CC BY
18УДК 616-074:616-002:616-092.4:616-091.8
БИОХИМИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ ИНТЕНСИВНОСТИ СИСТЕМНОЙ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ В ОЦЕНКЕ БИОСОВМЕСТИМОСТИ СКАФФОЛДОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИКАПРОЛАКТОНА И ВАТЕРИТА
Е.А. Галашина1, Ю.А. Чибрикова2, А.Н. Иванов1, Е.В. Гладкова1, И.А. Норкин1
1 НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов
2 ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов
Резюме. В работе определяли динамику параметров системной воспалительной реакции в оценке биосовместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита. Выявлены повышение уровня СРБ на 7-е сутки и отсутствие изменений ФНО-а и ИЛ-10 на 7-е и 21-е сутки, что свидетельствует о сла-бовыраженной непродолжительной воспалительной реакции и является патогенетической составляющей биосовместимости матриц.
Ключевые слова: скаффолды, поликапролактон, ватерит, системный воспалительный ответ. Для цитирования: Галашина Е.А., Чибрикова Ю.А., Иванов А.Н., Гладкова Е.В., Норкин И.А. Биохимические параметры интенсивности системной воспалительной реакции в оценке биосовместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита // Вестник медицинского института «Реавиз». -2020. - № 2. - С. 98-103.
BIOCHEMICAL PARAMETERS OF THE INTENSITY OF SYSTEMIC INFLAMMATORY RESPONSE IN THE ASSESSMENT OF BIOCOMPATIBILITY OF POLYCAPROLACTONE/VATERITE SCAFFOLDS
E.A. Galashina1, Yu.A. Chibrikova2, A.N. Ivanov1, E.V. Gladkova1, I.A. Norkin1
1 Research Institute of Traumatology, Orthopedics, and Neurosurgery, Federal State Budgetary Institution of Higher Education 'V.I. Razumovsky Saratov State Medical University,' Ministry of Health of the Russian Federation, Saratov
2 Federal State Budgetary Institution of Higher Education 'V.I. Razumovsky Saratov State Medical University,' Ministry of Health of the Russian Federation, Saratov
Abstract. In this study, we analyzed biocompatibility of polycaprolactone/vaterite scaffolds by assessing the dynamics of systemic inflammatory response. We detected an increase in the CRP level after 7 days and no changes in the level TNF-a and IL-10 after 7 and 21 days, which indicates a weak and short-term inflammatory reaction and is a pathogenetic component of matrix biocompatibility.
Key words: scaffolds, polycaprolactone, vaterite, systemic inflammatory response.
For citation: Galashina E.A., Chibrikova Yu.A., Ivanov A.N., Gladkova E.V., Norkin I.A. Biochemical parameters of the intensity of systemic inflamma-tory response in the assessment of biocompatibility of poly-caprolactone/vaterite scaffolds // Bulletin of Medical Institute Reaviz. - 2020. - № 2. - P. 98-103.
Введение
В настоящее время одним из важнейших направлений медицины, в частности, травматологии и ортопедии, является создание композитных материалов, представляющих собой трёхмерные пористые структуры, которые позволяют решить проблему замещения утраченных тканей, а
также моделировать биомеханические свойства имплантируемой конструкции, что является одним из ключевых моментов тканевой инженерии. Для стимуляции регенерации костной ткани перспективным представляется использование различных материалов с высокой степенью механической прочности, устойчивости, способно-
стью к управляемой биорезорбции [1, 2]. Одним из таких синтетических материалов является поликапролактон, который обладает хорошими адгезивными, пролифера-тивными свойствами и способен к медленной деградации в организме реципиента [3]. Кроме того, учитывая высокую степень минерализации межклеточного вещества для структурного восстановления участка поврежденной ткани включают ватерит, обладающий высокой способностью к пролиферации и дифференцировки остеобластов [4]. Важным условием, предъявляемым к скаффолдам, является их биологическая совместимость, то есть способность к заселению клетками и васкуляризации, отсутствие иммунологического отторжения. Сроки биодеградации матриксов должны быть сопоставимы со сроками регенерации костной ткани, а продукты их биологического разложения не должны оказывать токсического воздействия на организм [5, 6]. Одним из патогенетических аспектов биологической совместимости матриц является интенсивность проявлений локальной воспалительной реакции, возникающей при субкутанных импланта-ционных тестах у крыс [7]. Представляется актуальным изучить уровни некоторых провоспалительных цитокинов, белка острой фазы в сыворотке крови при подкожной имплантации поликапролактоно-вых скаффолдов, минерализованных вате-ритом для оценки выраженности системного воспалительного ответа.
