CC BY
16
УДК 57.085.23+612.172.31+577.352.54
К. И. Агладзе
Московский физико-технический институт (государственный университет)
Биофизика в МФТИ: опыт реализации 220-й Программы
Обсуждаются существующие в настоящее время теоретические и экспериментальные подходы к лечению аритмий сердца и созданию репарационных патчей сердечной ткани на основе индуцированных плюрипотентных клеток и биодеградируемых полимеров. Особую актуальность данная проблематика имеет в связи с созданием в МФТИ лаборатории под руководством автора, оснащённой новейшим оборудованием для решения указанных задач.
Ключевые слова: сердце, стволовые клетки, тканевая инженерия, аритмия, фотоконтроль.
1. Выбор цели
В рамках 220-го Постановления правительства РФ от 9.04.2010 (Программы 220) [1] к концу 2012 года в МФТИ будет создана современная биофизическая лаборатория, оснащённая по последнему слову техники. Разумеется, область биофизики ныне столь обширна, что необходимо было сосредоточиться на нескольких перспективных направлениях. Выбор стоял нелёгкий и сам по себе требующий привлечения изрядного интеллектуального потенциала и ответственности. Впрочем, отчасти этот выбор облегчался тем, что лаборатория должна была бы влиться в уже существующий междисциплинарный научнообразовательный центр (НОЦ) «Бионанофизика» МФТИ, где благодаря усилиям В. И. Горделия, В. В. Лебедева и М. Р. Трунина был взят старт на развитие мощного коллектива, работающего в области структурной биологии. Таким образом, логичным оказалось сосредоточиться на области, которая комплементарна уже развиваемой в НОЦ тематике. Здесь же, как для исследователя, наибольший интерес для меня представляла биофизика возбудимых систем, в частности, сердечной ткани. Таким образом, в фокусе исследований оказываются:
• фундаментальные механизмы возникновения сердечных аритмий, исследование которых опирается на новейшие достижения физики нелинейных самоорганизующихся систем;
• разработка методов регенерации сердечной ткани, основанных на привлечении наноматериалов и плюрипотентных клеток;
• наноинженерия ионных каналов, ответственных за функционирование сердечной клетки.
При этом в плане методологии и оснащения лаборатории изначально курс был взят на наибольшую универсальность приобретаемого оборудования, с тем чтобы функционирование лаборатории оставалось наиболее эффективным и при смене научного руководства.
2. Основные направления работы
Создание имиджинговых установок для оптического картирования возбуждения в сердечной ткани. Под оптическим картированием подразумевается визуализация (детектирование) волн возбуждения, распространяющихся по сердечной ткани, с помощью флуоресцентных меток [2,3]. Это направление исследований развивается в последние 20 лет
Рис. 1. Тестируемый образец в камере для культу- Рис. 2. Спиральные волны в культуре
ры ткани и результаты оптического картирования сердечной ткани
волн возбуждения
и успешно заменило многоэлектродное картирование [4,5]. Если с начала исследований запись волн возбуждения проводилась «вслепую»и записанные сценарии становились доступными после сложной цифровой обработки, то создаваемые в нашей лаборатории установки способны обеспечивать наблюдения в реальном времени и без дополнительной обработки сигнала. Т. е. они дают возможность проведения интерактивных экспериментов. С какой целью — тут мы переходим к следующему пункту. На рис. 1 вверху приведено фото микроскопической камеры с образцом культуры сердечной ткани. Картины флуоресцентной активности маркера внутриклеточного кальциевого выброса, подвергнутые компьютерной обработке, приведены ниже. Отчётливо видны спиральные волны возбуждения.
Исследование фундаментальных механизмов возникновения и развития сердечных аритмий, а также методов борьбы с ними. Важнейшим направлением нашей работы является исследование процессов, приводящих к возникновению опаснейших сердечных аритмий, таких как вращающиеся волны возбуждения, рис. 2, или «реентри» [6-8]. Эти волны вызывают дезорганизацию сердечной мышцы с потерей способности поддерживать циркуляцию крови. Понимание фундаментальных механизмов нарушения устойчивости работы сердечной ткани позволяет целенаправленно разрабатывать методы борьбы с этими нарушениями как консервативно-медикаментозные, так и бескровно-хирургические (катетерное выжигание эктопических очагов возбуждения или низковольтная дефибрилляция) [3]. На этом пути создаваемые нами тканевые констракты призваны служить экспериментальными моделями сердечной ткани, на которых отрабатываются методы борьбы со смертельно опасными аритмиями. Они позволяют минимизировать сложность системы до уровня, когда становятся ясными фундаментальные биофизические механизмы, приводящие к дезорганизации сердца [3,9].
