CC BY
120
УДК 616.728.3-0.02:616-076 Т. В. Русова, В. С. Баитов
БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРОТЕОГЛИКАНОВ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ ПРОГРЕССИРУЮЩЕМ ОСТЕОАРТРОЗЕ
ФГУ Новосибирский НИИ ортопедии и травматологии Росмедтехнологий
Определены количественные и качественные изменения протеогликанов/гликозаминог-ликанов в суставном хряще в динамике развития остеоартроза коленного сустава у людей. Установлено, что на разных стадиях заболевания количественный и качественный состав гликозаминогликанов меняется: снижается количество хондроитинсульфатов и нарастает содержание кератансульфата и нейтральных сахаров. В динамике развития заболевания в хондроитинсульфате снижается количество сульфатных групп на условную единицу длины цепи. Возрастает количество протеогликанов, тесно связанных с внеклеточным матриксом, которые не выделяются диссоциативным экстрагированием. При разделении электрофорезом в геле агарозы, они более подвижны, не образуют больших агрегатов.
Ключевые слова: остеоартроз, хрящ, протеогликаны, гликозаминогликаны
Специфические характеристики хрящевой ткани во многом определяются такими составными компонентами, как протеогликаны (ПГ), которые наряду с белковыми структурами обеспечивают защиту сустава от биомеханических сил растяжения, сдвига и сжатия, возникающих при движении. Молекулы ПГ состоят из полианионных цепей полисахаридов - хондроитинсульфатов и/или кератансульфата, ковалентносвязанных с белковым кором. Вследствии их высокого отрицательного заряда в ткани сохраняется значительное количество воды и формируются интенсивные потоки жидкости и метаболитов. Сеть коллагена метаболически относительно инертна, тогда как синтез и накопление новых молекул ПГ позоляют компенсировать разрушение и удаление старых из внеклеточного матрикса. На этапе возникновения и в процессе прогрессирования гонартроза этот метаболический баланс смещается [1-3], не смотря на то что в ткани протекает интенсивный катаболизм и синтез компонентов внеклеточного матрикса [2, 4]. Модификация процессов синтеза обусловлена изменением дифференцировки хондроцитов, которые синтезируют ПГ, структурно отличающиеся от ПГ синтезируемых в нормальной ткани [2, 3, 5, 6]. Мы предположили, что своеобразие синтетических процессов в ткани на каждом этапе развития болезни и соответствующая модификация структуры ПГ/ГАГ в суставном хряще обусловливают прогрессирование заболевания. Поэтому мы исследовали изменения ПГ/ГАГ гиалинового хряща на разных стадиях развития остеоартроза.
Материалы и методы
В Новосибирском НИИ травматологии и ортопе-
дии проведены биохимические исследования гиалинового хряща 47 пациентов (30-47 лет), проходивших лечение по поводу идиопатического остеоартроза (ОА) II и III степени. Забор хряща осуществлялся из нерабочей зоны внутреннего мыщелка бедра на границе межмыщелковой ямки во время проведения артроскопических операций и операций эндопротезирования коленного сустава. В контрольную группу вошел посмертный материал хряща коленного сустава от 5 внезапно погибших людей в возрасте 25-47 лет без дегенеративных изменений хряща.
Выделение ПГ. Протеогликаны из ткани хряща выделялись двумя способами: 1) раствором папаина (0,2 мг папаина на 1 грамм сырой ткани с добавлением 0,01 М ЭДТА и 0,005 М цистеина в буфере 0,2 М ацетата натрия рН 5,8); 2) ткань хряща после измельчения обрабатывалась раствором 0,14 М №С1 с добавлением 0,01 М ЭДТА (пул ПГ-1 - ПГ, слабо связанные с внеклеточным матриксом), а затем раствором 4 М гуанидин-хлорида в 50 мМ буфере ацетата натрия рН 5,8 и в присутствии ингибиторов (0,01 М ЭДТА, 0,005 М ФМСФ, 0,1 М 6-минокапроновой кислоты, 0,005 М солянокислого бензамидина) в течение 24 ч при +4оС (пул ПГ-2 - интактные ПГ внеклеточного матрикса). Оставшаяся часть ткани в течении 18 ч обрабатывалась раствором папаина при +60оС (пул ПГ-3 - ПГ глубоких слоев хряща, тесно связанных с коллагеном). Экстракты диализовали в течение 24 ч против буфера 50 мМ ацетата натрия с 0,01 М ЭДТА рН 5,8 при +40оС. Белки осаждали хлорной кислотой (0,5 н) и удаляли центрифугированием (9000 g. +2оС, г00= 8 см). После повторного диализа ПГ осаж-
дали в течение 12 ч тремя объемами этанола в присутствии 4% ацетата калия при температуре -18оС, осадок отделяли центрифугированием, промывали этанолом, ацетоном и растворяли в воде. Для выделения сульфатированных ПГ/ГАГ в раствор добавлялся 10 % цетилпиридиний хлорид (ЦПХ) до насыщения. Осадок переводили в раствор. В этом растворе и в супернатанте аналитически определялось содержание моносахаров, характеризующих отдельные виды ГАГ: хондроитинсульфат (ХС), кератансульфат (КС), сульфатированные ГАГ (СГАГ).
