CC BY
119
Клиническая медицина УДК 612.111.6:616.233-002
БЕЛКОВЫЙ СПЕКТР КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ БРОНХИТЕ
НЕПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ГЕНЕЗА
© Храмцов А.В., Иванов В.П., Бачинский О.Н., Трубникова Е.В., Стабровская Н.В.
Кафедра биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета, Курск;
НИЛ «Генетика» Курского государственного университета, Курск
E-mail: [email protected]
В исследовании проведено качественное и количественное определение состава клеточных мембран эритроцитов больных непрофессиональным бронхитом и контрольной группы. С помощью соответствующих методик (выделение мембранных белков, одномерный электрофорез) был проанализирован белковый спектр мембран эритроцитов. В исследовании принимали участие 95 больных непрофессиональным бронхитом и 45 здоровых лиц, выступающие в качестве контрольной группы. В результате исследования выявлено содержание основных групп белков клеточных мембран у больных, страдающих непрофессиональным бронхитом, в сравнении с контрольной группой. Показано, что у больных непрофессиональным бронхитом имеет место недостаток и избыток некоторых цитоскелетных и транспортных белков. Подробно изучена корреляционная структура взаимосвязей между количественным содержанием белков мембран эритроцитов, а также проведен регрессионный анализ.
Ключевые слова: непрофессиональный бронхит, мембранные белки, корреляции.
PROTEIN SPECTRUM OF CELL MEMBRANE OF ERYTHROCYTES IN BRONCHITIS
WITH UNPROFESSIONAL GENESIS Khramtsov A. V., Ivanov V.P., Bachinsky O.N., Trubnikova E. V., Stabrovskaya N. V.
Biology, Virology, Medical Genetics & Ecology Department of the Kursk State Medical University, Kursk;
SRL «Genetics» of the Kursk State University, Kursk The study carried out qualitative and quantitative composition of cell membranes of RBCs patients lay bronchitis and the control group. Using appropriate techniques (membrane proteins, dimensional electrophoresis) protein spectrum of erythrocyte membranes was analyzed. The study included 95 patients lay bronchitis and 45 healthy persons acting as control group. The study identified the major groups of cell membrane proteins in patients suffering from unprofessional bronchitis, compared with a control group. It is shown that patients with unprofessional bronchitis was a lack and abundance of some cytoskeletal and transport proteins. Examined the correlation structure of relationship between quantitative protein erythrocyte membranes, as well as conducted regression analysis.
Keywords: primitive bronchitis, membrane proteins, correlation.
Непрофессиональный бронхит является разновидностью целой группы заболеваний - хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). Распространенность, заболеваемость и смертность от ХОБЛ во всех странах недооцениваются. Хотя распространенность является одним из основных показателей эпидемиологии, проблемы ХОБЛ в этой области решены далеко не полностью. В нашей стране, по усредненным данным Минздравсоцразвития РФ, распространенность ХОБЛ в 2002 г. составила 1 610,8 на 100 000 населения (1,6%)[10]. Другим важным эпидемиологическим показателем, который неуклонно продолжает расти, является смертность. По неутешительному прогнозу экспертов Всемирной организации здравоохранения, к 2020 г. ХОБЛ войдет в первую тройку заболеваний, лидирующих по показателям летальности, обусловливая около
4,7 млн смертей в год [10].
Одним из важных элементов патогенеза любого мультифакториального заболевания, в том числе и непрофессионального бронхита[1], является качественный и количественный состав клеточных мембран, через которые непрерывно осуществляется поток различных агентов как необходимых для клетки, так и вредных для нее. Как известно, основными компонентами клеточных мембран любой эукариотической клетки являются белки и липиды. Количественное соотношение между классами белков и липидов изменяется при целом ряде заболеваний человека, в связи с этим состояние клеточных мембран является актуальной проблемой при изучении хронического непрофессионального бронхита. Следует заметить, что заболевания бронхолегочной системы человека возникают не только из-за длительного воздействия вредных факторов, но и благодаря генетической предрасположенности к этой патологии [3, 5].