Разработка методов фотоконтроля возбудимых тканей (сердечной и нервной).
Трудно переоценить возможность бесконтактно, прецизионно и обратимо воздействовать на возбудимую ткань, контролируя распространение возбуждения в мельчайших подробностях так, как это может сделать луч света. В то время как ряд исследователей сделали попытку генетически модифицировать возбудимые клетки, повысив их восприимчивость
Рис. 3. Схема взаимодействия азобензена с ионными каналами клетки
Установка для электроспиннинга
Материал:
13%-й раствор РМС1 в циклопентаноне плюс патентованные добавки
Рабочие параметры:
8 киловольт, скорость потока 2 мл/ч, время распыления: 2-15 с, в зависимости от желаемой плотности
Коллектор: алюминиевая фольга, 100 мкм
Рис. 4. Получение нановолокон
к свету (так называемая оптогенетика) [10], мы сконцентрировались на разработке фо-тозависимых веществ, модулирующих активность мембранных каналов по-разному в зависимости от их фотоформы. Из недавних успехов работы в этом направлении можно упомянуть синтез соединений, относящихся к классу азобензенов, позволяющих производить фотоконтроль сердечной ткани, переводя вещество из биологически активной формы в неактивную и, наоборот, с помощью фотоизомеризации [11-13]. На рис. 3 показана схема взаимодействия производных азобензена с потенциал-зависимыми ионными каналами. При облучении светом с длиной волны 440 нм мы получаем превалирование транс-формы АзоТАБа. Этот фотоизомер блокирует ионные каналы, связываясь с ними. При облучении ближним ультрафиолетом с длиной волны 365 нм мы переводим АзоТАБ в цис-форму, не связывающуюся с каналами. В результате активность ионных каналов, а следовательно, и возбудимость клетки восстанавливается.
50 um
Рис. 5. Культура сердечной ткани, выращенная на твёрдом субстрате с нановолокнами и прокрашенная флуоресцентными красителями
Использование полимерных нановолокон для конструирования структурируемой культивируемой сердечной ткани (тканевая инженерия). Успехи молекулярной и клеточной биологии привели в последнее десятилетие к бурному развитию таких областей науки, как тканевая и клеточная инженерия. Фактически исследователи вплотную подошли к возможности создания тканей организма с заранее определёнными свойствами. Стержневым направлением нашего проекта является тканевая инженерия сердца. Выбор данного направления обусловлен тем, что именно отказы в работе сердечно-сосудистой системы являются ведущей причиной смертности в современных индустриально развитых странах. Наша работа концентрируется на создании искусственных патчей сердечной ткани, в перспективе пригодных для имплантации и замены повреждённых участков сердца. Как известно, сердечная ткань высоко структурирована и имеет сложную архитектуру, что обеспечивает надёжную функциональность этого важнейшего органа. Структура разрабатываемых нами патчей определяется каркасом из полимерных нановолокон, каждое из которых способно нести сердечные клетки и направлять их развитие [14]. На рис. 4 показана установка для получения полимерных нановолокон требуемой плотности покрытия и упорядоченности. Собранные на алюминиевый коллектор нановолокна переносятся на желаемый субстрат методом микроконтактной печати. Затем клетки сердца наносятся на субстрат (подложку) с нановолокнами и культивируются. В процессе роста они образуют связанную функционально ткань, способную как к передаче возбуждения, так и химических сигналов. Рис. 5 показывает тестирование выращенного образца сердечной ткани с помощью флуоресцентных маркеров. Маркеры дают возможность увидеть порознь и одновременно как нановолокна, так и элементы структуры сердечных клеток, такие как актиновые нити и клеточные ядра. Возможно (и наиболее перспективно) использование «подвешенных» нановолокон, не опирающихся на твёрдую подложку (рис. 6). Клетки на таких волокнах образуют свободный слой сердечной ткани, который можно комбинировать с подобными слоями. Возникает своего рода «тканевый конструктор Lego», позволяющий создавать высокоструктурированную и синхронизированно сокращающуюся сердечную ткань. Этот подход является прорывным, так как то, что делалось до сих пор в этом направлении, представляло собой аморфные констракты из гелевых носителей с неопределёнными структурно-функциональными характеристиками.
