Белок рабин-8 взаимодействует с GTP-азой Rheb и ингибирует фосфорилирование Ser235/Ser236 в белке S6 малой рибосомной субъединицы Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 57.052.6

Белок рабин-8 взаимодействует с GTP-азой Rheb и ингибирует фосфорилирование Ser235/Ser236 в белке S6 малой рибосомной субъединицы

А. А. Пархитько1,2,3*, О. О. Фаворова1, E. P. Henske2,3

1ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет

им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития РФ, 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

2Fox Chase Cancer Center, 333 Coliman Avenue, Philadelphia, USA, 19111

3Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 1 Blackfan Circle, Boston, USA, 02155

*E-mail: [email protected]

Поступила в редакцию 18.05.2011 г.

РЕФЕРАТ Серин/треониновая протеинкиназа mTOR, взаимодействуя с белками Raptor, mLST8, PRAS40 и Deptor, образует киназный комплекс mTORCl, играющий ключевую роль в регуляции биосинтеза белков, транскрипции, клеточного метаболизма, апоптоза и аутофагии, в частности посредством направленного фосфорилирования киназ белка S6 малой рибосомной субъединицы. Известно, что киназный комплекс mTORCl активируется факторами роста и аминокислотами через активацию GTP-азы Rheb. В представленной работе впервые показано, что сверхэкспрессия в культуре клеток эмбриональной почки человека белка Rabin8 (далее - рабин-8), функционирующего в качестве фактора обмена гуаниновых нуклеотидов для GTP-азы Rab8, приводит к снижению фосфорилирования Ser235/Ser236 в рибосомном белке S6. Напротив, снижение экспрессии белка рабин-8 с помощью малых интерферирующих РНК (siPHK, small interfering RNA) приводит к повышению уровня фосфорилирования Ser235/Ser236 в белке S6. Показано также, что рабин-8 связывается с GTP-азой Rheb. Полученные результаты могут свидетельствовать о существовании ранее неизвестного механизма модуляции функциональной активности киназного комплекса mTORCl и о регуляции управляемых им процессов, в первую очередь биосинтеза белков. Принимая во внимание роль рабина-8 как одного из важных регуляторов процесса образования клеточной реснички (цилиогенеза), можно предположить существование связи между этими процессами и образованием первичной реснички.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА комплекс mTORCl, Rheb, рабин-8, белок S6 малой рибосомной субъединицы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ДМЕМ - питательная среда Игла в модификации Дульбекко; ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка; GAP-белки - активирующие GTP-азу белки; mTOR - протеинкиназа, мишень для рапамицина у млекопитающих (mammalian target of rapamycin); Rheb - GTP-аза, гомолог белка Ras (Ras homolog enriched in brain); siPHK - малые интерферирующие РНК; TBST - буфер для блотинга (Tris-Buffered Saline and Tween 20).

ВВЕДЕНИЕ

Высококонсервативная серин/треониновая протеинкиназа mTOR (mammalian target of rapamycin, мишень для рапамицина у млекопитающих) принадлежит к семейству фосфатидилинозитолки-наз PIKK (phosphatidyl inositol 3' kinase-related kinases) и является ключевым ферментом mTOR-сигнального пути, регулирующего накопление клеточной массы у многих эукариот. В качестве каталитической субъединицы mTOR входит в состав

двух функционально различных гетероолигомерных комплексов: mTORCl и mTORC2. mTORCl представляет собой функциональный димер, содержащий по две субъединицы каждого из белков: mTOR, Raptor (regulatory associated protein of mTOR), mLST8 (mammalian lethal with sec-13), PRAS40 (proline-rich AKT substrate 40 kDa) и Deptor (DEP-domain-containing mTOR-interacting protein) [1, 2]. Основная функция mTORCl - фосфорилирование в ответ на сигналы внешней среды широкого спек-

тра эффекторов, регулирующих процессы белкового синтеза, клеточного деления, апоптоза и аутофагии [3, 4]. mTORCl регулирует трансляцию путем прямого фосфорилирования белка 4E-BP (translation initiation factor 4E binding protein), связывающегося с фактором инициации 4E, и киназ S6K1 и S6K2 белков S6 малой рибосомной субъединицы [5]. Эти киназы, в свою очередь, активируют процессы трансляции, фосфорилируя белок S6, а также ряд других белков (SKAR, PDCD4, eEF-2K, eIF4B). Определение уровня фосфорилирования белка S6 с помощью фосфоспецифичных антител против Ser235/Ser236 используется для оценки киназной активности комплекса mTORCl [6].