Цель: выявить значимые изменения маркеров системного воспалительного ответа для оценки биологической совместимости скаффолдов на основе поликапро-лактона и ватерита.
Материалы и методы
Эксперимент был проведён на 40 белых нелинейных крысах массой 200-250 г, которые были разделены на 4 равнозначные группы по 10 особей в каждой. Группа сравнения - 10 ложнооперированных живот-
ных, которым проводилось хирургическое вмешательство в полном объеме, включающее в себя формирование «кармана» в подкожной клетчатке и наложение швов; группа отрицательного контроля - 10 животных, которым имплантировался скаф-фолд на основе поликапролактона с адсорбированным чужеродным белком с целью провокации воспалительной реакции, не обладающий биосовместимостью; опытная группа - 10 крыс, которым субкутанно имплантировался поликапролактон/ватерит-скаффолд; контрольная группа - 10 ин-тактных крыс. Эксперимент проводился в соответствии с «Хельсинской декларацией по вопросам медицинской этики» (1964) и документом «Положение об использовании животных в биомедицинских исследованиях», принятым 41-й Генеральной Ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1989). Всем животным перед выполнением манипуляций вводилась внутримышечно комбинация препаратов телазола («Zoetis Manufacturing & Research Spain, S.L.», Испания) в дозе 0,1 мл/кг и ксизалина («Interchemie», Нидерланды) в дозе 1 мг/кг.
Для осуществления эксперимента проводили разрез предварительно депилиро-ванной и обработанной антисептиком кожи межлопаточной области крыс. Далее скаф-фолд в форме диска диаметром 10 мм имплантировался в подкожно-жировую клетчатку, после чего в третьей и четвертой группах на рану накладывались швы. Животным второй группы проводилось полное по объёму хирургическое вмешательство, но без имплантации скаффолда. На 7-е и 21-е сутки после имитации имплантации матриц у ложнооперированных животных под наркозом проводился забор крови путём пункции правых отделов сердца. Забор крови осуществлялся в пробирки Vacuette в объёме 5 мл с активатором свёртывания и разделительным гелем. Для получения сыворотки крови производили центрифугирование при 3000 об/мин 600 секунд, после чего полученные образцы замораживали и хранили при температуре -20 °С. Выведение
животных из опыта осуществляли путём передозировки препаратов для наркоза.
Для оценки системного воспалительного ответа проводилось определение в сыворотке крови экспериментальных животных концентраций фактора некроза опухоли -альфа (ФНО-а), интерлейкина-1-бета (ИЛ-lß) и С-реактивного белка (СРБ) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием наборов реактивов «IL-1ß rat», «TNF-a rat» и «Rat C-Reactive Protein ELISA» (eBioscience, Invitrogegen by Thermo Fisher Scientific, США). ИФА выполнялся на микропланшетном спектрофотометре An-thos 2020 (Biochrom, Великобритания).
Статистическую обработку полученных данных осуществляли при помощи пакета программ Statistica 10.0. Большинство наших данных не соответствовало закону нормального распределения, поэтому для сравнения значений использовался У-критерий Манна-Уитни, на основании которого рассчитывали Z-критерий и показатель достоверности различия p. Различия считали значимыми при р < 0,05.
