. Catal. B: Enzym. 2004. V. 30. P. 125.
14. Zi Jin , Shuang-Yan Han, Li Zhang, Sui-Ping Zheng, Yong Wang, Ying Lin // Bioresource Technology. 2013. V. 130. P. 102.
REFERENCES
1. Devyanin S.N., Markov V.A., Semenov V.G. Rastitel'nye masla i topliva na ikh osnove dlya dizelnykh dvigatelei [Vegetable oils and diesel fuels based on them]. Moscow, 2008, 400 p.
2. Kovalenko G.A., Perminova L.V., Beklemishev A.B., Nkachenko V.I. Biotechno/ogya - Biotechno/ogy in Russia, 2013, no. 6, p. 35. (in Russ.)
3. Kovalenko G.A., Perminova L.V., Beklemishev A.B., Yakovleva E.Yu., Pykhtina M.B. Kataliz v promyshlennosti - Catalysis in Industry, 2014, no. 6, p. 71. (In Russ.)
4. Kovalenko G.A., Perminova L.V., Chuenko T.V., Rudina N.A., Moseenkov S.I., Kuznetsov V.L. Kinetika i kataliz - Kinetics and Catalysis, 2013, vol. 54, no. 6, p. 792. (In Russ.)
5. Akoh C.C., Chang Shu-Wei, Lee Guan-Chiun, Shaw Jei-Fu. J. Agr. Food Chem, 2007, vol. 55 (22), p. 8995.
6. Akhil Bajaj, Purva Lohan, Prabhat N. Jha, Rajesh Mehrotra. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2010, vol. 62, p. 9.
7. Ching T. Hou. Handbook of industrial catalysis. Taylor&Francis Group, 2005, 500 p.
8. DiCosimo R., McAuliffe J., Poulose A.J., Bohlmann G. Chem. Soc. Rev., 2013, vol. 42 (15), p. 6434.
9. Hatfield G. W., Roth D.A. Biotechnol. Annual Review, 2007, vol. 13, p. 27.
10. Hernandez-Martin E., Otero C. Bioresource Technol., 2008, vol. 99 (2), p. 277.
11. Kovalenko G.A., Beklemishev A.B., Perminova L.V., Mamaev A.L., Rudina N.A., Moseenkov S.I., Kuznetsov V.L. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2013, vol. 98, p. 78.
12. Stoytcheva M., Montero G., Toscano L., Gochev V., Valdez B. Biodiesel - Feedstocks and Processing Technologies, 2011, p. 397.
13. Wei Du, Yuanyuan Xu, Dehua Liu, Jing Zeng. J. Mol. Catal. B: Enzym., 2004, vol. 30, p. 125.
14. Zi Jin , Shuang-Yan Han, Li Zhang, Sui-Ping Zheng, Yong Wang, Ying Lin. Bioresource Technol., 2013, vol. 130, p. 102.
Поступила в редакцию 14 апреля 2015 г. После переработки 13 мая 2015.