Аналитические методы исследования ГАГ/ПГ (уроновые кислоты, гексозы, сульфатированные ГАГ) описаны в работе [2]. Для характеристики ПГ использовался метод электрофореза в 1,2 % геле агарозы в 0,1 М трис-ацетатном буфере рН 7,3. Количество моносахаров выражалось в микрограммах в расчете на миллиграмм сухого веса ткани. Результаты обрабатывались с помощью программы <^ТЛТКТГСА», с использованием среднего значения “М”, ошибки среднего “т” и ?- критерия Стьюдента.
Результаты
На рис. 1 представлены результаты исследования количества воды и ГАГ в хряще. Видно, что содержание воды в ткани меняется с нарастанием дегенеративного процесса. На ранних эиапах заболевания количество воды практически не меняется и даже имеет тенденцию к повышению, однако на поздних стадиях потеря воды значительна. Количество уроно-вых кислот (УК) в хряще на каждой стадии заболевания достоверно отличалось от нормального: если на стадии заболевания II их количество превышало контрольные значения в 1,8 раза, то на стадии III оно снижается в 3,4 раза. Подобным образом изменяется количество галактозы в ткани: сначала оно возрастает в 1,6 раза, затем снижается, и в хряще больных с III стадией ОА количество галактозы в 1,7 раза ниже контрольных значений.
■ контроль О П стадия п III стадия
нода
УК
галактоза
СГАГ
Рис. 1. Содержание воды и гликозаминогликанов в суставном хряще в зависимости от стадии развития остеоартроза
Рис. 2. Распределение ПГ в разных пулах, выделенных из ткани различными растворителями, в зависимости от стадии развития остеоартроза
Количество сульфатированных СГАГ достоверно снижено в хряще с ранней II и III стадиями заболевания (рис. 1).
С развитием фибропластических процессов и изменением структуры хряща меняется прочность связей между ПГ и элементами внеклеточного матрикса, поэтому для выделения ПГ используются растворы различной ионной силы, а также ферментативное разрушение связей (см. «Материалы и методы»). На рис. 2 и в табл. показано распределение ПГ/ГАГ в различных пулах и дана их краткая аналитическая характеристика. Качественные и количественные изменения обнаруживаются на разных этапах развития ОА. В раннем периоде в хряще приблизительно в 2 раза увеличивается относительное содержание пула ПГ-1 и в 1,6 раза снижается содержание пула ПГ-2. В пулах ПГ-1 и ПГ-2 увеличивается относительное количество ХС (табл.). На поздних этапах заболевания в хряще количество ПГ-1 значительно уменьшается (более чем в 4 раза), а относительное содержание пулов ПГ-2 и ПГ-3 увеличивается приблизительно в 1,3 раза. В динамике развития заболевания в разных пулах меняется соотношение ХС/КС. В пулах ПГ-1 и ПГ-2 выше содержание ХС, а в пуле ПГ-3 (особенно на выраженных стадиях дегенеративного процесса) явно преобладает КС. С прогрессированием заболевания увеличивается количество ГАГ, не осаждаемых ЦПХ, особенно в пуле ПГ-3. Так, на III стадии заболевания количество СГАГ, не осаждаемых ЦПХ, составляет приблизительно 10 % их общего количества в этом пуле. На II стадии заболевания почти половина количества галактозы пула ПГ-3 остается в надосадке, на III стадии этот показатель достигает 90 % (табл.). Одновременно снижается относительное содержание сульфатных групп на условную единицу длины цепи ГАГ, которую можно выразить через отношение количества СГАГ к суммарному количес-