Активность комплекса mTORCl регулируется множеством различных стимулов, таких, как ростовые факторы, аминокислоты, глюкоза и кислород. При этом используются два основных механизма - направленные модификации компонентов этого комплекса или регуляция GTP-азы Rheb, которая в связанном с GTP состоянии взаимодействует непосредственно с mTORCl и активирует его. Основной регулятор GTP-азы Rheb - это гетеродимерный комплекс, который состоит из двух белков-супрессоров опухолевого роста: активирующего GTP-азу белка (GAP-белка) туберина и гамартина, стимулирующего переход GTP-азы Rheb из активной GTP-связанной формы в неактивную GDP-связанную. Их инактивация приводит к тому, что GTP-аза Rheb находится в стабильно активной форме и активирует комплекс mTORCl. В результате повышается белоксинтезиру-ющая активность и наблюдается неконтролируемое деление клеток [7].

Показано также, что туберин и гамартин влияют на формирование первичной реснички [8]. В образовании первичной реснички участвует и GTP-аза Rab8, и взаимодействующий с ней фактор обмена гуаниновых нуклеотидов рабин-8 [9], который активирует Rab8, стимулируя высвобождение GDP и связывание GTP [l0].

Исходя из сказанного, мы предположили, что ра-бин-8 также может выполнять роль регулятора GTP-азы Rheb, участвующей в работе комплекса mTORCl. В представленной работе показано, что сверхэкспрессия белка рабин-8 приводит к снижению активности комплекса mTORCl, а подавление с помощью siPHK синтеза рабина-8, как и туберина, приводит к активации mTORCl. Методом коиммунопреципитации показано, что белок ра-бин-8 действительно взаимодействует с GTP-азой Rheb. На основе представленных данных можно заключить, что белок рабин-8, связываясь с GTP-азой Rheb, действует как негативный регулятор киназного комплекса mTORCl.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАя ЧАСТЬ

Реактивы и препараты

Культуру клеток эмбриональной почки человека HEK293 (АТСС, США) культивировали в среде ДМЕМ с добавлением l0% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) («Gibco», США) или без нее. Использовали антитела к белку рабин-8 («Proteintech», США), туберину («Abcam»), Myc, Р-актину и mTOR, фосфоспецифические антитела к Ser235/Ser236 ри-босомного белка S6 («Cell Signaling», США) и кроличьи IgG («Santa Cruz Biotechnology», США).

Трансфекция

Для трансфекции культуры клеток HEK293 плаз-мидными конструкциями использовали реагент Fugene 6 («Roche», США), а различными siPHK -Trans-IT TKO («Mirus», США) в соответствии с рекомендациями производителей. Клетки HEK293 трансфицировали контрольным вектором pcDNA3.l, вектором, экспрессирующим рабин-8, контрольным вектором pCMVTag3A или вектором, экспрессирующим слитый белок Myc-Rheb, порознь или попарно. Через 24 ч после трансфекции клетки дважды промывали и добавляли среду с ростовыми факторами или без них. Через 24 ч после замены среды киназную активность комплекса mTORCl анализировали по уровню фосфорилирования рибосомного белка S6 с помощью иммуноблотинга с использованием фос-фоспецифичных антител против Ser235/Ser236 белка S6. Клетки HEK293 также трансфицировали контрольной siPHK, siPHK против мРНК белка рабин-8 или туберина («Dharmacon», США), и через 24 ч после трансфекции клетки дважды промывали и добавляли среду с ростовыми факторами или без них.

Коиммунопреципитация

С целью изучения возможности коиммунопреци-питации белка рабин-8 с Myc-Rheb и реципрокной коиммунопреципитации белка Myc-Rheb с белком рабин-8 и киназой mTOR клетки обрабатывали буфером для лизиса («Cell Signaling», США). Клеточные экстракты инкубировали с антителами к раби-ну-8 или Myc в течение l2 ч при 4°С. Полученные комплексы осаждали инкубацией с белок-А-агарозой в течение l ч при 4°С с последующим центрифугированием. Белки элюировали, добавляя буфер Лэммли, наносили на денатурирующий градиентный 4-20% полиакриламидный гель и после электрофореза переносили на поливиниловые мембраны (Immobilon-P, «Millipore», США). Мембраны выдерживали в буфере TBST (l37 мM NaCl, 0.l% Tвин-20, 20 мM Tрис, pH 7.6) («Cell Signaling», США), содержащем 5% сухого молока, в течение l ч, а затем инкубировали с вы-

U

I—

п

\о

о4

О

+

£

т

^ я

т

fN

и

/v *

; ^ ^ о

-ч- ■■ГМ +

£ 3*.