Исследование интегрирования первичной культуры кардиомиоцитов и культуры, образованной сердечными клетками, полученными из индуцированных плюрипотентных клеток. В настоящее время в мировой науке успешно разрабатываются методы перепрограммирования клеток, когда дифференцированные клетки возвращаются в состояние так называемой плюрипотентности, близкое по свойствам к состоянию стволовых клеток [15]. Затем эти клетки направленно дифференцируются в клетки заранее определённой ткани. Таким образом, взяв, например, клетки кожи пациента, можно «перепрограммировать» их в сердечные. А затем создать имплантируемый патч, полностью иммунно совместимый с организмом донора-реципиента. В рамках нашего проекта мы планируем создавать культивированную сердечную ткань из плюрипотентных клеток. По-видимому, это направление станет столбовой дорогой регенерационной медицины в ближайшее десятилетие, поскольку, как уже отмечено, снимает проблемы иммунной совместимости, а в идеале могло бы проводиться in situ, скажем, заменяя соединительнотканные клетки инфарктного рубца в здоровые кардиомиоциты.
3. Что в итоге?
Не буду останавливаться на формальных показателях, таких как количество публикаций, докладов на конференциях и т. п. Безусловно, все взятые обязательства будут выполнены. Однако они не являются самоцелью. Реальная цель — это
• организация в МФТИ биофизической лаборатории, оборудованной по последнему слову техники и укомплектованной высококвалифицированными молодыми специалистами;
• тесное слияние, «фьюжн», научных задач лаборатории как с другими подразделениями НОЦ «Бионанофизика», созданными и создающимися, так и кооперация в рамках фармкластера «Северный»;
• развитие международного обмена и превращение НОЦ «Бионанофизика» в узловой пункт (hub) международной научной кооперации, связывающий такие признанные научные центры, как Гренобль, Юлих, Киото — ив перспективе многие другие.
Так ли всё безоблачно сейчас? Увы, нет. Во всяком случае мой опыт ещё советской волокиты оказался явно недостаточным для современной России: все делается ещё раза в два медленнее и бестолковее. Кроме того, до сих пор не существует ясности, что произойдёт с финансированием новых лабораторий, созданных по Программе 220, после 31 декабря 2012 г. Рассчитывать на то, что новые научные коллективы мгновенно начнут зарабатывать деньги, потребные на поддержание их активности, по крайней мере, наивно. Например, в США период становления новых исследовательских коллективов составляет не менее 5 лет, что, кстати, отражено в структуре наиболее базовых грантов NIH R01. Но поскольку нельзя создать ничего, не будучи оптимистами, будем помнить, что «дорогу осилит идущий».
Литература
1. http://www.p220.ru/
2. Davidenko J. M., Pertsov A. V., Salomonsz R., Baxter W., Jalife J. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle // Nature. - 1992. - V. 355. - P. 34951.
3. Agladze K., Kay M. W., Krinsky Y., Sarvazyan N. Interaction between spiral and paced waves in cardiac tissue // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2007. - V. 293. - P. 5355.
4. Allessie M. A., Bonke F. I., Schopman F. J. Circus movement in rabbit atrial muscle as a mechanism of trachycardia. // Circ. Res. - 1973. - V. 33. - P. 54-62.
5. Jalife J. Ventricular fibrillation: mechanisms of initiation and maintenance // Annual Rev. Physiol. - 2000. - V. 62. - P. 25-50.
6. Krinsky V. I. Spread of excitation in an inhomogeneous medium (state similar to cardiac fibrillation) // Biofizika. - 1966. - V. 11. - P. 676-683.
7. Kleber A. G., Rudy Y. Basic mechanisms of cardiac impulse propagation and associated arrhythmias // Physiol. Rev. - 2004. - V. 84. - P. 431-88.
8. Winfree A. T. When Time Breaks Down: The Three-Dimensional Dynamics of Chemical Waves and Cardiac Arrhythmias // Princeton University Press, 1987.
9. Isomura A., Horning M., Agladze K., Yoshikawa K. Eliminating spiral waves pinned to an anatomical obstacle in cardiac myocytes by high-frequency stimuli // Phys. Rev. E. -2008. - V. 78. - 066216.
10. Arrenberg A. B., Stainier D. Y., Baier H., Huisken J. Optogenetic control of cardiac function // Science. - 2010. - V. 330. - P. 971-974.
11. Magome N., Agladze K. Patterning and excitability control in cardiomyocyte tissue culture // Physica D. - 2010. - V. 239. - P. 1560-1566.
12. Magome N., Kanaporis G., Moisan N., Tanaka K., Agladze K. Photo-Control of Excitation Waves in Cardiomyocyte Tissue Culture // Tissue Eng. Part A. - 2011. - В печати.
13. http://expert.ru/expert/2009/28/svet_napravlyauschiy_serdce/
14. Orlova Y., Magome N., Liu L., Chen Y., Agladze K. Electrospun nanofibers as a tool for architecture control in engineered cardiac tissue // Biomaterials. - 2011. - V. 32. -P. 5615-5624.
15. Yoshida Y., Yamanaka S. iPS cells: a source of cardiac regeneration // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2011. - V. 50. - P. 327-332.
Поступила в редакцию 16.09.2011