Таблица
Аналитические характеристики гликозаминогликанов в последовательных экстрактах ПГ из ткани хряща коленного сустава (в % от общего количества)
Способ выделения ПГ ХС/КС Содержание не осаждаемых ЦПХ СГАГ и (галактозы), % от общего количества
контроль II стадия III стадия контроль п=5 II стадия п=20 III стадия п=27
ПГ-1 (0,14 М №С1) 1:0,67 1:0,56 1:0,43 0, (1,2) 0, (2,5) 1,3 (8,6)
ПГ-2 (4 М ГУ) 1:0,97 1:0,47 1:0,54 1,3, (8,6) 4,1 (6,5) 5,3 (18,3)
ПГ-3 (папаин) 1:1,08 1:1,26 1:1,4 2,3, (16,7) 3,5 (54,3) 8,6 (85,2)
Сульфатирование ГАГ - - - 41,5±4,24 26,0±2,48 65,9±5,96
тву ХС и КС. Подобное снижение сульфатирования ГАГ наиболее выражено на относительно ранних этапах развития заболевания, когда среди ГАГ преобладает ХС. На поздних стадиях сульфатирование ГАГ превышает контрольный уровень (табл.).
На рис. 3 показано разделение ПГ разных пулов в электрическом поле методом электрофореза в геле агарозы показано, видно что в контрольных образцах хряща ПГ существует в виде агрегатов, осаждаемых 2 % ЦПХ (пулы ПГ-1 и ПГ-3). В пуле ПГ-2 (4 М ГУ-НС1 ) выделяется значительная часть “свободных” ПГ (приблизително 25 %), осаждаемых 0,2 % ЦПХ (рис. 3а). На II стадии заболевания во всех пулах
а
1 2 3 4 5 6 7 8 9
б
і
1 2 3 4 5 6 7 8 9
обнаружено большое количество ПГ, которые вследствие незначительного содержания отрицательно заряженных групп не осаждаются ЦПХ, однако отчетливо видны на картине электрофореза (рис. 3б). На III стадии заболевания во всех пулах большая часть ПГ осаждается 0,2 % ЦПХ и значительно меньше ПГ, осаждается 2 % ЦПХ. Следует отметить, что в отличие от контрольных образцов эти ПГ теряют способность образовывать агрегаты, и при разделении электрофорезом они движутся компактной полосой (рис. 3в).
Обсуждение
Точный патогенез ОА неизвестен, однако многочисленные биохимические исследования подтверждают гипотезу о протеолитическом разрушении ПГ хрящевой ткани ферментами лизосом [3,10,12], адекватном выраженности заболевания [12]. С другой стороны, по оценкам некоторых исследователей [3,5,12], интенсивность синтеза ПГ при ОА (за исключением очень тяжелых случаев) значительно выше, чем в нормальной зрелой ткани. При этом среди синтезируемых ГАГ преобладает хондроитин-4-сульфат, количество кератансульфатанезначительно, что воспроизводит ситуацию незрелого хряща [3, 10].
Ряд исследователей считают, что существова-
Рис. 3. Виды ПГ гиалинового хряща при разделении их методом электрофореза в 1 % геле агарозы (0,1 М трис-ацетатный буфер
рН 7,3):
а. ПГ, выделенные из интактного хряща. № 1-3 - ПГ-1, выделенные экстрагированием 0,14 МЫаС1 и осажденные раствором ЦПХ до концентрации 0,2 %, 2 %, надосадок соотвественно.
№ 4-6 - ПГ-2, выделенные экстрагированием 4 МГУ-НС1, и осажденные раствором ЦПХ до концентрации 0,2 %, 2%, надосадок соотвественно. № 7-9 - ПГ-3, выделены папаином, и осажденные ЦПХ до концентрации 0,5 %, 5 % и надосадок, соотвест-венно ЦПХ.
б. ПГ, выделенные из гиалинового хряща больного с 1-11 стадией остеоартроза. Обозначения те же, что и на рис. 3а.
в. ПГ, выделенные из хряща больного с III стадией остеоартроза. № 10 (стандарта ХС-«С»). Обозначения те же, что и на рис. 3а.
