CC BY
26
Бактериологическая и молекулярно-генетическая верификация бактериемии у ВИЧ-инфицированных больных
Н.С. Соловьева, Т.Ф. Оттен, В.Ю. Журавлев, Н.Н. Гащенко, М.В. Шульгина
ФГБУ «Санкт-Петербургский НИИ фтизиопульмонологии» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия
Проведено сравнение эффективности микробиологических и молекулярно-генетических методов идентификации инфекционного агента в 130 образцах венозной крови при септических состояниях у больных ВИЧ-инфекцией. Инфекционный агент был выявлен в 45,4% образцов. Посев на жидкие среды позволил выделить культуру возбудителя в 37,7% образцов, ПЦР-РВ для выявления ДНК микобактерий туберкулезного комплекса - еще в 10 (7,7%) образцах.
M. tuberculosis был выявлен в 29,2% этиологически верифицированных случаев, M. avium и M. intracellular - в 9,2%. Комплекс молекуляр-но-генетических и современных микробиологических методов позволили повысить эффективность этиологической диагностики септических состояний и сократить время получения результатов исследования.
Ключевые слова: бактериемия, сепсис, ВИЧ-инфекция, туберкулез, M. tuberculosis.
Bacteriological and Molecular Diagnosis of Bacteremia in HIV-positive Patients
N.S. Solovieva, T.F. Otten, V.Yu. Zhuravlev, N.S. Gashchenko, M.V. Shulgina
Saint-Petersburg Scientific Research Institute of Phtiziopulmonology, Saint-Petersburg, Russia
The study aimed to compare efficacy of microbiologic and molecular genetic methods in identification of an infectious agent in blood samples from HIV-positive patients with septic symptoms. 130 venous blood samples were studied using microbiological and molecular methods. Infectious agent was identified in 45.4% cases, by culture — in 37.7, by real-time PCR for mycobacterium tuberculosis complex specific DNA — in 10 additional samples (7.7%).
M. tuberculosis was found in 29.2% of all verified cases, M. avium and M. intracellular — in 9.2%. The battery of molecular and modern microbiological tests led to increased efficacy of etiological diagnosis in patients with sepsis and decreased tests' turnaround time.
Key words: bacteremia, sepsis, HIV, tuberculosis, M. tuberculosis.
Контактный адрес: Наталья Сергеевна Соловьева Эл. почта: [email protected]
Введение
Генез и течение бактериемии и сепсиса у больных с ВИЧ-инфекцией в бессимптомной стадии заболевания с уровнем CD4-лимфоцитов более 0,5х109/л не отличается от подобного состояния у лиц без ВИЧ-инфекции. Риск развития септических состояний значительно увеличивается у больных ВИЧ-инфекцией с низким уровнем CD4-лимфоцитов (менее 0,2х109/л) [1]. Лихорадка - главный диагностический признак сепсиса и достаточно часто при ВИЧ-инфекции является манифестирующим симптомом прогрессирования основного заболевания или сопутствующих патологических процессов. При этом бактериальный сепсис у данной категории пациентов регистрируется с начала эпидемии ВИЧ-инфекции и является частой причиной летальных исходов [2,3]. При проведении дифференциальной диагностики у данной категории пациентов для формулировки клинического диагноза необходимо назначение целенаправленного бактериологического исследования крови.
Клиническое значение выявления бактериемии заключается в верификации диагноза и определении этиологии инфекционного процесса, доказательстве механизма развития сепсиса, обосновании выбора, смены или оценки эффективности антибактериальной терапии [4]. Необходимо отметить, что в основном у иммунокомпрометированных пациентов с выраженным системным воспалением бактериемия может быть вызвана как туберкулезными, так и нетуберкулезными микобактериями (до 28% случаев), что требует использования специальных методов исследования [5, 6].
В связи с этим повышение эффективности методов этиологической верификации септических состояний, идентификации инфекционных агентов бактериемий и оценка возможностей современных микробиологических и молекулярно-генетических методов в диагностике этих состояний остается актуальной задачей.
Цель исследования - сравнение эффективности традиционных и новых микробиологических и молекулярно-генетических методов идентификации инфекционного агента в крови при септических состояниях у больных ВИЧ-инфекцией.
Материал и методы_
Дизайн исследования. Были исследованы образцы венозной крови, полученные от 130 больных ВИЧ-инфекцией из городских стационаров Санкт-Петербурга и Областной больницы УФСИН Ленинградской области. Показанием для включения пациента в исследование было нали-
чие выраженного синдрома системного воспаления: аксиллярная температура выше 38 °С, тахикардия больше 90 ударов в 1 мин., частота дыхания выше 20 в 1 мин. [7, 8], уровень CD4, равный или ниже 0,2х109/л.
