CC BY
574
гомТГмоТГгТсГгбз Краткие сообщения
БИФИДУМ-СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ
Л.В. Домотенко, А.П. Шепелин
ФБУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Россия
Резюме. Проведена оценка качества сухой питательной среды для культивирования и выделения бифидобак-терий (Бифидум-среда) в сравнительных испытаниях со средой Блаурокка. Показано, что Бифидум-среда поддерживает типичный рост штаммов бифидобактерий пяти основных видов: Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. adolescentis, B. infantis, B. longum. При исследовании пробиотического препарата бифидумбактерина получены сопоставимые результаты по его эффективности и активности кислотообразования при использовании обеих сред. При анализе клинического материала (кал на дисбактериоз) средняя концентрация бифидобак-терий составила 8,15 lg КОЕ/г на Бифидум-среде и 6,68 lg КОЕ/г на среде Блаурокка.
Ключевые слова: питательные среды, Bifidobacterium, бифидобактерии, выделение бифидобактерий, пробиотики.
Введение
Бифидобактерии являются анаэробными, грамположительными бактериями, которые доминируют в кишечной микрофлоре здоровых людей [10]. Наличие высокого уровня бифидобактерий в кишечнике человека предполагает их весомый вклад в здоровье человека, что привело к использованию бифидобактерий как пробиотиков. Положительный эффект бифидобактерий показан при различных заболеваниях, например, диарее, связанной с ротавирусной инфекцией и некоторыми воспалительными кишечными заболеваниями, с приемом антибиотиков и др. [14]. Существует мнение о положительной роли бифидобактерий в стимулировании иммунитета [11].
Для выделения бифидобактерий из фекалий, обнаружения и подсчета их в пробиотиче-ских продуктах широко применяется культу-ральный метод с использованием питательных средах. В литературе описано значительное количество прописей питательных сред для выделения и культивирования бифидобакте-рий [8, 12]. Среди них есть агаризованные и полужидкие питательные среды, селективные и неселективные. Агаризованные питательные
среды удобны для выделения чистой культуры микроорганизма, но при их использовании для выделения бифидобактерий требуется создание анаэробных условий и происходит снижение результатов на 1—2 порядка [7]. Полужидкие среды, разлитые в стеклянные пробирки, лишены перечисленных недостатков.
Существуют селективные среды для бифидобактерий [13, 15]. Но поскольку род Bifidobacterium включает более 30 видов, отличающихся значительной гетерогенностью в отношении устойчивости к противоми-кробным препаратам и другим ингибиторам [1], сложно разработать одну среду с высокой селективностью при сохранении хорошей степени выделения. Поэтому в лабораторной практике чаще используют неселективные питательные среды.
Основной средой, нашедшей широкое применение как при выделении бифидобактерий из фекалий, так и при контроле производства бактерийных препаратов и молочнокислых продуктов, является полужидкая печеночно-цистеиновая среда Блаурокка [4, 6]. Некоторые лаборатории клинической микробиологии выделяют бифидобактерии на тиогликолевой среде [9].
Авторы:
Домотенко Л.В., к.х.н., зав. лабораторией разработки питательных сред ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Россия;
Шепелин А.П., д.б.н., зам. директора по научно-производственной деятельности ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, п. Оболенск, Московская область, Россия.
Адрес для переписки:
Домотенко Любовь Викторовна
142279, Россия, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора. Тел./факс: 8 (4967) 36-00-17. E-mail: [email protected]
поступила в редакцию 17.06.2014 принята к печати 27.06.2014
© Домотенко Л.В., Шепелин А.П., 2014
Среда Блаурокка — это среда лабораторного изготовления. Каждая лаборатория, как правило, готовит ее самостоятельно небольшими партиями, что отрицательно отражается на ее стандартности. Кроме этого, учитывая нестандартность исходного сырья — печени, которая в результате изменения окружающей среды, использования в рационе животных большого количества антибиотиков, может содержать токсичные вещества, в связи с чем становится актуальным применение коммерческих сухих питательных сред, отличающихся своей стандартностью.