+
в
ние ПГ-1 обусловлено активностью синтетических процессов в ткани [6,13]. Динамика изменений ПГ данного пула в процессе развития ОА подтверждает это положение (рис. 2): относительное количество ПГ наиболее значительно в начале заболевания, когда активность хондроцитов может быть высока [3,4,8,11], и существенно снижается на стадии выраженных дегенеративных изменений. Среди ГАГ пула ПГ-1 преобладает ХС (табл.), что связано с особенностями дифференцировки хондроцитов [3,4,8,11]. Химическая структура этого ГАГ у больных ОА отличается сниженной (более чем в 2 раза по сравнению с нормальным уровнем) “сульфатированностью” (плотностью сульфатных групп на условную единицу длины цепи ГАГ). Это явление, скорее всего обусловлено нарушениями процессов переноса сульфатных групп к цепям синтезируемых ГАГ специфическими ферментами - дисульфотрансферазами [5,13].
В нормальной хрящевой ткани пулы ПГ-1 и ПГ-2 формируют большие надмолекулярные агрегаты (рис. 3а) в следствии взаимодействия с ГК и наличием связей между концевыми доменами белковых коров отдельных ПГ [6,13]. Гиалуроновую кислоту можно видеть на линии старта (рис. 3а, N° 4, 5). Этот участок хорошо удаляется гиалуронидазой и не окрашивается азуром, специфичным для сульфатирован-ных ГАГ. Однако уже на ранней стадии заболевания в пулах исчезает четкая линия гиалуроновой кислоты (рис. 3б, №3, 4), появляются более легкие и подвижные ПГ, осаждаемые ЦПХ низких концентраций (рис. 3б). С прогрессированием заболевания эти ПГ преобладают во всех пулах (рис. 3б, в, № 1,4,7). Одновременно появляется значительное количество ПГ, не осаждаемых ЦПХ (рис. 3б, № 6, 9), которые могут быть представлены смесью разрушенных ПГ, накапливающихся в ткани вследствие высокой активности деградирующих ферментов [3,10,12], и небольших ПГ, содержащих нейтральные олигосахариды.
В обычных условиях функционирования способность ткани сохранять воду зависит от количества в ней ПГ и их способности к агрегированию (рис. 1). С развитием заболевания количество воды в ткани может не только не снизиться, но даже возрасти вследс-твии накопления в ней ПГ, а также за счет частичного разрушения коллагеновых фибрилл под влиянием избыточных биомеханических нагрузок на сустав. Разрыв поперечных связей между фибриллами, образованных ГАГ декорина (дерматансульфатом), приводит к переполнению коллагеновой матрицы водой, растяжению и набуханию коллагеновых волокон и увеличению количества воды в тканях [1, 15]. Часто это наблюдается при ОА у людей и при моделировании болезни на животных [1, 4, 10, 13].
В нормальной ткани гиалинового хряща ПГ, тесно связанные с сетью коллагена (пул ПГ-3), являются более легкими и уходят от старта дальше, чем ПГ других пулов (рис. 3а, № 8) [1,15]. В качестве углеводных цепей эти ПГ содержат в основном кератан и дерматансульфат. Эти ГАГ преобладают и на всех этапах развития ОА. В силу этого степень сульфа-тирования ГАГ в пуле ПГ-3 выше, чем в других (табл.). Дистрофические изменения хряща обусловлены увеличением этого пула ПГ, т. е. развитием сети коллагена нарастает количество ПГ, участвующих в формировании коллагеновых фибрилл.
Выводы
На основе сказанного выше можно сделать следующие выводы:
1. Развитие остеоартроза проходит этап активации синтетических процессов - увеличения количества ГАГ/ПГ в гиалиновом хряще;
2. Химическая структура синтезируемого хон-дроитинсульфата характеризуется снижением относительного количества сульфатных групп, приходящихся на условную единицу длины цепи ГАГ;
3. С прогрессированием заболевания количество ПГ в хряще уменьшается, нарушается способность ПГ образовывать большие агрегаты, появляется значительное количество неагрегированных “легких” ПГ;
4. Увеличивается относительное количество коротких ПГ, участвующих в образовании сети коллагена, которые освобождаются только после обработки ткани папаином.