пп

Рабин-8 - + - + - +

£

Рабин-8

в-актин

Фосфо^б

Ser235/236

56 кДа 45 кДа

32 кДа

1 2 3 4 5 6

Рис. 1. Сверхэкспрессия рабина-8 в культуре клеток НЕК293 снижает активность киназного комплекса mTORC1. Клетки трансфицировали контрольным вектором pcDNA3.1 (дорожки 1, 3, 5) или вектором, экспрессирующим рабин-8 (дорожки 2, 4, 6). Активность mTORC1 анализировали по уровню фосфорилирования рибосомного белка S6 с помощью иммуноблотин-га с фосфоспецифическими антителами против S6 ^ег235^ег236) в среде, содержащей ростовые факторы (дорожки 1, 2), в отсутствие ростовых факторов (дорожки 3, 4) и при стимуляции клеток, выдержанных в течение 24 ч в среде без ростовых факторов, средой с ростовыми факторами в течение 15 мин (дорожки 5, 6). Уровни рабина-8 и Р-актина оценивали методом иммуноблотинга со специфическими антителами.

бранными первичными антителами при 4°С в течение ночи, промывали 2 раза по 5 мин в буфере TBST и добавляли соответствующие вторичные антитела («Amersham», США). Мембраны промывали 3 раза по 10 мин в буфере TBST, хемилюминесцентный сигнал регистрировали при экспозиции с рентгеновской пленкой («Kodak», США), используя набор для хеми-люминесценции («Регкт-Е1тег», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Рабин-8 снижает активность киназного комплекса mTORC1

Роль белка рабин-8 в регуляции активности комплекса тТОБС1 мы выясняли с использованием наиболее часто применяемой в таких опытах клеточной линии НЕК293 [11]. Клетки трансфицировали контрольным вектором pcDNA3.1 (рис. 1, дорожки 1, 3, 5) или вектором, экспрессирующим рабин-8 (рис. 1, дорожки 2, 4, 6). В случае контрольного вектора при наличии в среде ростовых факторов (рис. 1, дорожка 1) ком-

плекс тТОБС1 активирован, о чем свидетельствует уровень фосфорилирования рибосомного белка S6 (нижняя панель). В отсутствие ростовых факторов (рис. 1, дорожка 3) происходит частичное ингибирование киназной активности тТОБС1, а последующая кратковременная стимуляция клеток, выдержанных в таких условиях, средой, содержащей ростовые факторы (рис. 1, дорожка 5), приводит к полной реактивации комплекса тТОБС1. Высокий уровень белка рабин-8, обусловленный трансфекцией клеток вектором, экспрессирующим рабин-8 (верхняя панель), не влиял на активность киназного комплекса тТОБС1 (рис. 1, дорожка 2) в среде, содержащей ростовые факторы, но приводил к снижению активности тТОБС1 в их отсутствие (рис. 1, дорожка 4) и при реактивации этого комплекса средой, содержащей ростовые факторы (рис. 1, дорожка 6).

Ингибирование экспрессии рабина-8 или тубери-на приводит к активации киназного комплекса mTORC1

