CC BY
38
© И.А. Талашова, 2007
Белковый состав сыворотки крови экспериментальных животных в условиях имплантации кальцийфосфатных биокомпозитов
И.А. Талашова
Blood serum protein composition in experimental animals under the implantation of the biocomposites of calcium phosphate
I.A. Talashova
Федеральное государственное учреждение «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. академика Г. А. Илизарова Росмедтехнологий», г. Курган (генеральный директор — заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор В.И. Шевцов)
Изучен белковый состав сыворотки крови экспериментальных животных при имплантации биокомпозиционных кальцийфосфатных материалов различного состава. Установлено, что при использовании имплантационного материала, в состав которого входит органический костный матрикс, повышается содержание белков острой фазы, однако через 6 недель эксперимента все показатели белкового состава крови во всех группах эксперимента возвращались к нормальным значениям.
Ключевые слова: имплантация, кальцийфосфатные материалы, биокомпозиты, белки сыворотки крови.
The blood serum protein composition of experimental animals for implantation of the biocompositional calcium-phosphate materials of different compound has been studied. It has been established that in case of using the implantation material, which includes organic bone matrix as a compound, the content of acute phase proteins increases, however, after 6 weeks of the experiment all the measures of blood protein composition return to normal values in all the experimental groups. Keywords: implantation, calcium-phosphate materials, biocomposites, blood serum proteins.
ВВЕДЕНИЕ
В новом тысячелетии увеличение продолжительности жизни человека должно стать характерной чертой современного общества. В связи с этим возникает необходимость в решении ряда медико-материаловедческих проблем, в частности, создания материалов для искусственных органов и тканей. Усилия ученых направлены на решение актуального вопроса - выбора такого пластического материала, который бы по прочностным характеристикам и своему составу максимально приближался к костной ткани, которая является, по сути, композиционным материалом на основе ультрадисперсного кар-бонатсодержащего гидроксиапатита (ГА) и белка коллагена с многоуровневой структурной организацией компонентов [1, 12, 15, 16, 17, 18].
Такими свойствами обладают материалы на основе кальцийфосфатных соединений, которые, в свою очередь, являются основным компонентом неорганического костного матрикса и относятся к группе естественных метаболитов костной ткани [2, 11]. В современной медицине применяются различные кальцийфосфатные
материалы, однако остаются неразрешенными вопросы, касающиеся оптимального состава и свойств имплантационных материалов.
В лаборатории биохимии ФГУН «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова» разработаны кальцийфосфатные биокомпозиты [13, 14], в состав которых входят остеоиндуцирующие составляющие: органический матрикс (ОМ) костной ткани крупного рогатого скота (КРС), около 90 % которого составляет коллаген [12], а также полипептидные факторы роста, выделенные из сыворотки крови животных, находящихся на этапе дистракции по методу Г. А. Илизарова, - сывороточные белки (СБ) [5, 6, 7, 10].
Известно, что в случае имплантации материалов, имеющих в своем составе чужеродные вещества белковой природы, велика вероятность отторжения имплантируемых материалов и возникновения аллергических реакций [1, 3, 12]. Поэтому нам представилось актуальным исследование влияния имплантации разработанных материалов на организм экспериментальных животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В основу работы положен анализ результатов исследований, полученных в ходе имплантации опытным животным материалов на основе кальцийфосфатных соединений, выделенных из костной ткани КРС. Объектами исследования являлись 35 беспородных собак в возрасте от одного года до трех лет с массой тела 9,9±1,0 кг. Уход и содержание животных осуществлялись в соответствии с требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения РФ «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06. 01.73 г. и на основании приказа МЗ СССР № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организованных форм работы с использованием экспериментальных животных» от 12.08.77 г.
В ходе исследования у экспериментальных животных в стерильных условиях под внутривенным барбитуровым наркозом создавали дырчатые дефекты в виде усеченных конусов диаметром 5 мм и высотой 7 мм в проксимальном метафизе большеберцовой кости и плеча и заполняли их разработанными композиционными материалами или место созданного дефекта ушивалось без его заполнения (оперативные вмешательства и послеоперационное ведение животных выполнены д.м.н. С. А. Ерофеевым и к. в. н. Н. А. Кононович).
Материалом биохимических исследований являлась кровь экспериментальных животных, взятая венепункцией. Забор крови осуществляли до операции и каждую неделю после операции в
течение шести недель.