Результаты
Для оценки системных проявлений воспалительной реакции в организме белых крыс проводилось сопоставление концентраций провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-lß) и СРБ в сыворотке крови, забранной на 7-е и 21-е сутки эксперимента у животных групп сравнения, отрицательного контроля и опытной группы с аналогичными показателями интактной группы.
В результате проведённых исследований установлено, что у ложнооперирован-ных животных на 7-е сутки исследования не отмечается статистически значимых изменений концентрации изученных провоспа-лительных цитокинов (р > 0,05) в сыворотке крови, однако, зафиксировано статистически достоверное повышение содержания СРБ в 1,19 раз (р < 0,05) в сыворотке крови
по сравнению с животными контрольной группы. К 21-м суткам исследования концентрации ФНО-а, ИЛ-1Р и СРБ в группе сравнения не имели статистически значимых отличий от уровня изучаемых параметров у интактных крыс (р > 0,05), однако, отмечено снижение уровня СРБ по сравнению с данными, полученными на 7-е сутки эксперимента (р < 0,05) (табл. 1).
У животных группы отрицательного контроля через 7 суток после имплантации скаффолдов, не обладающих биосовместимостью, по отношению к данным группы интактных животных концентрации ФНО-а, ИЛ-1Р статистически значимо повышались в 1,69 раз (р < 0,05) и в 1,79 раз (р < 0,05); по сравнению с данными группы ложноопери-рованных животных уровни ФНО-а и ИЛ-1Р статистически достоверно увеличились в 2,01 раз (р < 0,05) и в 1,91 раз (р < 0,05). Содержание СРБ повысилось в 1,66 раз (р < 0,05) как по сравнению со значениями, зарегистрированными у группы контроля, так и в 1,39 раз (р < 0,05) по отношению к данным группы сравнения. На 21-е сутки эксперимента по сравнению с контрольными значениями зафиксировано статистически достоверное повышение уровней ФНО-а, ИЛ-10 в 1,65 раз (р < 0,05) и в 1,71 раз (р < 0,05); по отношению к группе сравнения концентрации ФНО-а и ИЛ-1Р статистически достоверно увеличились в 2,18 раз (р < 0,05) и 1,85 раз (р < 0,05), кроме того, по сравнению с данными, полученными на 7-е сутки эксперимента статистически достоверных изменений не обнаружено. Уровень СРБ по сравнению со значениями группы контроля статистически достоверно повысился в 1,26 раз (р < 0,05), по сравнению с данными группы ложнооперированных животных в 1,18 раз (р < 0,05), кроме того, зафиксировано снижение уровня СРБ в 1,32 раз (р < 0,05) по сравнению с данными, полученными на 7-е сутки эксперимента.
Таблица 1
Концентрация маркеров системного воспалительного ответа в сыворотке крови экспериментальных животных
Группы Показатели
ФНО, пг/мл ИЛ-1, пг/мл СРБ, мг/л
Контроль (п = 8) 9,5 (5,6; 11,6) 16,1 (13,9; 16,6) 101,37 (96,78; 114,51)
Группа сравнения 7-е сутки (п = 6) 7,97 (6,76;9,19) р1 = 0,795150 15,1 (13,6; 19,6) р1 = 0,948362 120,37 (118,44; 126,81) р1 = 0,028460
Группа сравнения 21-е сутки (п = 6) 7,2 (6,8; 8,4) Р1 = 0,561276 р2 = 0,810181 14,9 (14,2; 15,6) Р1 = 0,401388 р2 = 0,688921 108,33 (106,48; 117,74) р1 = 0,641635 р2 = 0,008114
Отрицательный контроль 7-е сутки (п = 8) 16,05 (13,6;17,67) р1 = 0,001591 рз = 0,002415 28,8 (21,6;34,5) р1 = 0,001337 р3 = 0,005458 168 (131,7; 203,4) р1 = 0,005075 р3 = 0,008114
Отрицательный контроль 21-е сутки (п = 9) 15,7 (12,4; 16,5) Р1 = 0,002437 р2 = 0,312322 рз = 0,001790 27,5 (23,6; 31,5) Р1 = 0,000636 р2 = 0,847390 Р3 = 0,001790 127,48 (125,9;129,8) р1 = 0,003885 р2 = 0,029240 р3 = 0,001790