Полученные при сверхэкспрессии рабина-8 данные о влиянии этого белка на активность киназного комплекса тТОБС1 мы подтверждали с использованием siРНК - коротких синтетических РНК-дуплексов, которые в составе комплекса со специальными белками вызывают направленную деградацию комплементарной им мРНК. В качестве отрицательного и положительного контролей использовали siРНК, не имеющую комплементарной последовательности в геномных мРНК человека (контрольная siРНК), и siРНК против мРНК туберина - белка, который, как указывалось выше, образует гетеродимерный комплекс с гамартином. Этот комплекс ингибирует активность GTP-азы Б^еЬ и соответственно киназного комплекса тТОБС1. При трансфекции клеток контрольной siРНК (рис. 2, дорожки 1, 4, 7) так же, как и при трансфекции контрольным вектором (см. рис. 1), присутствие в среде ростовых факторов (рис. 2, дорожка 1) приводит к активации киназы тТОБС1. В отсутствие ростовых факторов (рис. 2, дорожка 4) наблюдается ингибирование киназной активности тТОБС1. При кратковременной (15 мин) стимуляции средой с ростовыми факторами клеток, выдержанных в среде без ростовых факторов в течение 24 ч (рис. 2, дорожка 7), происходит реактивация комплекса тТОБС1. Снижение экспрессии как тубе-рина, так и белка рабин-8, наблюдаемое при трансфекции siРНК против мРНК этих белков, стимулировало активность тТОБС1 при наличии в среде ростовых факторов (рис. 2, дорожки 2, 3). В отсутствие ростовых факторов активность комплекса тТОБС1 в клетках, трансфицированных siРНК против мРНК туберина, незначительно увеличивалась

Анти-туберин-siPHK

Анти-рабин-8-siPHK

Рабин-8

Туберин

U

I—

О4

О

+

зЕ т - + -

■ч

fN

£

- +

и /V *

1 ^ то ■ч

rs +

зе 5: i

ш ш < - + -- - +

----___----------- — 56 кДа

Фосфо-S6 Ser235/236 -

--------32 кДа

123456789

Рис. 2. Ингибирование экспрессии белка рабин-8 или туберина приводит к активации киназного комплекса mTORC1. Ингибирование экспрессии белка рабин-8 по механизму РНК-интерференции в культуре клеток НЕК293 приводит к активации киназного комплекса mTORC1 (дорожки 3, 9), как и в положительном контроле с антитубериновой siРНК (дорожки 2, 8). Активность комплекса mTORC1 анализировали как на рис. 1 в среде, содержащей ростовые факторы (дорожки 1—3), в отсутствие ростовых факторов (дорожки 4—7) и при стимуляции клеток, выдержанных в течение 24 ч в среде без ростовых факторов, средой с ростовыми факторами в течение 15 мин (дорожки 7—9). Уровни рабина-8 и туберина оценивали методом иммунобло-тинга со специфическими антителами. Контрольная siРНК - дорожки 1, 4, 7.

(рис. 2, дорожка 5). При трансфекции siРНК против мРНК рабина-8 активность тТОБС1 не изменялась (рис. 2, дорожка 6) по сравнению с трансфекцией контрольной siРНК, а при реактивации средой, содержащей ростовые факторы, активность тТОБС1 была выше, чем в контроле (рис. 2, дорожки 8, 9).

Коиммунопреципитация белков рабин-8, Rheb и mTOR

Как следует из полученных нами результатов, ра-бин-8 является негативным регулятором киназного комплекса тТОБС1. Возможность взаимодействия между рабином-8, Б^еЬ и тТОБ мы изучали при помощи трансфекции культуры клеток НЕК293 одновременно контрольными векторами pcDNA3.1 и pCMVТag3A (рис. 3А, дорожка 1) или двумя векторами, экспрессирующими рабин-8 и слитый белок Мус-Б^еЬ (рис. 3А, дорожки 2-4), в среде, содержащей (рис. 3А, дорожки 1, 2) или не содержащей ростовые факторы (рис. 3А, дорожка 3), а также при последующей кратковременной стимуляции клеток,

выдержанных в течение 24 ч без ростовых факторов, средой, содержащей ростовые факторы (рис. 3А, дорожка 4). Для изучения взаимодействия рабина-8 и Б^еЬ мы провели коиммунопреципитацию клеточных лизатов с антителами против рабина-8 и последующий иммуноблотинг с антителами против эпитопа Мус слитого белка Мус-Б^еЬ (рис. 3Б). Оказалось, что взаимодействие Б^еЬ с рабином-8 не зависит от присутствия ростовых факторов в среде (рис. 3Б, дорожки 2-4). При этом мы не обнаружили Б^еЬ при иммунопреципитации с антителами против раби-на-8 в контрольном лизате без экспрессии Мус-^еЬ (рис. 3Б, дорожка 1) или в лизате, в котором для ко-иммунопреципитации использовали неспецифические контрольные кроличьи IgG (рис. 3Б, дорожка 5). Чтобы подтвердить взаимодействие белков рабин-8 и Б^еЬ, мы провели реципрокную коиммунопреципитацию. Клеточные лизаты инкубировали с антителами против эпитопа Мус слитого белка Мус-Б^еЬ, а для последующего иммуноблотинга использовали антитела против тТОБ и рабина-8. Как и ожидалось, Б^еЬ и тТОБ взаимодействовали в присутствии ростовых факторов в среде (рис. 3В, дорожки 2 и 4). ^еЬ и рабин-8 также взаимодействовали между собой в среде, содержащей ростовые факторы (рис. 3В, дорожки 2 и 4), однако в отсутствие ростовых факторов мы не обнаружили как взаимодействия Б^еЬ с рабином-8, так и Б^еЬ с тТОБ (рис. 3В, дорожка 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