В ФБУН ГНЦПМБ разработана сухая неселективная питательная среда, предназначенная для выделения и культивирования бифидобак-терий — Бифидум-среда, налажен ее промышленный выпуск. В ряде публикаций описано применение Бифидум-среды для научных и диагностических целей [2, 3]. Целью настоящей работы явилась оценка свойств Бифидум-среды при работе с музейными штаммами бифидо-бактерий, клиническим материалом и анализе пробиотиков.
Материалы и методы
Для контроля качества питательных сред использовали тест-штаммы B. bifidum АТСС 11863, B. breve АТСС 15701, B. adolescentis АТСС 15706, B. infantis АТСС 15702, B. longum АТСС 15708, Escherichia coli 3912/41 (O55:K59), Pseudomonas aeruginosa 27/99, Proteus vulgaris HX 19222, Enterobacter aerogenes NCTC 10006, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Lactobacillus delbrueckii ATCC 11842, Staphylococcus aureus Wood-46, полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГКПМ-Оболенск, а также клинические штаммы Bifidobacterium и производственные штаммы B. bifidum.
Штаммы хранили в лиофилизированном состоянии при температуре не выше 4—8°С. Перед использованием их суспензировали в стерильном 0,9 % растворе хлорида натрия и субкульти-вировали на среде Блаурокка в течение 20—24 ч при температуре 37±1°C, после чего готовили микробную взвесь каждого штамма по отраслевому стандартному образцу мутности ОСО 42-28-86П. Полученные суспензии каждого тест-штамма десятикратными разведениями доводили до разведения 10-8. Посев в питательные среды, разлитые по 9 мл в стеклянные бактериологические пробирки, производили по 1 мл. Учет результатов проводили не позднее 48 ч инкубации при температуре 37±1°С визуально по наличию типичных колоний бифидобактерий.
В качестве контрольной среды использовали среду Блаурокка лабораторного приготовления.
Качество питательных сред оценивали в соответствии с требованиями МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических пи-
тательных сред». Активность кислотообразо-вания штаммов бифидобактерий определяли титриметрическим методом по ФС 42-3947-00 на бифидумбактерин, сухой при культивировании в опытной и контрольной средах. Кислотность выражали в градусах Тернера (°Т) и вычисляли по формуле:
°Т = А х К х 10, где
А — количество миллилитров 0,1 М раствора натрия гидроксида, пошедшее на титрование 10 мл микробной суспензии; К — поправка к титру 0,1 М раствора натрия ги-дроксида;
°Т — условная величина, выраженная в градусах Тернера.
Результаты и обсуждение
Оценку свойств Бифидум-среды проводили в три этапа. На первом этапе исследования изучали биологические свойства Бифидум-среды с использованием музейных штаммов бифидобактерий. На втором этапе Бифидум-среду испытывали при контроле бактерийных препаратов. Третий этап включал исследование клинического материала.
Первый этап исследований Бифидум-среды проведен с использованием 21 штамма Bifido-bacterium пяти видов. Свойства Бифидум-среды оценивали по наибольшему разведению лиофилизированных штаммов бифидобакте-рий, при котором наблюдался их типичный рост через 48 ч инкубирования, а затем при втором пассаже — по интенсивности нарастания микробной массы штаммов (эффективности) через 24 ч инкубации. Сравнительные результаты исследований представлены в табл. 1. Отмечены хорошие ростовые свойства Бифидум-среды, не уступающие среде Блау-рокка и позволяющие активно размножаться бифидобактериям.
Представленные в табл. 1 данные согласуются с результатами культивирования на Бифи-дум-среде новых запатентованных 7 штаммов B. bifidum, 5 штаммов B. longum и 3 штаммов B. adolescentis, предназначенных для получения бифидосодержащей продукции [5]. Показано, что все 15 штаммов активно наращивают микробную массу с высокой концентрацией би-фидобактерий (8—9 lg КОЕ/мл) и высокой кислотообразующей активностью при росте как на гидролизатно-молочной питательной среде, так и Бифидум-среде.