BIOCHEMICAL CHANGES IN PROTEOGLYCANS OF ARTICULATE CARTILAGE IN PROGRESSIVE OSTEOARTHROSIS
T. V. Rusova, V. S. Baitov
Quantitative and qualitative dynamic changes in proteoglycans/glycosaminoglycans of the articular cartilage in patients with progressive osteoarthrosis of the knee were determined. Gradual reduction of a chondroitin sulfate quantity and increase in a keratan sulfate and neutral sugars con-tent were revealed in glycosaminoglycans. In chondroitin sulfate a quantity of sulphate groups per a conventional unit of a chain length was reducing. The amount of proteoglycans closely connected with extracellular matrix was growing. They were more mobile in agarose gel and not aggregated.
Литература
1. Николаева С.С., Рощина А.А., Ким Зон Чхол, и др. Особенности некоторых биохимиче-ских и влагообменных характеристик суставного хряща человека при остеартрозе // БЭБМ. 2002. 133. 5. 559-560.
Nikolaev S.S., Roschina A.A., Kim Zon Chkhol etc. Pecu-
liarities of some biochemical and moisture exchange features of human articular cartilage under osteoarthrosis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 2002. 133. 5. 559-560.
2. Русова Т.В., Рыкова В.И., Корель А.В., Зайд-ман А.М. Структура протеогликанов пластин-ки роста тел позвонков у больных идиопатическим сколиозом // Бюллетень СО РАМН. 2007. 123. 1. 80-83.
Rusova T.V., Rykova VI., Korel A.V., Zaidman A.M. Structure of proteoglycans of vertebral bodies’ growth plate in patients with idiopathic scoliosis // Bulletin of SB RAMS. 2007.123. 1. 80-83.
3. Aigner T., Dudhia J.Phenotypic modulation of chondrocytes as a potential therapeutic target in osteoarthritis: a hypothesis // Ann. Rheum. Dis. 1997. 56. 287-291.
4. Adams M.E., Matyas J.R., Huang D, Doura-do G.S Expression of proteoglycans and collagen in the hypertrophic phase of experimental steoarthritis //J.Rheumatol. 1995. 43(suppl.). 94-97.
5. Plaas A.H.K., West L.A., Wong-Palms S., et al. Glycosaminoglycan sulfation in human os-teoarthritis // J. Biol Chem, 1998. 273. 12642-12649.
6. Hardigham T.E., Muir H. Hyaluronic acid in cartilage and proteoglycan aggregation //Biochem. J. 1974. 139. 565581.
7. Qu C.J., Rieppo J., Hyttinen M.M., Lammi M.J. et al. Human articular cartilage proteoglycans are not undersulfated in оsteoarthritis // Connective Tissue Research. 2007. 48. 27-33.
8. Yagi R., McBurney D., Laverty D., et al. Intrajoint comparisons of gene expression patterns in human osteoarthritis suggest a change in chondrocyte phenotype //J. Orthop. Res. 2005. 23. 1128-38.
9. Lohmander L.S. Neame P.J., Sandy J.D. The structure of aggrecan fragments in human synovial fluid. Evidence that aggrecanase mediates cartilage degradation in inflammatory joint disease, joint injury, and osteoarthritis //Arthritis & Rheum. 1993. 36. 1214-1222.
10. Mankin HJ., Jonson M.E., Lippiello L. Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from jsteoarthaitic human hips // J.Bone Joint Surg. 1981. 63. 131139.
11. Martin JA., Buckwalter J.A. The Role of Chondrocyte Senescence in the Pathogenesis of Os-teoarthritis and in Limiting Cartilage Repair // J. Bone Joint Surgery (American). 2003. 85. 106-110.
12. Matyas J.R., Huang D., Chung M., Adams M.E. Regional quantification of cartilage type II col-lagen and aggrecan messenger RNA in joints with early experimental osteoarthritis // Arthritis Rheum. 2002. 46. 1536-1543.
13. McDevit C.A., Muir H. Biochemical changes in the cartilage of the knee in experimental and natural osteoarthritis in dog // Bone Joint Surg. 1976. 58B. 94-101.
14. Fan Z, Chubinskaya S., Rueger D.C, Bau B., et al. Regulation of anabolic and catabolic gene expression in normal and osteoarthritic adult human articular chondrocytes by osteogenic protein-1 // Clin Exp Rheumatol. 2004. 22. 103106.
15. Scott J.E., StockwellR.A., Cartilage elasticity resides in shape module decoran and aggrecan sumps of damping fluid. Implications in osteoarthrosis // J. Physiol. 2006. 574. 3. 64350.