В представленной работе мы впервые показали, что рабин-8 регулирует фосфорилирование Ser235/Ser236 в рибосомном белке S6. Ранее было установлено, что Ser235/Ser236 фосфорилируется протеинкиназой S6K1 в результате активации киназного комплекса тТОБС1, а ингибитор тТОБС1, рапамицин, полностью блокирует фосфорилирование этих остатков при любых условиях [2]. В соответствии с этим уровень фосфорилирования Ser235/Ser236 в белке S6 можно рассматривать как удобный индикатор киназной активности тТОБС1. Полученные нами данные позволяют предположить, что рабин-8 регулирует активность этого комплекса. Однако роль фосфорилирования белка S6 в регуляции белкового синтеза до конца не установлена. Так, получили линии мышей, в белке S6 у которых все подвергающиеся фосфорилированию аминокислотные остатки заменили нефосфорилируемыми остатками аланина, однако, уровень белкового синтеза в клетках различного типа у этих мышей остался таким же, как у мышей дикого типа [12].

Мы определяли уровень фосфорилирования Ser235/Ser236 белка S6 в различных условиях: при росте клеток в среде, содержащей ростовые фак-

+

+

Л

Рабин-8

Myc-Rheb

Рабин-8

Myc-Rheb

mTOR

в-актин

т т

■ч -ч

гм

и

I—

т

о4

О

+

Ш

3;

13

т

■ч

гм

и

I—

т

о4 о +

£ £

ш ш

£ зЕ

з 3

+ +

+ +

и

л * ' ^ то ■ч ■■-^ + зЕ^

ш ш

ЗЕЗЕ

+

+

12 3 4

т

■ч

т

■ч

гм гм

с; с; і— і—

т т

чР ЧР О4 О4

О О + + £ ^

и

і—

т

о4

о

+

:£

ш

ЗЕ

3

т

■ч

гм

с;

і—

т

т

■ч

т

■ч

£ £

+

56 кДа 23 кДа 289 кДа 45 кДа

3 3 3 3 3

Кроличьи IgG - - - - +

, Рабин-8 + + + + -

(иммунопреципитация) ,____________________

Myc-Rheb 23 кДа

1 2 3 4 5

В

Мус (иммунопреципитация)

Рабин-8

mTOR

Myc-Rheb

+ + +

1

2 3 4

56 кДа 289 кДа 23 кДа

Рис. 3. Коиммунопреципитация белков рабин-8 и Rheb, экспрессированных в клетках НЕК293 после их трансфекции соответствующими векторами. Уровни рабина-8, туберина, mTOR и Р-актина оценивали методом имму-ноблотинга со специфическими антителами. Л - Уровень экспрессии белков рабин-8, Myc-Rheb и mTOR после котрансфекции клеток контрольными векторами pcDNA3.1 и pCMVTag3A (дорожка 1) или векторами, экспрессирующими рабин-8 и слитый белок Myc-Rheb (дорожки 2—4), в среде с ростовыми факторами (дорожки 1, 2), без ростовых факторов (дорожка 3) и при стимуляции клеток, выдержанных в течение 24 ч в среде без ростовых факторов, средой с ростовыми факторами в течение 15 мин (дорожка 4). Б - Коиммунопреципитация лизатов как на рис. 3Л с использованием антител к белку рабин-8 (дорожки 1—4) или с контрольными кроличьими IgG-антителами (дорожка 5) и последующим иммуноблотингом с антителами против Муо Для иммунопреципитации с контрольными кроличьими IgG использовали лизат как на рис. 3Л (дорожка 2). В - Коиммунопреципитация лизатов как на рис. 3Л с использованием антител против эпитопа Myc и последующего иммуноблотинга с антителами против рабина-8, mTOR и Му^