Образцы крови собирались во флаконы со средами для автоматизированной системы ВАСТЕС™ 9050 и в дополнительную вакуумную пробирку Green Vac-Tube ЭДТА-К3, для исследования методом микроскопии, посева на плотные среды для выделения микобактерий туберкулеза и для поли-меразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Реагенты, среды, оборудование. Применяли наборы реагентов для работы с автоматизированной системой ВАСТЕС™ 9050: автоматизированной системой для гемокультивирования BD BACTEC™ 9050/FX, BD BACTEC™ Myco/F Lytic medium, BD BACTEC Plus Aerobic Lytic/F, BD BACTEC Mycosis IC/F, тест-систем BD Enterotube™ II, МРТ 64 M. tuberculosis complex (Becton Dickinson, США).
Посев крови также проводился на плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-II, приготовленные в лаборатории в соответствии с инструкцией [9].
Для идентификации микобактерий туберкулеза применяли иммунохроматографический тест для детекции антигена МРТ 64 M. tuberculosis complex (Becton Dickinson, США). Для дифференциров-ки немикобактериальной флоры применяли BD Enterotube™ II.
Для окраски мазков крови по Граму и Цилю-Нильсену применяли готовые наборы «Микро-Грам-НИЦФ» и «Микро-Циль-Нильсен-НИЦФ» (ЗАО «НИЦФ», СПб, РФ). Для выявления кислотоустойчивых бактерий (КУБ) люминесцентными красителями использовали 0,1% раствор аурами-на О и 0,01% раствор родамина В (Sigma, США).
Выделение ДНК M. tuberculosis complex осуществляли с помощью набора «Амплитуб-РВ М-сорб-туб-2». Для амплификации нуклеотид-ной мультикопийной последовательности IS6110, специфичной для M. tuberculosis complex, использовали тест-набор «Амплитуб-РВ-Скрин» (ООО «Синтол», Россия). Амплификация проводилась в термоциклере с оптическим модулем ICycler IQ5 (Bio-Rad, Франция).
Для дифференциации нетуберкулезных мико-бактерий использовали реагенты GenoType® Mycobacterium CM/AS на основе мультиплексной амплификации с биотинилированными праймера-ми и последующей реверс-гибридизацией производства (Hain Lifescience, Германия).
Методы. Полученные образцы венозной крови засевались на одну или три питательные среды ВАСТЕС 9050: 130 флаконов среды BD BACTEC™ Myco/F Lytic medium (для выявления микобак-терий), по 80 флаконов среды BD BACTEC Plus Aerobic Lytic/F (для выделения аэробной микрофлоры) и BD BACTEC Mycosis IC/F (для выделения грибковой флоры). Параллельно проводился посев (130 образцов) на плотные яичные среды Левенштейна-Йенсена и Финн-2 для выделения микобактерий. Проводилось также исследование мазков, приготовленных из образцов и окрашенных по Граму и люминесцентными красителями для выявления КУБ.
Выделение общей ДНК проводили из 1,0 мл венозной крови с последующей амплификацией специфичного для микобактерий туберкулезного комплекса ДНК-последовательности IS6110 по программе, согласно рекомендациям производителя тест-системы OOO «Синтол» (Россия).
Идентификацию выделенных культур микобактерий проводили методами окраски по Цилю-Нильсену, иммунохроматографическим тестом и с помощью детекции антигена МРТ 64 M. tuberculosis complex (Becton Dickinson, США). Идентификация неспецифической бактериальной флоры проводилась с использованием тест-систем BD Enterotube™ II для грам(-) бактерий и биохимических тестов для грам(+) бактерий. При наличии отрицательного результата амплификации, положительного роста на среде BACTEC™ Myco F/Lytic, отрицательного результата хромотографического теста BD и при положительной микроскопии КУМ проводилась дифференцировка нетуберкулезных микобактерий молекулярно-генетическим методом, по программе и инструкциям производителя тест-системы.
Статистический анализ полученных данных проводили с использованием приложений «Microsoft Office Excel 2003». 95% доверительный интервал рассчитывался по методу Клоппера-Пирсона, для выявления статистической достоверности различий между группами был использован критерий Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне двусторонней статистической значимости (р) менее 0,05.
Результаты исследований_
Образцы крови от 80 больных с синдромом системного воспалительного ответа были помещены в три жидкие среды (Myco/F Lytic, Plus Aerobic/F и Mycosis IC/F). Рост микроорганизмов был обнаружен в 31 образце, 28 из которых (90,3%) дали рост на среде Myco/F Lytic. Доля
M. avium/M. intracellulare Enterobacter spp. (5%) Прочие
(6%) ч / ^ (5%)
M. tuberculosis (7%)
S. epidermidis/S. saprophyticus (15%)
Отрицательные (62%)
Результаты этиологической верификации септических состояний методом посева.