Опытная группа 7-е сутки (п = 8) 9,19 (4,3;10) р1 = 0,487454 р3 = 0,943057 р4 = 0,001460 16,1 (13,6;17,1) р1 = 0,847390 р3 = 0,943057 р4 = 0,001780 126,9 (108,3; 129,78) р1 = 0,041362 р3 = 0,769698 р4 = 0,008132
Опытная группа 21-е сутки (п = 7) 7,6 (3,5; 8,4) Р1 = 0,332922 р2 = 0,617075 Р3 = 1,000000 Р4 = 0,003885 16,6 (12,2; 18,1) Р1 = 0,948533 р2 = 0,775097 Р3 = 0,630954 Р4 = 0,001790 106,48 (102,3; 109,7) р1 = 0,830324 р2 = 0,093339 р3 = 0,617075 р4 = 0,001033
У белых крыс опытной группы на 7-е сутки не отмечено статистически достоверного повышения содержаний изученных цитокинов (р > 0,05) в сыворотке крови как по сравнению с контролем, так и по отношению с данными группы сравнения (р > 0,05), кроме того, по сравнению со значениями группы отрицательного контроля зафиксировано снижение данных показателей в 1,75 раз (р < 0,05) и в 1,79 раз (р < 0,05). В эти же сроки концентрация СРБ статистически достоверно увеличилась в 1,25 раз (р < 0,05) в сыворотке крови по сравнению с данными контрольной группы, снизилась в 1,33 раз (р < 0,05) по сравнению с данными группы отрицательного контроля, кроме того, отсутствуют статистически достоверные различия по отношению к значениям группы сравнения. На 21-е сутки после имплантации скаффолдов из поика-пролактона и ватерита содержание ФНО-а, ИЛ-1Р и СРБ (р < 0,05) в сыворотке крови не
имеет отличий от такового у крыс групп сравнения и контроля (р < 0,05). Кроме того, нами обнаружено снижение уровней ФНО-а в 2,07 раз (р < 0,05), ИЛ-10 в 1,66 раз (р < 0,05) и СРБ в 1,20 раз (р < 0,05) в сыворотке крови крыс по сравнению с данными группы отрицательного контроля (табл. 1).
Обсуждение
Полученные нами данные демонстрируют, что при имитации имплантации матрицы отсутствие изменений уровней про-воспалительных цитокинов и слабо выраженные изменения содержания СРБ в сыворотке крови можно объяснить незначительными системными проявлениями реакций, происходящих в очаге воспаления, что связано с травматическими повреждениями при оперативном вмешательстве.
Проведённые нами исследования об изменении содержания провоспалительных цитокинов и СРБ в сыворотке крови белых
крыс при подкожной имплантации матриц, содержащих нативный овальбумин, совпадают с мнением исследователей о том, что стабильное увеличение концентрации СРБ в сыворотке крови связано с продукцией в ответ на чужеродный белок исследуемых про-воспалительных цитокинов, которые являются основными стимуляторами синтеза данного маркера в печени. Выраженное повышение уровней провоспалительных цитокинов и белка острой фазы в сыворотке крови с 7-х по 21-е сутки наблюдения является подтверждающим фактом развития системной воспалительной реакции, оказывающей влияние на организм в целом [8].
При имплантации скаффолдов из поликапролактона и ватерита, зафиксированное нами отсутствие изменений уровней ФНО-а, ИЛ-lß в сыворотке крови, повышение концентрации СРБ на 7-е сутки исследования, вероятно, может свидетельствовать о реакции окружающих мягких тканей в ответ на механическую травму при импланта-
ции скаффолда [9, 10]. У животных этой же группы снижение уровней изучаемых показателей в сыворотке крови на 21-е сутки по сравнению с группой отрицательного контроля в очередной раз подтверждает факт того, что имплантация данного вида композитного матрикса не вызывает возникновения интенсивной воспалительной реакции, а также участвует в структурном замещении дефекта и стимуляции остеогенеза.