Углубление знаний химического состава и свойств мембран представляется важным для понимания их ключевой роли в структурной организации и функционирования всех клеток организма, а также является необходимым условием при определении принципов коррекции мембранной патологии.
Целью исследования являлось оценка количественной и качественной представительности, выявление корреляционной структуры взаимосвязей белкового спектра мембран эритроцитов больных непрофессиональным бронхитом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для исследования послужили эритроциты 95 лиц, страдающих непрофессиональным бронхитом, в возрасте от 40 до 65 лет и контрольная группа в числе 45 практически здоровых лиц. Среди обследованных женщины составили 38,68%, мужчины - 61,32%.
У обследуемых проводился забор крови из локтевой вены в сухую стерильную посуду в количестве 5 мл с целью получения образцов эрит-роцитарных мембран.
Эритроциты получали из 10 мл гепаринизи-рованной крови по методу Е. Бейтлера [6] с незначительной модификацией. Сначала образец крови двукратно отстаивали в растворе PBS с добавлением 3% раствора декстрана Т-500 в течение 30 минут. Затем эритроцитарную массу пропускали через колонку с HBS-целлюлозой, после чего эритроциты центрифугировали при 3000 оборотах.
Для получения чистых фракций мембран эритроциты разрушали осмотическим «шоком» по методу G.T. Dodge [7] с незначительными изменениями. Гемолиз эритроцитов и отмывку «теней» проводили двукратно в 10 мМ и однократно в 5 мМ Na-фосфатном буфере с добавлением PMSF-ингибитором протеиназ.
Белковые компоненты мембран эритроцитов определяли модифицированным одномерным электрофорезом [4] в присутствии додецилсуль-фат натрия по методу Laemmli U.K. [9]. Электрофорез проводили на пластинах ПААГ, приготовленных с линейным градиентом концентрации акриламида.
Растворы подавались через перистальтический насос в формирователь пластин. Сверху через 40 минут наслаивали концентрирующий гель. Помещали пластину для формирования лунок и после полимеризации наслаивали 0.3 мл дистиллированной воды.
Для приготовления анализируемой пробы для электрофореза брали 50 мкл мембран эритроци-
тов и 20 мкл уравновешивающего буфера составом (на 10 мл): 3 г мочевины, 0.2 мл додецил-сульфат натрия, 1,25 мл 0.5 М раствор ТРИС-НС1 (pH=6.8±0.5), 0.5 мл меркаптоэтанола, 5 мкл красителя бромфенолового синего.
Подготовленные таким образом анализируемые образцы стояли в течение одного часа при комнатной температуре, после чего их вносили в количестве 10 мкл в сформированные в концентрирующем геле лунки.
Электрофорез проводили при силе тока 35 мА, пока напряжение не возрастало до 300 В, затем стабилизировали по данному напряжению и проводили электрофорез в данном режиме, пока лидирующий краситель не доходил 1 см до края пластины.
Электрофореграммы окрашивали красителем Кумасси G-255 по модифицированной методике G. Fairbanks [8]. В растворе, содержащем 10% уксусной кислоты, 25% изопропанола, 0.05% ку-масси G-255. Несвязавшуюся краску отмывали в 10% растворе уксусной кислоты до полного исчезновения фонового окрашивания.
Идентификацию и обсчет белковых фракций согласно классификации Стека-Фербенкса [8] проводили на ПВМ IBM PA/AT с использованием программы "OneDscan". Количество белка во фракциях рассчитывалось по известной массе маркерного белка человеческого сывороточного альбумина, исключая массу гемоглобина, и выражалось в микрограммах на 1 миллиграмм общего белка мембраны.
Статистическая обработка проводилась с помощью электронных таблиц Excel и пакета прикладных программ "Statistica 7.0". Для проверки достоверности различий между совокупностями использовали параметрические критерии Стью-дента и Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Проведено изучение количественного содержания основных белковых фракций мембран эритроцитов больных непрофессиональным
бронхитом и контрольной группы.