Активность кислотообразования, то есть способность штаммов бифидобактерий накапливать кислоты в процессе культивирования, является одним из основных показателей качества производственных штаммов бифидо-бактерий и препаратов, приготовленных с их использованием. Проведенные эксперименты
продемонстрировали влияние качества питательной среды на интенсивность проявления кислотообразующей способности пяти штаммов бифидобактерий (табл. 2). Как видно из таблицы показатель активности кислото-образования исследованных штаммов оказался значительно ниже на тиогликолевой среде, чем на Бифидум-среде и среде Блаурокка.
Поскольку Бифидум-среда может быть использована при подготовке производственных штаммов, дальнейшие исследования были посвящены проверке сохранения биологических характеристик тест-штаммов бифидобактерий при многократных пассажах на данной среде. Как показали результаты проведенных исследований, свойства бифидобактерий не изменялись на протяжении пяти пассажей на данной среде. Все тест-штаммы вырастали из разведения 10-7 через 24—48 ч инкубации при температуре 37±1°С в виде единичных колоний типа «зерен», «крошек», «тяжей», «комет». Клетки тест-штаммов сохраняли свою типичную морфологию: прямые или слегка изогнутые, с булавовидными утолщениями на конце, иногда ветвящиеся и образующие цепочки.
На втором этапе исследований Бифидум-среду использовали для определения концентрации бифидобактерий в пробиотическом препарате «Бифидумбактерин» различных фирм-изготовителей и различных форм выпуска (в порошке или в таблетках). При исследовании четырех коммерческих препаратов «Бифидумбактерина» получены сопоставимые результаты по КОЕ (колониеобразующие единицы) и активности кислотообразования и на Бифидум-среде, и среде Блаурокка независимо от формы выпуска препарата (табл. 3).
Дальнейшие исследования были посвящены клиническим испытаниям Бифидум-среды. Бифидум-среду использовали при проведении исследований на дисбактериоз проб фекалий, полученных от 28 пациентов, среди которых были 19 новорожденных, 7 детей в возрасте от 1,5 до 2 лет и двух взрослых (16 и 60 лет). Как показали результаты исследований, в материале от 9 новорожденных через 24 ч инкубации роста бифидобактерий не было обнаружено ни в Бифидум-среде, ни в контрольной среде Блаурокка. Через 48 ч инкубирования рост бифидобактерий отмечен на обеих средах. У 13 пациентов концентрация бифидобактерий на Бифидум-среде была на 1—2 порядка выше, чем на контрольной среде. Содержание бифидо-бактерий в группе обследованных лиц составило 8,15 КОЕ/г при посеве фекалий в Бифидум-среду и 6,68 КОЕ/г при посеве в контрольную среду. Характерный рост бифидобактерий в виде «комет» наблюдался только в 5 пробах. В остальных случаях обнаруживалось равномерное помутнение сред. Микроскопическое
ТАБЛИЦА 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ИСПЫТАНИЙ БИФИДУМ-СРЕДЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ
Вид Штамм Чувствительность/ эффективность (КОЕ/мл)
Бифидум-среда Среда Блаурокка
B. bifidum 1 10-7/8 х 108 10-7/1 х 109
ЛВА-3 10-7/3 х 108 108/3 х 108
791 108/4 х 108 108/2 х 109
АТСС 11863 10-7/1 х 108 10-7/1 х 108
B. longum В 379 М 10-8/2 х 108 108/6 х 109
МС-42 10-7/2 х 108 108/2 х 108
АТСС 15708 10-7/1 х 108 10-7/2 х 108
B. adolescentis ГО-13 108/4 х 108 108/7 х 108
Г 751 3 10-8/5 х 107 109/5 х 108
АТСС 15706 10-7/2 х 108 10-7/1 х 108
B. breve 79-119 10-8/2 х 109 108/3 х 109
АТСС 15701 10-7/3 х 108 10-7/2 х 108
B. infantis 73-15 10-7/3 х 108 10-6/5 х 108
79-43 10-8/1 х 108 10-6/5 х 108
АТСС 15702 10-7/2 х 108 10-7/2 х 108
исследование этих проб подтверждало наличие в них наличие бифидобактерий.
