CC BY
40
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 613.632-008.9-074
Сабитова Р.И., Кравец Е.Д., Самсонов В.М., Шакиров Д.Ф., Камилов Ф.Х., Еникеев Д.А.
БИОХИМИЧЕСКИЕ И ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ХИМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ОРГАНИЗМ, ИХ ИНФОРМАТИВНОСТЬ И ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России, Уфа
Обследовано 185 рабочих, из которых 90 человек работают на ЗАО «Опытный .завод Нефтехим» (67 женщин и 23 мужчины), а 95 - на ЗАО «Каустик» (64 женщины и 31 мужчина), из различных цехов данных предприятий. Для исследований производили забор крови, слюны и мочи, в которых определяли биохимические показатели. Работа выполнена в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (WorldMedicalAssociation Declaration of Helsinki, 2008 ред.) с получением письменного согласия пациента на участие в исследовании.
Ключевые слова: маркеры; кровь; слюна; моча; химическое воздействие.
Для цитирования: Клиническая лабораторная диагностика. 2016; 61 (1): 21-24. SabitovaR.I., KravetzE.D., Samsonov V.M., Shakirov D.F., KamilovF.Kh., EnikeevD.A.
THE BIOCHEMICAL AND PATHOPHYSIOLOGICAL MARKERS OF CHEMICAL EFFECT ON ORGANISM, THEIR INFORMATIVENESS AND DIAGNOSTIC SIGNIFICANCE
The Bashkirskii state medical university of Minzdrav of Russia, Ufa, Russia
The .sampling of study included 185 examined workers. Out of them 90 work at "Opitnii zavod Neftekhim" (67 females and 23 males) and 95 - at "Kaustik" (64 females and 31 males) from various workshops of the given enterprises. To determine biochemical indicators samples of blood, saliva and urine were collected. The study was carried out in concordance with ethic principles of the Helsinki world medical association declaration, 2008 ed. with receiving written consent of patient to participate in study.
Keywords: marker; blood; saliva; urine; chemical effect.
Citation: Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2016; 61 (1): 21-24. (in Russ.)
В современных условиях особую актуальность приобретает регистрация ранних проявлений патогенного воздействия химических загрязнителей на метаболизм человека и функционирование отдельных органов и систем [3].
Чувствительной системой реагирования клеток на химические воздействия, по мнению одних авторов, является энергетический обмен, а других - состояние свободноради-кального и микросомального окислений [1, 2, 5, 7].
Цель исследования - изучение процессов свободноради-кального и микросомального окислений, антиоксидантной защиты, энергетического метаболизма и электролитного обмена у рабочих нефтехимической промышленности, подвергающихся в условиях производства воздействию комплекса токсичных веществ, с обоснованием информативности и критериальной значимости показателей донозологической диагностики риска развития патологии.
Материалы и методы. Базой исследования были выбраны ЗАО «Опытный завод Нефтехим» (Уфа, Республика Башкортостан) и ЗАО «Каустик» (Стерлитамак, Республика Башкортостан), являющиеся крупнейшими производственными комплексами современной нефтехимической промышленности в России, выпускающие продукцию более 100 наименований. В выборку было включено 185 рабочих, из которых 90 человек (67 женщин и 23 мужчины - ЗАО «Опытный завод Нефтехим») и 95 человек (64 женщины и 31 мужчина - ЗАО «Каустик»). Материалом для исследований служили кровь, смешанная слюна и моча, взятая у рабочих, подвергающихся в производственных условиях действию химических загрязнителей.
Смешанную нестимулированную слюну собирали через 1-3 ч после еды в чистый стакан в течение 10 мин, предвари-
Для корреспонденции: Сабитова Регина Игоревна, [email protected]
For correspondence: SabitovaR.I., [email protected]
тельно прополоскав рот теплой кипяченой водой. Затем слюну, разведенную равным количеством 0,9% раствора NaCl, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. Для удаления пены и денатурации муцина слюну замораживали, а затем оттаивали.