Результаты сравнительного анализа количественного содержания основных белков мембран эритроцитов больных непрофессиональным
бронхитом и контрольных групп представлены в табл. 1.
Как видно из табл. 1, были обнаружены достоверные различия между группами в количественном содержании лишь по некоторым белковым фракциям. В структуре мембран эритроцитов у больных непрофессиональным бронхитом по сравнению с контролем выявлено высокое содер-
жание белка полосы 7.2 (тропомиозин) и низкое отметить, что наблюдается стремление к стати-
содержание анионтранспортного белка. Следует
Таблица 1
Сравнительный анализ количественных характеристик белков мембран эритроцитов больных непрофессиональным бронхитом и контрольной группы
№ п/п Мембранные белки Непрофбронхит N=95 Контроль N=45 Ї
X±Sx X±Sx
1 Спектрин (а) 90.15±4.74 94.56±6.52 -0.51
2 Спектрин (Р) 99.47±4.81 102.04±7.49 -0.29
3 Белок 2.1(анкирин) 42.71±3.17 34.10±3.66 1.55
4 Белок 2.2 15.44± 1.35 15.25±2.28 0.07
5 Белок 2.3 15.86± 1.72 12.33±2.83 1.08
6 Белок 3 (анионтранспортный белок) 230.28±7.22 257.44±10.56 -2.04*
7 Белок 4.1 54.19±2.00 50.25±3.02 1.06
8 Белок 4.2 (паллидин) 45.99±1.62 43.13±2.30 0.89
9 Белок 4.5 43.49±2.62 38.51±3.64 1.04
10 Белок 4.9 57.09±3.62 63.55±5.40 -0.96
11 Белок 5 (актин) 49.68±2.06 54.88±3.74 -1.29
12 Белок 6 79.28±2.68 77.37±4.31 0.38
13 Белок 7.1 52.35±2.94 47.11±4.53 0.96
14 Белок 7.2 20.78±1.45 14.96±1.92 2.22*
15 Белок 8 (глютатион-8-трансфераза) 87.16±5.36 82.11±8.34 0.50
Примечание: * - различия статистически достоверны при р<0,05.
стической достоверности количественного содержание белка 2.1 (анкирин), которое характеризуется избытком, в сравнении с контрольной группой. Полученные данные показывают, что в структуре эритроцитарных мембран больных непрофессиональным бронхитом имеет место выраженный количественный дисбаланс как цитос-келетных, так и транспортных белков[2]. Результаты дают основание полагать, что у больных непрофессиональным бронхитом в сравнении с контролем существуют определенные особенности организации белков в структуре эритроцитар-ных мембран.
С целью установления корреляционной структуры взаимосвязей, то есть характера взаимного варьирования количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов, проведен корреляционный анализ белкового спектра мембран эритроцитов в выборке больных непрофессиональным бронхитом и контрольной группы. Корреляционные матрицы количественных характеристик мембранных белков представлены в табл. 3 и 4 соответственно.
Как видно из табл. 3, полученные коэффициенты корреляции имеют как положительную, так и отрицательную направленность. При этом довольно высокие положительные взаимосвязи наблюдались между количественным содержанием а-спектрина и Р-спектрином (г=0.88), а-спектрина и анкирина 2.1 (г=0.72), Р-спектрина и анкирина 2.1 (г=0.65), анкирина 2.2 и анкирина
2.3 (г=0.63). Остальные взаимосвязи носили среднюю (г=0.38 - 0.61) и слабую выраженность (і=0.31 - 0.38).
Среди обратной направленности (отрицательной) средней степени выраженности наблюдались взаимосвязи между а-спектрином и белком 4.5 (г=-0.45), а-спектрином и белком 6 (г=-0.59), а-спектрином и белком 8 (г=-0.47), Р-спектрином и белком 4.5 (г=-0.49), Р-спектрином и белком 4.9 (г=-0.45), Р-спектрином и белком 6 (г=-0.53), ), Р-спектрином и белком 7.1 (г=-0.50), ),
Р-спектрином и белком 8 (г=-0.55).