Поскольку Бифидум-среда не является селективной средой, многие микроорганизмы могут расти на ней. Однако характер роста их различен. Так, энтерококки и лактобациллы растут на среде аналогично бифидобактериям: в виде «тяжей», «комет». При культивировании E. coli и E. aerogenes происходит диффузное помутнение среды с газообразованием. S. aureus растет в виде диффузного помутнения в верхней части столбика среды с отрастающими вниз отдельно расположенными колониями в виде
ТАБЛИЦА 2. АКТИВНОСТЬ КИСЛОТООБРАЗОВАНИЯ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ НА РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ, °Т
Штамм Бифидум-среда Среда Блаурокка Тиогликолевая среда
B. bifidum АТСС 11863 90±5 89±5 45±6
B. longum АТСС 15708 100±9 105±6 35±5
B. adolescentis АТСС 15706 100±8 102±13 38±4
B. breve АТСС 15701 106±12 108±9 53±9
B. infantis АТСС15702 105±5 100±8 39±5
ТАБЛИЦА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЕ И АКТИВНОСТИ КИСЛОТООБРАЗОВАНИЯ БИФИДУМБАКТЕРИНА НА РАЗЛИЧНЫХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
Называние препарата, форма, серия,срок годности Фирма-производитель Бифидум-среда Среда Блаурокка
КОЕ Активность кислото-образования,°Т КОЕ Активность кислото-образования, °Т
Бифидумбактерин, порошок, серия 272-31013, годен до 11.14 ЗАО «Партнер» 3 х 109/ 5 доз 150 3 х 109/ 5 доз 115
Бифидумбактерин порошок, серия 225-2091, годен до 10.14 ЗАО «Партнер» 2 х 109/ 5 доз 145 3 х 109/ 5 доз 120
Бифидумбактерин лиофилизат, серия 362, годен до 01.15 ЗАО «Экополис» 2 х 109/ 5 доз 159 1 х 109/ 5 доз 120
Бифидумбактерин 1000, таблетки, серия 11001, от 10.2013 ООО «Экко плюс» 2 х 105/ таблетка 59 2 х 105/ таблетка 60
«гвоздиков». В процессе роста P. vulgaris наблюдается диффузное помутнение среды. Штамм P. aeruginosa 27/99 растет на Бифидум-среде в виде диффузного помутнения в верхней части столбика среды (рис., II обложка). Поэтому использование неселективных питательных сред, включая среду Блаурокка и Бифидум-среду, при анализе клинического материала предусматривает проведение обязательной бактериоскопии посевов. При просмотре мазков, окрашенных по Граму, учитывают разведение, при котором в мазке выявляются грамположи-тельные палочки с типичной морфологией би-фидобактерий.
Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали, что Бифидум-среда может быть успешно применена и при изучении штаммов бифидобактерий, и при анализе пробиотических препаратов, и при анализе фекалий. Причем, сравнение Бифидум-среды с широко используемой печеночной средой Блаурокка не только не выявило различий в ростовых свойствах питательных сред, но и в ряде случаев обнаружило некоторые преимущества. Проведенные испытания показали возможность замены печеночной среды на коммерческую Бифидум-среду, которая выпускается в сухом виде и имеет длительный срок хранения.
Russian Journal of Infection and Immunity = Infektsiya i immunitet , _ __ __ _ __ ..
2014, vol. 4,no. 3, pp. 279-283 У У SHORT COMMUNICATIONS
Received 17.06.2014 Accepted 27.06.2014
BIFIDUM-MEDIUM FOR ISOLATION AND CULTIVATION OF BIFIDOBACTERIA
Domotenko L.V., Shepelin A.P.