Кровь из вены и мочу в количестве 10 мл отбирали утром натощак. Кровь, стабилизированную гепарином, для выделения эритроцитов центрифугировали в течение 10 мин в центрифуге К-24 D (Германия) при 3000 об/мин и температуре +2oC. Плазму удаляли и хранили при температуре +40С не более 8 ч. Осадок эритроцитов трижды отмывали холодным изотоническим раствором NaCI. Отмытые эритроциты гемо-лизировали в 5,0 мМ трис-HCl буфере с рН 7,6 в соотношении 1:9 в течение 30 мин при температуре +40C. Гемолизат использовали в качестве источника ферментов: каталазы, пероксидазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатион-пероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР), глутатион-S-трансферазы (Г-S-T); плазму - для определения содержания витаминов Е и С, уровня сульфгидрильных (SH) и дисуль-фидных (SS) групп, количества восстановленного глутатиона (GSH).
Об интенсивности процессов свободнорадикального окисления (СРО) судили по содержанию ТБК-активных продуктов по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой в присутствии трихлоруксусной кислоты и по показателям хе-милюминесценции (ХЛ) [6]. Ферментативное звено антиоксидантной защиты (АОЗ) изучали путем определения активности каталазы [8], пероксидазы [4], супероксиддисмутазы [12], глутатионпероксидазы [17], глутатионредуктазы [13] и глутатион^-трансферазы [15], а неферментативное - по содержанию восстановленного глутатиона [10], SS- и SH-групп [11], а-токоферола [16] и аскорбиновой кислоты с помощью стандартного тест-набор фирмы Boehringer Mannheim. Содержание АТФ, АДФ и АМФ в эритроцитах определяли с помощью стандартных наборов «Test combination ATP» и «Test combination ADP/AMP» фирмы Boehringer Mannheim.
Плазма крови
Эритроциты
ШШ Контрольная группа
2А подгруппа ШЯ 2Б подгруппа
Слюна
1А подгруппа 1Б подгруппа
Рис. 1. Содержание ТБК-активных продуктов в плазме крови, эритроцитах и слюне у обследованных лиц, подвергающихся комбинированному воздействию химических загрязнителей (в % к контролю).
Активность ферментов энергетического метаболизма ГК, ПК, ФФК, глицероальдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФДГ), Г-6-ФДГ, Na+,K+- и Ca+2,Mg+2-3aBMKMbix АТФаз определяли по стандартным методикам [4,14,19]. Перенос ионов через мембраны оценивали по изменению их содержания в среде потенциометрическим методом с помощью селективных стеклянных электродов. Состав среды: 100 мМ трис-фосфатный буфер, содержащий 0,4 мМ MgS04, 1 мМ NaCl и разные концентрации KCl; рН среды регулировали добавлением триса или HCl. Состояние цитохром-Р450-зависимой монооксидаз-ной системы оценивали по скорости деметилирования вводимого в организм лекарственного препарата (антипирина), ацетилирование - по скорости выведения изониазида и его ацетилированных производных [4]. Учитывая специфику производственных факторов, особенность их действия на организм работающих, пути поступления токсичных веществ (через органы дыхания, кожу рук), были сформированы 2 группы: группа А и Б, в каждой из которых было еще по две подгруппы. В группу А вошли лица, имеющие комбинированный контакт - как с высшим, так и с низшим рядом ароматических углеводородов и хлорсодержащих соединений (ЗАО «Опытный завод Нефтехим»): подгруппа 1А - рабочие (42 человека с повышенным риском развития профессионального заболевания, имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 5 лет; подгруппа 2А - рабочие (48 человек с подозрением на хроническую профессиональную интоксикацию), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 10 лет и более. В группу Б вошли лица, имеющие комбинированный контакт с хлорированными углеводородами и алифатическими аминами жирного ряда (ЗАО «Каустик»): подгруппа 1Б - рабочие (43 человека, группа риска), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 5 лет; подгруппа 2Б - рабочие (52 человека с подозрением на хроническую профессиональную интоксикацию), имеющие постоянный контакт с производственными загрязнителями в течение 10 лет и более. Контрольную группу составили 42 сотрудника административно-управленческого аппарата, у которых трудовой процесс исключает воздействие факторов производственной среды. Работа выполнена в соответствии с этическими принципами Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (World Médical Association Déclaration of Helsinki, 2008 ред.) с получением письменного согласия пациента на участие в исследовании. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью прикладной программы Statistica for Windows 5.0. Характеристики выборок были представлены в виде средней (М) ± стандартной ошибки среднего значения (m). Сравнение двух несвязанных групп проводили по критерию Манна-Уитни (для данных, распределение которых отлича-
лось от нормального) и по величине /-критерия Стьюдента (для данных из совокупностей с распределением близких к нормальному). Статистически значимыми считали отличия, соответствующие оценке ошибки вероятности р < 0,05. Вероятность различий составляет 95% и более.