Заключение
У белых крыс опытной группы отсутствие статистически значимых изменений уровней ФНО-а и ИЛ-1Р на 7-е и 21-е сутки исследования, незначительное повышение уровня СРБ на 7-е сутки в сыворотке крови свидетельствует о слабовыраженной непродолжительной воспалительной реакции, что является патогенетической составляющей биосовместимости скаффолдов на основе поликапролактона и ватерита.
Списоклитературы // References
1 Kotlyarova M.S. i dr. Biorezorbiruemye skaffoldy na osnove fibroina dlya regeneracii kostnoj tka-ni // Vest-nik Moskovskogo universiteta. Seriya Biologiya. - 2017. - № 72 (4). - S. 222-228.
2 Dolgalev A.A., Arakelyan N.G. Tkanevaya inzheneriya pri vosstanovlenii defektov kostnoj tkani / / Vestnik mo-lodogo uchyonogo. - 2018. - № 4. - S. 19-24.
3 Wang W., Huang B., Byun J.J. et al. Assessment of PCL/carbon material scaffolds for bone regeneration // Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. - 2019. - No 93. - Р. 52-60.
4 Schröder R., Besch L., Pohlit H. et al. Particles of vaterite, a metastable CaCO3 polymorph, exhibit high bio-compat-ibility for human osteoblasts and endothelial cells and may serve as a biomaterial for rapid bone regeneration // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2018. - No 12 (7). - Р. 1754-68.
5 Novochadov V.V. Problema upravleniya kletochnym zaseleniem i remodelirovaniem tkaneinzhenernyh ma-tric dlya vosstanovleniya sustavnogo hryashcha // Vestnik Volgograd. gos. un-ta. Ser. 11, Estestv. nauki. -2013. - № 1 (5). - S. 19-28.
6 Vishwakarma A., Bhise N.S., Evangelista M.B. et al. Engineering immunomodulatory biomaterials to tune the in-flammatory response // Trends in Biotechnology. - 2016. - № 34 (6). - Р. 470-82.
7 Prudente A., Favaro W., Filho P. et al. Host Inflammatory Response to Polypropylene Implants: Insights From a Quantitative Immunohistochemical and Birefringence Analysis in a Rat Subcutaneous Model / / International Brazilian Journal of Urology. - 2016. - No 42 (3). - Р. 585-93.
8 Chereshnev V.A., Gusev E.Yu. Immunologicheskie i patofiziologicheskie mekhanizmy sistemnogo vospale-niya // Medicinskaya immunologiya. - 2012. - № 14 (1-2). - S. 9--20.
9 Vasconcelos D.M., Gonfalves R.M., Almeida C.R. et al. Fibrinogen scaffolds with immunodulatory properties promote in vivo bone regeneration // Biomaterials. - 2016. - No 111. - Р. 163-178.
10 Haase T., Krost A., Sauter T. et al. In Vivo Biocompatibility Assessment of Poly (Ether Imide) Electrospun Scaffolds // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. - 2017. - No 11(4). - Р. 1034-44.
Авторская справка
Галашина Елена Анатольевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований, НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов, Россия, копшсЫепко1983@таП.ги
Чибрикова Юлия Андреевна, врач-ординатор кафедры травматологии и ортопедии, ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов, Россия, [email protected]
Иванов Алексей Николаевич, доктор медицинских наук, доцент, заведующий отделением лабораторной диагностики, главный научный сотрудник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований, НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов, Россия, [email protected]
Гладкова Екатерина Вячеславовна, кандидат биологических наук, начальник отдела фундаментальных и клинико-экспериментальных исследований, НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов, Россия, [email protected]
Норкин Игорь Алексеевич, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по развитию, НИИ травматологии, ортопедии и нейрохирургии ФГБОУ ВО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Саратов, Россия, [email protected]
Рукопись получена: 25 марта 2020 г. Принята к публикации: 7 апреля 2020 г.