торы (ДМЕМ + 10% ЭТС), при выдерживании клеток в среде без ростовых факторов (ДМЕМ), а также при кратковременной стимуляции ростовыми факторами (ДМЕМ -> ДМЕМ + 10% ЭТС) клеток, выдержанных в среде, не содержащей ростовые факторы. Так как регуляция киназного комплекса тТОИС1 осуществляется на нескольких уровнях, использование различных условий роста позволяет лучше понять механизмы регуляции [13]. Во всех случаях

мы использовали среду ДМЕМ, содержащую аминокислоты, поскольку отсутствие аминокислот приводит к полному ингибированию киназного комплекса тТОБС1 независимо от его негативного регулятора туберина [14]. В отсутствие ростовых факторов происходит активация GAP-белка туберина, стимулирующего переход GТP-азы Б^еЬ из активной GТP-связанной в неактивную GDP-связанную форму, что приводит к ингибированию киназного комплекса

Б

тТОБС1 [15, 16]. В этих условиях любые изменения, ингибирующие GAP-активность туберина или независимо от туберина стимулирующие переход GТP-азы Б^еЬ в активное состояние, будут активировать киназный комплекс тТОБС1, что мы и наблюдали. Мы также использовали кратковременную стимуляцию ростовыми факторами клеток, выдержанных в среде без ростовых факторов, для дифференциации изменений активности киназного комплекса тТОБС1, протекающих с разной скоростью. Мы обнаружили, что при росте клеток в полной среде, содержащей ростовые факторы, снижение экспрессии рабина-8 стимулировало активность тТОБС1, но сверхэкспрессии рабина-8 недостаточно для ингибирования этого комплекса. В среде без ростовых факторов снижения экспрессии рабина-8 недостаточно для реактивации комплекса тТОБС1, но сверхэкспрессия рабина-8 усиливает ингибирование киназного комплекса тТОБС1. Сверхэкспрессия рабина-8 замедляла реактивацию киназного комплекса тТОБС1, вызванную кратковременной стимуляцией средой с ростовыми факторами, при том, что снижение экспрессии рабина-8 стимулировало реактивацию. Эти результаты позволяют предположить, что рабин-8 подавляет активацию киназного комплекса тТОБС1 ростовыми факторами.

Мы впервые показали, что рабин-8 связывается с основным регулятором киназного комплекса тТОБС1 - GТP-азой Б^еЬ, что важно для понимания механизма регуляции тТОБС1 белком рабин-8. Однако нельзя исключить, что рабин-8 может взаимодействовать и с другими компонентами комплекса тТОБС1, так как при иммунопреципитации мы смогли обнаружить в комплексе с рабином-8 и Б^еЬ каталитическую субъединицу тТОБ. Не исключена возможность и того, что рабин-8 может опосредованно взаимодействовать с Б^еЬ - через неизвестный белок или в комплексе с туберином или гамартином. Однако, учитывая, что оба белка - и БаЬ8, и Б^еЬ, относятся к семейству GТP-аз и участвуют в регуляции образования первичной реснички [9], мы предполагаем, что рабин-8 влияет на активность киназного комплекса тТОБС1 через GТP-азу Б^еЬ. В пользу этого предположения свидетельствуют также опыты по коиммунопреципитации, когда, используя антитела против эпитопа Мус в белке Мус-Б^еЬ, мы не об-

наружили ослабления взаимодействия между белками рабин-8 и Б^еЬ в среде без ростовых факторов. При этом взаимодействие между ^еЬ и тТОБ было нарушено, что согласуется с ранее опубликованными данными [1]. Мы не обнаружили взаимодействия между белками рабин-8 и Б^еЬ в опытах по реци-прокной коиммунопреципитации с белками против рабина-8, что может объясняться разной аффинностью антител к данным белкам.