Результаты и обсуждение. У лиц, подвергавшихся в процессе профессиональной деятельности химическому воздействию, в плазме крови, эритроцитах, смешанной слюне и моче обнаружили весьма существенные сдвиги в изучаемых показателях. Так, в плазме крови, эритроцитах и слюне у обследованных лиц 1А и 1Б подгрупп, особенно во 2А и 2Б подгруппах, выявляется повышение уровня ТБК-активных продуктов (рис. 1), что свидетельствует об усилении процессов свободнорадикального перекисного окисления. На интенсивность процессов СРО у этих рабочих указывают и результаты изучения ХЛ плазмы крови и слюнной жидкости.
Так, спонтанное свечение (Сп) в плазме крови и слюне в 1А и 1Б подгруппах повышается в 2,3 и 2,7 раза и, соответственно, в 3,3 и 3,6 раза во 2А и 2Б подгруппах. Усиление интенсивности излучения светосуммы наблюдаемое в подгруппах 1А и 1Б, резко повышается во 2А и 2Б подгруппах. Амплитуда быстрой вспышки в 1А и 1Б подгруппах возрастает в 1,8 и 2,1 раза по сравнению с контрольной
я(мин) tg<a
400300250200150100 -500-
J
Сп S А
Контрольная группа КЭД 2А подгруппа ВШ 2Б подгруппа
Мах
1А подгруппа 1Б подгруппа
Рис. 2. Изменения характера ХЛ плазмы крови (а), смешанной слюны (б) и мочи (в) у обследованных лиц, подвергающихся комбинированному действию химических загрязнителей (в % к контролю).
% 150 -,
150-
50-
1
Каталаза
СОД
ИМ Контрольная группа
2А подгруппа КШ 2Б подгруппа
Пероксидаза
1 1А подгруппа i 1Б подгруппа
Рис. 3. Изменения активности каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы в слюне у обследованных лиц, подвергающихся комбинированному действию химических загрязнителей (в % к контролю).