Структура взаимосвязей между количественными характеристиками мембранных белков у больных непрофессиональным бронхитом существенно отличалась от контрольной группы. При этом сила взаимосвязей между количественным содержанием белков была более выражена у больных непрофессиональным бронхитом, чем в контроле.
С использованием линейной дискриминантной функции проведен сравнительный анализ матриц фенотипических корреляций количественного содержания основных мембранных белков эритроцитов больных непрофессиональным бронхитом и контрольной группы. Величина полученного Б-отношения составила 3,44, что превышает табличное значение (2,80) и свидетельствует о выраженной количественной дезинтеграции белков с изменением характера их взаимосвязей варьирования в составе эритроцитарных
мембран у больных непрофессиональным бронхитом по сравнению с контролем.
Таблица 3
Корреляционная матрица количественного содержания основных белков мембран эритроцитов больных непрофессиональным бронхитом, N=95
81 82 2.1 2.2 2.3 3 4.1 4.2 4.5 4.9 5 6 7.1 7.2 8
81 1,00
82 0,88* 1,00
2.1 0,72* 0,65* 1,00
2.2 0,46* 0,38* 0,60 1,00
2.3 -0,00 -0,06 0,15 0,63* 1,00
3 -0,20 -0,06 -0,27* -0,35* -0,41* 1,00
4.1 0,03 0,00 0,01 -0,16 -0,25* 0,33* 1,00
4.2 -0,18 -0,23 -0,11 -0,17 -0,12 0,32* 0,55* 1,00
4.5 -0,45* -0,49* -0,44* -0,20 0,13 -0,35* -0,13 -0,01 1,00
4.9 -0,39* -0,45* -0,37* -0,12 0,21 -0,20 -0,07 0,08 0,61 1,00
5 -0,37* -0,33* -0,28* -0,25* 0,01 0,22 -0,23 -0,04 -0,19 0,03 1,00
6 -0,59* -0,53* -0,47* -0,27* 0,14 -0,01 -0,32* -0,06 0,18 0,21 0,35* 1,00
7.1 -0,42* -0,50* -0,48* -0,25* 0,04 -0,24* -0,24* -0,19 0,31 0,18 0,07 0,36 1,00
7.2 -0,38* -0,37* -0,34* -0,23* -0,07 -0,31 -0,31* -0,26* 0,30* 0,01 -0,11 0,37 0,61* 1,00
8 -0,47* -0,55* -0,41* -0,25* 0,06 -0,37* -0,18 -0,07 0,38* 0,13 0,15 0,32 0,47* 0,48* 1,00
Примечание: * - р<0,05; 81 - а-спектрин; 82 - Р-спектрин.
Таблица 4
Корреляционная матрица количественного содержания основных белков мембран эритроцитов контрольной группы N=45
81 82 2.1 2.2 2.3 3 4.1 4.2 4.5 4.9 5 6 7.1 7.2 8
81 1,00
82 0,72* 1,00
2.1 0,53* 0,50* 1,00
2.2 0,28* 0,26 0,73 1,00
2.3 0,03 0,01 0,41* 0,75* 1,00
3 -0,22 0,02 -0,37* -0,39* -0,34* 1,00
4.1 0,04 -0,26* 0,14 0,30* 0,14 -0,25* 1,00
4.2 0,18 0,09 0,29* 0,16 -0,09 -0,01 0,48* 1,00
4.5 -0,26* -0,34* -0,03 0,09 0,02 -0,37* 0,18 0,10 1,00
4.9 -0,34* -0,56* -0,23* -0,07 0,04 -0,33* 0,16 -0,03 0,74* 1,00
5 -0,43* -0,25* -0,50* -0,39* -0,26* 0,49* -0,22 -0,19 -0,30 -0,06 1,00
6 -0,55* -0,27* -0,51* -0,38* -0,29* 0,41* -0,22 -0,22 -0,06 0,06 0,59* 1,00
7.1 -0,28* -0,55* -0,48* -0,35* -0,02 -0,28* -0,00 -0,21 0,12 0,35* -0,16 -0,01 1,00
7.2 -0,34* -0,40* -0,43* -0,37* 0,02 -0,19 -0,04 -0,19 -0,11 0,12 -0,01 -0,05 0,81* 1,00
8 -0,52* -0,53* -0,47* -0,32* -0,07 -0,32* 0,05 -0,24* 0,24* 0,25* 0,03 0,07 0,62* 0,61* 1,00
Примечание: * - р<0,05; 81 - а-спектрин; 82 - Р-спектрин.