State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russian Federation
Abstract. The comparative evaluation of Bifidum-medium quality (the nutrient medium for cultivation and selection bifidobacteria, dry) and Blaurock medium has been performed. It was shown that Bifidum-medium supports the typical growth of the main types of bifidobacteria: Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. adolescentis, B. infantis, B. longum. The comparable results for the efficacy and the activity accumulation of acid were obtained in the study of probiotic «bifi-dumbacterin» using both media. In studies of faecal material the medium concentration of bifidobacteria was found 8.15 lg CFU/g on Bifidum-medium and 6.68 lg CFU/g on Blaurock medium.
Key words: nutrient media, Bifidobacterium, bifidobacteria, isolation of bifidobacteria, probiotics. Authors:
Domotenko L.V.EI, PhD (Chemistry), Head of Nutrient Media Laboratory, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology; 142279, Russian Federation, Moscow region, Obolensk; Phone/fax: 8 (4967) 36-00-17. E-mail: [email protected]
Shepelin A.P., PhD, MD, Deputy Director, State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow region, Russian Federation.
Список литературы/References
1. Дармов И.В., Чичерин И.Ю., Погорельский И.П., Лундовских И.А., Тетерина И.С. Экспериментальное изучение чувствительности микроорганизмов пробиотиков к антибактериальным препаратам. Экспер. и клин. гастроэнтерология. 2011. № 9. С. 102-107. [Darmov I.V., Chicherin I.Yu., Pogorel'skiy I.P., Lundovskikh I.A., Teterina I.S. Eksperimental'noe izuchenie chuvstvitel'nosti mikroorganizmov probiotikov k antibakterial'nym preparatam [Experimental study of the sensitivity for probiotics microorganisms to antibiotics]. Eksper. i klin. gastroenterologiya = Experimental and Clinical Gastroenterology, 2011, no. 9, pp. 102—107.].
2. Маградзе Е.И., Шубина И.В., Семакина С.А., Марков В.Н. Зависимость динамики роста бактерий вида Escherichia coli от параметров предварительного совместного культивирования с бактериями вида Bifidobacterium bifidum // Вестник Удмуртского университета. 2005. № 10. С. 57-64. [Magradze E.I., Shubina I.V., Semakina S.A., Markov V.N. Zavisimost' dinamiki rosta bakteriy vida Escherichia coli ot parametrov predvaritel'nogo sovmestnogo kul'tivirovaniya s bakteriyami vida Bifidobacterium bifidum [Dependence of the growth dynamics of Escherichia coli on the parameters of the prior co-culture with Bifidobacterium bifidum]. Vestnik Udmurtskogo universiteta = Bulletin of Udmurt University, 2005, no. 10, pp. 57—64.].
3. Метод определения бифидобактерий в пищевых продуктах. МЗ Республики Беларусь. Рег. № 071-0210. Введен 19 марта 2010 г. [Metod opredeleniya bifidobakteriy vpishchevykh produktakh. MZRespubliki Belarus'[ Method for determination of the bifidobacteria in foods. Ministry of Health of the Republic of Belarus]. Reg. # 071-0210, Introduced in March 19, 2010.
4. Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах // Методические указания. МУК 4.2.999-00. М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2000. 13 с. [Opredelenie kolichestva bifidobakteriy v kislo-molochnykh produktakh // Metodicheskie ukazaniya. MUK 4.2.999-00 [Determination of the bifidobacteria number in dairy products. Methodological guidance. MUK 4.2.999-00]. Moscow: Federal Center for Sanitary Inspection Ministry of Health of RF, 2000, 13 p.].
5. Патент РФ №№ 2427626, 2427627, 2427628, 2427629, 2427630, 2427631, 2427632, 2427633, 2427634, 2427635, 2427636, 2427637, 2427638, 2427639, 2427640. Штамм Bifidobacterium bifidum, используемый для получения бифидосодержащей продукции: 2010. Опубл. 27.08.2011, Бюл. № 24. [Htamm Bifidobacterium bifidum, ispol'zuemyy dlya polucheniya bifidosod-erzhashcheyproduktsii: 2010. [Strain of Bifidobacterium bifidum, used for bifidoproduction: 2010]. RF Patent ## 2427626, 2427627, 2427628, 2427629, 2427630, 2427631, 2427632, 2427633, 2427634, 2427635, 2427636, 2427637, 2427638, 2427639, 2427640. Publ. 27.08.2011, Bull. no. 24.].