Экспериментальный материал был распределен следующим образом:
1) в первой группе у опытных животных костные дефекты заполняли биокомпозитом, включающим кальцийфосфатное соединение и сывороточные белки - (КФС+СБ);
2) во второй группе - биокомпозитом, в состав которого входили кальцийфосфатное соединение, сывороточные белки и органический матрикс - (КФС+СБ +ОМ);
3) в третьей группе в костные дефекты им-плантационные материалы не вносили - группа без имплантации;
Нормальными величинами служили результаты дооперационных исследований экспериментальных животных.
Содержание общего белка в сыворотке крови определяли микробиуретовым методом [8]. Определение белковых фракций осуществляли наборами реагентов "Beckman-Coulter" (США) согласно инструкциям, приложенным к данным наборам.
Полученные результаты исследований были обработаны с помощью методов непараметрической статистики с использованием и-критерия Манна-Уитни для независимых выборок, поскольку наблюдаемые признаки не подчинялись нормальному распределению [4, 9], и представлены в виде медиан значений показателей и интерквартильных размахов. Различия считали значимыми при рU <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что белки играют решающую роль в клеточной архитектуре, в катализе, в регуляции метаболизма, в сократительных процессах и в реакциях, обеспечивающих высшим организмам защиту от болезнетворных агентов. Белки имеют непосредственное отношение к подавляющему большинству событий на физиологическом уровне [3].
В связи с этим в ходе эксперимента изучался белковый состав сыворотки крови экспериментальных животных как один из показателей течения адаптационных процессов при имплантации различных материалов.
По результатам эксперимента установлено, что у животных первой группы (КФС+СБ) содержание в сыворотке крови общего белка, альбуминов, глобулинов и значение альбу-мин/глобулинового соотношения (А/Г) статистически значимо не отличались от нормальных значений (табл. 1).
Во второй группе (КФС+СБ+ОМ) содержание общего белка в ходе всего эксперимента статистически значимо не отличалось от нормальных значений, но в первые три недели опыта было отмечено значимое снижение содержания альбуминов и повышение содержания а2-глобулинов, за счет чего было снижено и аль-бумин/глобулиновое соотношение (табл. 1).
В третьей группе, где созданные костные дефекты не заполнялись имплантационными материалами, через одну неделю после операции наблюдали статистически значимое повышение содержания а2-глобулинов и, соответственно - значимое снижение альбумин-глобулинового соотношения. На шестой неделе опыта было отмечено значимое повышение содержания в сыворотке а^глобулинов, но в данном случае это не привело к статистически значимому снижению А/Г (табл. 1) .
Таблица 1
Белковый состав сыворотки крови экспериментальных животных (медианы значений показателей и интерквартиль-
ные размахи)
Срок после операции, недель Число наблюдений, п Общий белок, г/л Альбумины, г/л Глобулины, г/л А/Г Фракции глобулинов, г/л
«1 «2 в У
Норма 35 69,20 (64,80-75,50) 38,45 (35,26-41,77) 30,97 (27,34-35,16) 1,28 (0,89-1,43) 3,04 (2,32-5,80) 8,45 (7,34-9,49) 12,26 (10,82-14,51) 6,44 (4,86-8,37)
Группа КФС + СБ
1 4 63,15 (61,60-64,70) 33,13 (32,97-33,30) 30,04 (28,34-31,74) 1,11 (1,04-1,18) 2,48 (2,31-2,66) 10,87 (10,41-11,32) 10,32 (8,26-12,39) 6,37 (5,37-7,36)