группой, во 2А и 2Б, соответственно, в 2,8 и 3,2 раза. В обеих профессиональных группах наблюдается увеличение уровня максимальной амплитуды медленной вспышки, характеризующее инициирование СРО. Латентный период, определяющий антиокислительные резервы биоматериала, существенно превышает исходное значение в 1А и 1Б подгруппах, а у лиц во 2А и 2Б подгруппах, напротив, отмечается падение уровня антиокислительных свойств плазмы крови и слюны. Однако при изучении ХЛ мочи у обследованных лиц обеих групп было выявлено, что интенсивность излучения мочи характеризуется определенными изменениями. У рабочих из 2А и 2Б подгрупп ХЛ значительно отличается от уровня участников из контрольной группы, а в 1А и 1Б подгруппах этот показатель не меняется или даже увеличивается (рис. 2). В то же время результаты исследований антиоксидантной системы в эритроцитах и смешанной слюне у обследованных лиц показывают, что на фоне усиления процессов СРО и липопероксидации в 1А и 1Б подгруппах происходит активация ферментов АОЗ, а во 2А и 2Б подгруппах выявляется разнонаправленность их изменений (рис. 3). В плазме крови у обследованных лиц обеих групп меняется уровень SH-, SS-групп и соотношение SH/SS (рис. 4). Статистически достоверных изменений уровней а-токоферола и витамина С в плазме крови и слюнной жидкости у обследованных лиц, имеющих контакт с химическими загрязнителями, не выяв-
лено. В эритроцитах у всех обследуемых лиц опытных групп обнаружено снижение уровня АТФ, но статистически более значимое у 2А и 2Б подгрупп по сравнению с 1А и 1Б подгруппами. Уменьшение содержания АТФ сопровождается накоплением АДФ и АМФ. В то же время в эритроцитах у обследуемых лиц выявляются изменения активности транспортных АТФаз, ключевых ферментов гликолиза и пентозо-фосфатного пути. Эти изменения носят разнонаправленный характер. Если активность №+,К+-зависимой АТФазы, ГАФДГ и Г-6-ФДГ в основных группах (А и Б) повышается, то активность Ca+2,Mg+2-зависимой АТФазы, ГК, ФФК и ПК, напротив, снижается (рис. 5). Свидетельством интенсивного синтеза макроэргических соединений в эритроцитах является гиперфосфатемия, т. е. наблюдается активация процесса, катализируемого ГАФДГ, в результате которого образуется 1,3-дифосфоглицерат [9]. Накопление этого продукта приводит к ускорению синтеза макроэргов в ходе фосфоглицерат-киназной реакции гликолиза. Подтверждением данного факта в известной мере могут служить данные некоторых авторов [18], свидетельствующие, что одним из пусковых механизмов усиления указанной реакции является активация №+,К+-АТФазы. В эритроцитах у обследованных лиц выявлено уменьшение концентрации катионов К+, Mg+2, Са+2 и повышение ионов №+ и рН. В плазме крови и слюнной жидкости, напротив, содержание №+ и Са+2 снижается, а концентрация К+, Mg+2 и рН повышаются. Изменения содержания электролитов в плазме крови достоверно отражают их сдвиги, как в межклеточной жидкости, так и в тканях. Во всех обследуемых группах в показателях антипириновой пробы существенных отклонений по сравнению с нормой не обнаружено. Период полувыведения антипирина в группе контрольных лиц составляет 10,55±1,5 ч, клиренс антипирина 42,54±2,4 мл/кг/ч, тогда как показатели антипириновой пробы в 1А и 1Б подгруппах определяются на уровне 10,48±2,4 ч и 41,95±3,3 мл/кг/ч, а во 2А и 2Б соответственно 11,74±4,6 ч и 46,24±6,2 мл/кг/ч.
При внутригрупповом сравнении показателей ацетилиро-вания изониазида выявляется отсутствие изменений между контрольной и основной (подгруппы 1А и 1Б), и статистически значимые различия между контрольной и профессиональной группами (подгруппы 2А и 2Б).
Все участники исследования как в контрольной, так и в основных профессиональных группах, были разделены на быстрые, средние и медленные ацетиляторы в зависимости от степени инактивации изониазида. Так, если в контрольной группе основную часть составляют средние (65%) и медленные (33%) ацетиляторы, то в группах А и Б наблю-
%
25020015010050-
ш
I
SH
SS
SH/SS
ШШ Контрольная группа Pal 2А подгруппа 1ШЯ 2Б подгруппа
GSH
1А подгруппа 1Б подгруппа
Рис. 4. Изменение содержания SH-групп, SS-групп, SH/SS и GSH в плазме крови у обследованных лиц, подвергающихся комбинированному действию химических загрязнителей (в % к контролю).