6. Продукты кисломолочные, обогащенные бифидобактериями бифидум. Технические условия: ГОСТ Р 52687-2006. Введ. 27.12.2006. М.: Стандартинформ, 2007. 43 с. [Produkty kislomolochnye, obogashchennye bifidobakteriyami bifidum. Tekhnicheskie usloviya: GOSTR 52687-2006. Vved. 27.12.2006. [Fermented milk products enriched with bifidobacterium bifidum. Technical conditions: GOST R 52687-2006, Enter. 27.12.2006]. M.: Standartinform, 2007, 43 p.].
7. Совершенствование методов диагностики дисбактериоза толстого кишечника // Информационное письмо. СПб., 2002. 31 с. [Sovershenstvovanie metodov diagnostiki disbakterioza tolstogo kishechnika [Improvement of diagnostic methods of colon dysbiosis]. Newsletter, St. Petersburg, 2002, 31 p.].
8. Терновская Л.Н., Калинина Т.Э., Суханова С.М., Гапон М.Н. Питательная среда для выделения и культивирования бифидобактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2011. № 6. С. 124-125. [Ternovs-kaya L.N., Kalinina T.E., Sukhanova S.M., Gapon M.N. Pitatel'naya sreda dlya vydeleniya i kul'tivirovaniya bifidobakteriy [Medium for isolation and cultivation bifidobacteria]. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii = Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology, 2011, no. 6, pp. 124—125.].
9. Юринова Г.В., Попкова С.М., Немченко У.М., Андрухова В.Я., Серых Т.А., Иванова Е.И. Качественная характеристика бифидосодержащих продуктов функционального питания на молочной основе как корректоров микроэкологических нарушений // Современные наукоемкие технологии. 2010. № 10. С. 32. [Yurinova G.V., Popkova S.M., Nemchenko U.M., Andrukhova V.Ya., Serykh T.A., Ivanova E.I. Kachestvennaya kharakteristika bifidosoderzhashchikh produktov funktsional'nogo pitaniya na molochnoy osnove kak korrektorov mikroekologicheskikh narusheniy [Qualitative characteristic of the bifidocon-taining products for the functional food based on milk as proofreaders of micro ecological violations]. Sovremennye naukoemkie tekhnologii = Modern High Technologies, 2010, no. 10, p. 32.].
10. Biavati B., Vescovo M., Torriani S., Bottazzi V. Bifidobacteria: history, ecology, physiology and applications. Ann. Microbiol., 2000, vol. 50, pp. 117-131.
11. Menard O., Butel M.-J., Gaboriau-Routhiau V., Waligora-Dupriet A.-J. Gnotobiotic mouse immune response induced by Bifidobacterium sp. strains isolated from infants. Appl. Environ. Microbiol., 2008, vol. 74, pp. 660-666.
12. Methods for the official control of probiotics used as feed additives, final report SMT4-CT98-2235, vol. 2. Luxembourg: Office for Official Publications of the European Communities, 2002, 157p.
13. Nebra Y., Blanch A.R. A New Selective Medium for Bifidobacterium spp. Appl. Environ. Microbiol, 1999, vol. 65, pp. 5173-5176.
14. Picard C., Fioramonti J., Francois A., Robinson T., Neant F., Matuchansky C. Review article: bifidobacteria as probiotic agents — physiological effects and clinical benefits. Aliment. Pharmacol. Ther., 2005, vol. 22, pp. 495-512.
15. Tharmaraj N. Selective enumeration of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, bifidobacteria, Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, and propionibacteria. J. Dairy Sci., 2003, vol. 86, pp. 2288-2296.