2 4 69,40 (68,80-70,00) 37,20 (36,74-37,66) 32,23 (32,12-32,34) 1,16 (1,15-1,16) 3,23 (3,15-3,30) 11,10 (10,99-11,21) 10,96 (10,01-11,90) 6,95 (5,71-8,19)
3 4 64,95 (62,40-67,50) 34,54 (31,79-37,29) 30,46 (25,06-35,86) 1,19 (0,89-1,49) 3,03 (2,69-3,38) 10,66 (7,96-13,37) 10,83 (8,02-13,64) 5,93 (5,47-6,40)
4 4 62,75 (57,85-67,66) 35,88 (35,65-36,11) 33,85 (30,23-37,47) 1,07 (0,95-1,19) 3,04 (2,80-3,27) 12,53 (10,15-14,90) 11,55 (9,03-14,06) 6,74 (5,24-8,24)
5 4 63,19 (61,53-64,85) 35,85 (33,47-38,24) 30,09 (26,25-33,93) 1,22 (0,99-1,46) 2,87 (2,38-3,35) 10,61 (9,06-12,16) 10,21 (7,48-12,93) 6,41 (5,49-7,33)
6 4 62,39 (61,48-63,30) 36,47 (34,93-38,01) 31,80 (28,57-35,02) 1,15 (1,09-1,22) 2,65 (2,44-2,86) 11,05 (8,64-13,45) 11,53 (9,59-13,46) 6,57 (5,66-7,49)
Группа КФС + СБ + ОМ
1 4 69,95 (69,70-70,00) 30,24** (26,63-30,38) 40,99** (39,76-43,15) 0,76** (0,62-0,77) 6,92 (2,81-7,14) 15,34*** (14,77-16,94) 12,64 (11,83-13,88) 6,02 (6,02-6,19)
2 4 74,80 (72,40-75,50) 29,51* (26,11-35,83) 42,86** (40,52-42,94) 0,69** (0,60-0,89) 6,22 (2,52-7,97) 14,31** (12,42-14,48) 14,37 (14,04-14,46) 8,18 (8,13-9,23)
3 4 75,00 (70,00-77,20) 35,65 (32,06-36,05) 38,01* (35,11-41,14) 0,85* (0,79-0,88) 3,10 (2,57-3,92) 11,93** (11,69-13,66) 13,36 (13,30-13,43) 7,58 (7,57-9,03)
4 4 72,00 (61,20-76,40) 30,48* (29,13-34,63) 37,29 (32,07-45,84) 0,91 (0,66-0,93) 3,51 (2,75-4,32) 9,49 (7,92-10,7) 14,20 (9,07-19,02) 12,61 (5,63-15,98)
5 4 72,00 (62,40-72,00) 30,10 (27,58-41,69) 34,82 (30,38-41,87) 0,79 (0,72-1,38) 3,46 (3,02-3,78) 11,79 (8,93-15,12) 14,08 (11,66-14,47) 6,77 (5,16-8,82)
6 4 74,70 (74,50-80,00) 35,73 (34,64-42,21) 38,77 (32,50-45,36) 0,92 (0,76-1,30) 3,36 (3,28-3,59) 14,53 (8,07-16,48) 14,42 (13,89-15,92) 6,95 (6,56-9,60)
Группа без имплантации
1 8 72,50 (71,30-75,00) 34,64 (31,95-35,59) 39,90* (37,39-41,46) 0,86* (0,78-0,95) 4,19 (2,73-5,66) 12,13* (10,07-13,33) 15,51 (14,25-16,11) 8,17 (5,80-10,91)
2 8 78,00 (64,90-86,20) 36,89 (29,90-42,02) 39,18 (34,89-44,33) 0,86 (0,83-1,00) 4,64 (3,73-5,69) 11,49 (8,92-12,58) 16,02 (14,49-16,64) 7,87 (5,77-11,43)
3 8 72,70 (69,45-75,45) 37,78 (34,26-38,70) 36,73 (33,12-38,80) 1,06 (0,89-1,17) 3,55 (2,61-5,58) 8,67 (7,70-10,76) 14,11 (13,43-16,39) 7,51 (5,25-10,22)
4 8 68,20 (64,40-72,00) 38,00 (37,48-38,52) 30,16 (26,92-33,40) 1,27 (1,15-1,39) 2,67 (2,30-3,03) 8,61 (7,79-9,43) 13,70 (11,91-15,48) 5,19 (4,19-6,19)
5 8 63,50 (56,00-71,00) 35,10 (31,36-38,84) 28,32 (24,53-32,10) 1,24 (1,21-1,27) 2,07 (1,23-2,91) 7,60 (5,54-9,66) 12,77 (10,98-14,56) 5,88 (4,97-6,78)
6 8 71,50 (65,00-78,00) 39,70 (36,27-43,13) 31,78 (28,68-34,87) 1,25 (1,24-1,26) 1,58* (1,37-1,79) 6,84 (6,57-7,10) 14,86 (13,65-16,07) 8,50 (7,09-9,91)
Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с нормальными величинами: * - ри < 0,05; ** - ри < 0,01; *** - ри < 0,001.
На рисунке 1 представлена динамика альбу-мин-глобулинового соотношения сыворотки крови экспериментальных животных в ходе всего эксперимента. Очевидно, что наиболее близкими к нормальным значениям являются показатели белкового спектра сыворотки крови экспериментальных животных, которым имплантировали биокомпозиционный материал, имеющий в своем составе минеральную составляющую - КФС, и сывороточные белки, выделенные из плазмы крови животных с активным ос-теогенезом.
I-ИСФГ+ГК ^ИКФС+СБ+ОМ I-1 к.-» ммпп
1,60 -25%-ль норм.-Медиана норм. 75%-ль норм.