%
150
100
50
ill
ГАФДГ Na+, К+-АТ Фаза
ШШ Контрольная группа
2А подгруппа КШ 2Б подгруппа
ГК
ПК
1А подгруппа 1Б подгруппа
Рис. 5. Изменения активности №+,К+-АТФазы, глицероаль-дегидфосфатдегидрогеназы (ГАФДГ), гексокиназы (ГК) и пируваткиназы (ПК) в эритроцитах у обследованных лиц, подвергающихся комбинированному действию химических загрязнителей (в % к контролю).
дается уменьшение числа лиц со средней скоростью ацети-лирования. Если в 1А и 1Б подгруппах средние и медленные ацетиляторы составляют 48 и 42%, а 10% - быстрые, то во 2А и 2Б соответственно 33, 31 и 36%. Средний уровень выделения продуктов метаболизма изониазида с мочой существенно различается по сравнению с нормой во 2А и 2Б подгруппах. Общая сумма выведенных соединений (неметабо-лизированный + ацетилированный изониазид) у лиц 2А и 2Б подгрупп с быстрым ацетилированием составляет 38,3±4,2% при норме 63,1±5,8% (р < 0,001), со средним - 41,5±3,6% при норме 52,4±4,4% (р < 0,05). Эти изменения наблюдаются в основном за счет уменьшения содержания ацетилированного изониазида, в то время как в выделении неизмененного препарата не зарегистрировано достоверных различий между группами. В результате изменяется соотношение ацетилиро-ванного изониазида и неизмененного препарата, выводимых с мочой, что характеризует состояние процесса ацетилиро-вания. Установленный факт весьма важен, так как состояние микросомального окисления отражает напряженность и резервы биотрансформационных процессов в организме.
Выводы. Таким образом, к биохимическим и патофизиологическим маркерам вредности и опасности химических воздействий следует отнести изменения состояния аденило-вой и монооксигеназной систем, ферментного спектра анти-оксидантной защиты и энергетического обмена, дисбаланс ионного состава крови. Показано, что критериальной оценкой химического воздействия на организм является состояние свободнорадикального окисления, выявляемое методом хемилюминесценции биологических жидкостей.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 8-19 см. REFERENCES)
1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Медицина; 1975.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Медицина; 1972.
3. Камилов Ф.Х., Шакиров Д.Ф. Состояние метаболических процессов в организме у рабочих, занятых в химической, нефтехимической и нефтеперерабатывающей промышленности. Вестник Российской военно-медицинской академии. 2008; 2: 679-80.
4. Меньшиков В.В., ред. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина; 1987.
5. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М.: Медицина; 1972.
6. Фархутдинов Р.Р., Лиховских В.А. Хемилюминесцентные методы исследования свободнорадикального окисления в биологии и медицине. Уфа: Издательство БГМИ; 1995.
7. Камилов Р.Ф., Самсонов В.М., Шакиров Д.Ф. Свободноради-кальное окисление как звено адаптации органзма к факторам производственной среды. В кн.: Высокогорский В.Е., ред. Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований. Материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной диагностике. Омск: Издательство ОГМУ; 2011: 129-35.