Возможность взаимодействия белков рабин-8 и Б^еЬ позволяет предположить новый Б^еЬ-зависимый механизм регуляции образования первичной реснички, не зависящий от активности киназного комплекса тТОБС1 [8]. Согласно этому предположению, при взаимодействии Б^еЬ и рабина-8 происходит перераспределение функции ^еЬ от регуляции комплекса тТОБС1 к регуляции образования первичной реснички. В последнее время была обнаружена связь между нарушениями функции цилио-генеза и различными заболеваниями, выделенными в отдельную группу цилиопатий. К заболеваниям этой группы относятся, в частности, поликистозная болезнь почек, синдром Барде-Бидля и другие [17]. Недавно выявили связь между нарушениями цилио-генеза и ожирением [18]. Помимо этого, первичная ресничка регулирует активность сигнальных путей Hedgenhog и Wnt, нарушение которых связано с развитием опухолей в различных органах [19]. Стоит также отметить, что активация киназного комплекса тТОБС1 наблюдается во многих типах опухолей [20] и необходима для их прогрессии. Следовательно, понимание механизмов регуляции и взаимосвязи комплекса тТОБС1 и процессов образования первичной реснички должно привести к появлению новых подходов к лечению цилиопатий, ожирения и онкологических заболеваний.

Работа выполнена в рамках межинститутского сотрудничества между Российским государственным медицинским университетом им. Н.И. Пирогова (кафедра молекулярной биологии и медицинской биотехнологии) и Фокс-Чейзовским онкологическим центром (США, Филадельфия). Авторы благодарят О.Г. Кулакову и Д.И. Хабибуллина за полезные обсуждения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sengupta S., Peterson T.R., Sabatini D.M. // Mol. Се11. 2010.

V. 40. P 310-322.

2. Zoncu R., Efeyan A., Sabatini D.M. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2011. V. 12. P 21-35.

3. Chan E.Y. // Sci. Signaling. 2009. V. 2. P. pe51.

4. Mizushima N. // Curr. Opin. Cell Biol. 2010. V. 22. P. 132-139.

5. Wullschleger S., Loewith R., Hall M.N. // Cell. 2006. V. 124.

P. 471-484.

6. Ma X.M., Blenis J. // Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2009. V. 10.

P 307-318.

7. Astrinidis A., Henske E.P. // Oncogene. 2005. V. 24. P. 7475-7481.

8. Hartman T.R., Liu D., Zilfou J.T., Robb V., Morrison T., Watnick T., Henske E.P. // Hum. Mol. Genet. 2009. V. 18.

P. 151-163.

9. Nachury M.V., Loktev A.V., Zhang Q., Westlake C.J., Peranen J., Merdes A., Slusarski D.C., Scheller R.H., Bazan J.F., Sheffield V.C., et al. // Cell. 2007. V. 129. P. 1201-1213.

10. Hattula K., Furuhjelm J., Arffman A., Peranen J. // Mol. Biol. Cell. 2002. V. 13. P. 3268-3280.

11. Sancak Y., Bar-Peled L., Zoncu R., Markhard A.L., Nada S., Sabatini D.M. // Cell. 2010. V. 141. P. 290-303.

12. Ruvinsky I., Sharon N., Lerer T., Cohen H., Stolovich-Rain M., Nir T., Dor Y., Zisman P., Meyuhas O. // Genes Dev. 2005. V. 19. P. 2199-2211.

13. Peterson T.R., Laplante M., Thoreen C.C., Sancak Y., Kang

S.A., Kuehl W.M., Gray N.S., Sabatini D.M. // Cell. 2009. V. 137.

P. 873-886.

14. Smith E.M., Finn S.G., Tee A.R., Browne G.J., Proud C.G. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 18717-18727.

15. Ballif B.A., Roux P.P., Gerber S.A., MacKeigan J.P., Blenis J., Gygi S.P. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. V. 102. P. 667-672.

16. Manning B.D., Tee A.R., Logsdon M.N., Blenis J., Cantley L.C. // Mol. Cell. 2002. V. 10. P. 151-162.

17. Hildebrandt F., Benzing T., Katsanis N. // N. Engl. J. Med. 2011. V. 364. P. 1533-1543.

18. Mok C.A., Heon E., Zhen M. // Clin. Genet. 2010. V. 77.

P. 18-27.

19. Duldulao N.A., Li J., Sun Z. // Protein Cell. 2010. V. 1.

P. 726-736.

20. Courtney K.D., Corcoran R.B., Engelman J.A. // J. Clin. Oncol. 2010. V. 28. P. 1075-1083.