1 2 3 4 5 6
Срок эксперимента, нед. Рис. 1. Альбумин-глобулиновое соотношение сыворотки крови экспериментальных животных
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты проведенного исследования позволяют утверждать, что введение в состав разработанных композиционных имплантационных материалов органического матрикса, выделен-
ного из костной ткани КРС, повышает системную воспалительную реакцию, что отражается в повышенном содержании в сыворотке крови белков острой фазы. Однако во всех опытных
группах содержание и соотношение белковых фракций в сыворотке крови животных к концу
эксперимента возвращались к нормальным значениям.
ЛИТЕРАТУРА
1. Активизация репаративного остеогенеза с помощью биоактивных резорбируемых материалов - кальций-фосфатной биокерамики и комплексного препарата Коллапан / Г. Н. Берченко [и др.] // Ортопед., травматол. - 2000. - № 2. - С. 96.
2. Безруков, В. М. Гидроксиапатит как субстрат для костной пластики : теоретические и практические аспекты проблемы / В. М. Безруков, А. С. Григоръян // Стоматология. — 1996. — N° 3. — С. 7-12.
3. Бышевский, А. Ш. Биохимические сдвиги и их оценка в диагностике патологических состояний / А. Ш. Бышевский, С. Л Га-лян, О. А. Терсенов . - М. : «Медицинская книга», 2002. - 320 с.
4. Гайдышев, И. П. Решение научных и инженерных задач средствами Excel, VBA и С/С++ / И. П. Гайдышев. - СПб. : БХВ - Петербург, 2004. - 512 с.
5. Гребнева, О. Л. Влияние полипептидных факторов сыворотки крови на репаративный остеогенез : автореф. дис... канд. мед. наук / О. Л. Гребнева ; ТМИ. — Томск, 1998. - 21 с.
6. Ковинька, М. А. Регуляция регенерации кости в условиях остеосинтеза у больных ахондроплазией : автореф. дис... канд. биол. наук / М. А. Ковинька ; ТГУ. - Тюмень, 2002. - 24 с.
7. Коррекция осложнений и потенцирование костеобразования при травме композициями неколлагеновых белков / К. С. Десят-ниченко [и др.] // Паллиативная медицина и реабилитация. - 1998. - № 2-3. - С. 179-180.
8. Лабораторные методы исследования в клинике : справочник / В. В. Меньшиков [и др.]. - М. : Медицина, 1987. - 368 с.
9. Платонов, А. Е. Статистический анализ в медицине и биологии : задачи, терминология, логика, компьютерные методы / А. Е. Платонов. - М. : Изд-во РАМН, 2000. - 52 с.
10. Соловьев, Г. С. Факторы стимуляции регенераторных процессов хрящевой и костной ткани / Г. С. Соловьев // Эпителий и соединительная ткань в нормальных, экспериментальных, патологических условиях : тез. конф. морфологов Сибири. - Тюмень, 1983. - С. 228-230.
11. Щепеткин, И. А. Кальцийфосфатные материалы в биологических средах / И. А. Щепеткин // Успехи совр. биологии. - 1995. -Т. 115, Вып. 1. - С. 58-73.
12. Щепеткин, И. А. Полипептидные факторы остеогенеза / И. А. Щепеткин // Успехи совр. биол. - 1994. - Т. 114, Вып. 4. - С. 454466.
13. Заявка № 2003134131 036658 РФ, МПК7 А 61 К 9/36, 31/70, 31/715 Способ выделения коллагена из минерализированной соединительной ткани и косметическое средство на его основе / Лунева С. Н. [и др.] (РФ). - Заявл. 24.11.2003.
14. Заявка № 2005200254 000267 РФ, МПК7 А 61 К 6/033; 35/32; 37/00 Биоимплантат для возмещения дефектов минерализованных тканей и способ его получения / Шевцов В. И. [и др.] (РФ). - Заявл. 11.01.2005.
15. Functional loading bioceramic augmented alveolar ridge / E. В. Nery [et al.] // J. Prosthet. Dent. - 1990. - No 43. - P. 338.
16. Viable bone formation in porous hydroxyapatite : marrow cell-derived in vitro bone on the surface of ceramics / T. Yoshikawa [et al.] // J. Biomed. Mater. Ing. - 1997. - Vol. 7, No 1. - P. 49-58.
17. Vuola, J. Compressive strength of calcium carbonate and hydroxyapatite implants after bone-marrow-induced osteogenesis / J. Vuola, R. Taurio, H. Goransson // Biomaterials. - 1998. - Vol. 19, No 1-3. - P. 223-227.
18. Williams, C. Hydroxyapatite augmentation of the anterior portion of the maxilla wish a modified transpositional flap technique / C. Williams, J. Meyers // Oral Surg., Oral Med., Oral Pathol. - 1991. - Vol. 72, No 4. - P. 395-399.
Рукопись поступила 23.07.05.