Таблица 5
Коэффициенты регрессионного анализа прогностических ценных количественных характеристик мембранных белков эритроцитов больных непрофессиональным бронхитом и контрольной группы (Б(6,125)=3,44, р<0,05)
Признак Ценность признака Коэффициент ЛДФ (b) b0
белок полосы 2.1 8,66 -0,005 2,14
белок полосы 7.2 6,70 -0,008
белок полосы 4.1 4,39 -0,004
белок полосы 4.5 3,94 -0,004
Примечание: ошибка классификации: 16%.
В процессе построения ЛДФ проводилась оценка прогностической ценности каждого из выделенных показателей для больных непрофессиональным бронхитом и контрольной группы. Рассчитанные коэффициенты ЛДФ представлены в табл. 5.
В табл. 5 обращает на себя внимание высокая прогностическая ценность отдельных показателей белкового спектра клеточных мембран эритроцитов, особенно белок полосы 2.1, тропомиозин (белок полосы 7.1). Многие из этих белков коррелируют с подверженностью к непрофессиональному бронхиту. Полученные коэффициенты регрессионного анализа могут позволить прогнозировать развитие непрофессионального бронхита с вероятностью в 84%, что может служить хорошим подспорьем для врача-клинициста.
Таким образом, у больных непрофессиональным бронхитом по сравнению с контролем выявлены существенные различия как по количественному содержанию основных мембранных белков эритроцитов, так и по характеру их взаимного варьирования в пределах изучаемых статистических совокупностей. Полученные данные дают основание полагать, что курение оказывает непосредственное влияние на организм человека, при чем способно вызывать изменения на молекулярном уровне и тем самым изменять функциональные свойства эритроцитарной мембраны.
ЛИТЕРАТУРА
1. Артамонова В.Г., Мухин Н.А. Профессиональные болезни. - М.: Медицина, 2006. - 480 с.
2. Иванов В.П., Полоников А.В., Солодилова М.А. Белки клеточных мембран и сосудистые дистонии у человека. - Курск: КГМУ, КМИ, 2004. - 279 с.
3. Кокосов А.Н. Бронхит. Механизмы, хронизации, лечение, профилактика. - Санкт-Петербург: ЭЛБИ-СПб, 2007. - 178 с.
4. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. - М.: Наука, 1981. - 288 с.
5. Чучалин А.Г. Глобальная стратегия диагностики, лечения и профилактики хронической обструктив-ной болезни легких. - М.: Издательским дом «Атмосфера», 2007. - 96 с.
6. Beutler E. Removal of leukocytes and platelets from whole blood // J. Lab. Clin. Med. - 1976. - Vol. 88. -P. 328-333.
7. Dodge G.T., Mitchell C., Hanahan D.J. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin free ghosts of human erythrocytes // Arch. Biochem. Biophys. - 1963. - Vol. 100. - P. 119-130.
8. Fairbanks G., Steck T.L., Wallach D.F.H. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane // Biochemistry. - 1971. -Vol. 10. - P. 2607-2617.
9. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterophage T4 // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680.
10. Mannino D.M., Buist A.S. Global burden of COPD: risk factors, prevalence, and future Trends // Lancet. -2007. - Vol. 370. - P. 765-773.