Поступила 27.05.15
REFERENCES
1. Archakov A.I. Microsomal Oxidation. [Mikrosomal'noe okislenie]. Moscow: Meditsina; 1975. (in Russian)
2. Vladimirov Yu.A., Archakov A.I. Lipid Peroxidation in Biological
Membranes [Perekisnoe okislenie lipidov v biologicheskikh mem-branakh]. Moscow: Meditsina; 1972. (in Russian)
3. Kamilov F.Kh., Shakirov D.F. Status of metabolic processes in the body of the workers employed in the chemical, petrochemical and refining industries. Vestnik Rossiyskoy voenno-meditsinskoy akademii. 2008; 2: 679-80. (in Russian)
4. Men'shikov V.V., ed. Laboratory Methods of Research in Clinic [Laboratornye metody issledovaniya v klinike]. Moscow: Meditsina; 1987. (in Russian)
5. Skulachev V.P. Transformation of Energy in Biomembranes [Trans-formatsiya energii v biomembranakh]. Moscow: Meditsina; 1972. (in Russian)
6. Farkhutdinov R.R., Likhovskikh V.A. ChemiluminescentMethods of Research of Free Radical Oxidation in Biology and Medicine [Khem-ilyuminestsentnye metody issledovaniya svobodnoradikal'nogo ok-isleniya v biologii i meditsine]. Ufa: Izdatel'stvo BGMI; 1995. (in Russian)
7. Kamilov R.F., Samsonov V.M., Shakirov D.F. Free radical oxidation as a link adaptation to environment factors. In: Vysokogorskiy V.E., ed. Medical Biochemistry and Clinical Laboratory Diagnostics in Terms of Modernization of the System of Scientific Research. Proceedings of the Scientific-practical Conference of Biochemists and Specially for the Laboratory Diagnosis [Meditsinskaya biokhimiya i klinicheskaya laboratornaya diagnostika v aspekte modernizatsii sistemy nauchnykh issledovaniy. Materialy Vserossiyskoy nauchno-prakticheskoy konferentsii biokhimikov i spetsial'nostov po labora-tornoy diagnostike]. Omsk: Izdatel'stvo OGMU; 2011: 129-35. (in Russian)
8. Aebi H. Catalase. In: BergMeyer H., ed. Methods of EnzymatieAnalysis. Volume 2. Weinheim, Germany: Verlag Chemie; 1974: 673-84.
9. Atkinson D.E. The energy charge of the adenylate pool as a regulatory parameter. Interaction with feedback modifiers. Biochemistry. 1968; 7 (11): 4030-4.
10. Bellomo G., Thor H., Orrenius S. Modulation of cellular glutathione and protein thiol status during quinine metabolism. Methods Enzymol. 1990; 186: 627-35.
11. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. Biophys. 1959; 82 (1): 70-7.
12. Fried K. Enzymatik and non-enzymatik assay of superoxide dismutase. Biochimie. 1975; 57 (5): 657-60.
13. Goldberg D.M., Spooner R.J. Glutathione reductase. In: Bergmeyer H.U., Bergmeyer J., Grabl M., eds. Methods of Enzymatic Analysis. 3rd ed. Weinheim: Verlag Chemie; 111: 258-65.
14. Glock G., McLean P. Further studies on the properties and assay of glucose 6-phosphate dehydrogenase and 6-phosphogluconate dehydrogenase of rat liver. Biochem. J. 1953; 55 (3): 400-8.
15. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. Glutation-S-transferases: the first Enzymes scavenging activated oxigen radicals and lipid peroxide level in the liver of rats. Biochem. Pharmacol. 1974; 4 (32): 1795-8.
16. Niki E., Cadenas E.E., Packer L. a-Tocopherol. In: Handboor of antioxidant. N.Y.: Marcel Dekker, Inc; 1996: 3-25.
17. Paglia D.E., Valentine W.N. Studies on the quantitative and quantitative characterization of erythrocyte glutathione peroxidase. J. Lab. Clin. Med 1967; 70 (1): 158-69.
18. Segel G.B., Feig S.A., Glader B.E., Muller A., Dutcher P., Nathan D.G. Energy metabolism in human erythrocytes: the role of phosphoglycerate kinase in cation transport. Blood. 1975; 46 (2): 271-8.
19. Whittam R., Ager M.E. Vectorial aspects ofadenosine-triphosphatasae activity in erytrocyte membranes. Biochem. J. 1964; 93 (2): 337-48.
Received 27.05.15