культур, выросших на средах Plus Aerobic/F и Mycosis IC/F, была значимо ниже: 38,7% (р=0,01) и 29% (р=0,01) соответственно. Различия в эффективности Plus Aerobic/F и Mycosis IC/F были статистически недостоверными (р=0,49). Из 12 образцов, выросших на среде Plus Aerobic /F, 10 выросли и на среде Myco/F Lytic; две культуры, выросшие только на этой среде, были идентифицированы как Enterococcus faecalis. Среди 9 образцов, выросших на среде Mycosis IC/F, 2 культуры выросли только на этой среде (Staphylococcus epidermidis и E. faecalis). Микобактерии дали рост только на среде Myco/F Lytic.
В связи с большей эффективностью среды Myco/F Lytic, дополнительные исследования 50 образцов крови были проведены с использованием именно этой среды. Суммарно на эту среду было посеяно 130 образцов крови.
Рост микроорганизмов на всех жидких средах был выявлен в 49 образцах (37,7%, 95% ДИ=29,3-46,6) (рисунок). Суммарная эффективность выделения микобактерий методом посева составила 11,5% (15 из 130 образцов, 95% ДИ=6,6-18,3), значительная часть из них оказались нетуберкулезными. M. tuberculosis были выявлены в 9 случаях (6,9%, 95% ДИ=3,2-12,7), M. avium - в 5 (3,9%, 95% ДИ=1,2-8,8), M. intracellulare - в 1 случае (0,8%, 95% ДИ=0,2-4,2) из 130. Методом ПЦР-РВ удалось выявить ДНК M. tuberculosis еще в 10 образцах и увеличить суммарную диагностическую эффективность комплекса тестов до 45,4% (95% ДИ=36,6-54,4); частота выявления M. tuberculosis составила при этом 14,6% (95% ДИ=11,0-21,9). Ни в одном случае не были обнаружены смешанные культуры.
Доля случаев с туберкулезной бактериемией, подтвержденной микробиологическими методами и ПЦР, среди всех верифицированных случаев составила 32,2% (95% ДИ=20,1-45,6).
Сравнение эффективности выявления микобак-терий из образцов крови различными методами (табл. 1) показало наибольшую эффективность
Таблица 1. Выявление микобактерий в крови 130 больных ВИЧ-инфекцией с симптомами сепсиса (% образцов, в которых были выявлены микобактерии)
M. tuberculosis M. avium/М. intracellulare Методы -
абс. % 95% ДИ абс. % 95% ДИ
Люминесцентная микроскопия 3 2,3 0,5-6,6 2 1,5 0,2-5,5
m Й Myco/F Lytic 9 6,9 3,2-12,7 6 4,6 1,7-9,8
ее И ^ ос Левенштейна-Йенсена 6 4,6 1,7-9,8 2 1,5 0,5-6,6
С л К Финн II 7 5,4 2,2-10,8 3 2,3 0,5-6,6
ПЦР-РВ 19 14,6 11,0-21,9 — —
Таблица 2. Спектр микроорганизмов, выделенных из крови больных ВИЧ-инфекцией с симптомами сепсиса методом посева на жидкие среды
Микроорганизм Количество выделенных культур абс. % 95%ДИ
S. epidermidis 17 34,7 21,7-49,6
M. tuberculosis 9 18,4 8,8-32,0
M. avium 5 10,2 3,4-22,2
M. intracellulare 1 2,0 0,1-10,8
Enterobacter spp. 6 12,2 4,6-26,8
Citrobacter spp. 2 4,1 0,5-14,0
Acinetobacter spp. 1 2,0 0,1-10,8
S. saprophyticus 2 4,1 0,5-14,0
Candida glabrata 1 2,0 0,1-10,8
E. faecalis 1 2,0 0,1-10,8
Всего 49 100
при выявлении M. tuberculosis ПЦР-РВ - 19 положительных образцов (14,6%, 95% ДИ=9,0-21,9%). Однако этот метод не позволяет выявить нетуберкулезные микобактерии. Эффективность использования двух плотных сред (Левенштейна-Йенсена и Финн II) и жидкой среды Myco/F Lytic для выделения M. tuberculosis оказалась достоверно ниже эффективности ПЦР-РВ: 4,6% (95% ДИ=1,7-9,8, p=0,006), 5,4% (95% ДИ=2,2-10,8, p=0,01) и 6,9% (95% ДИ=3,2-12,7, р=0,04). Различия в эффективности использования плотных и жидкой сред были недостоверны (р=0,422).
Диагностическая эффективность применения плотных сред при выделении M. avium составила 1,5% для среды Левенштейна-Йенсена (95% ДИ=0,2-5,5) и 2,3% для среды Финн II (ДИ=0,03). Различия со средой Myco/F Lytic недостоверны (р=0,051 и 0,074 соответственно). Единственный штамм M. intracellulare был выделен только на среде Myco/F Lytic.
Эффективность метода люминесцентной микроскопии для выявления КУБ в мазках крови составила 2,3% (95% ДИ=0,5-6,6) для M. tuberculosis
(р=0,01 по сравнению с ПЦР-РВ и р=0,074 по сравнению со средой Myco/F Lytic) и 1,5% (95% ДИ=0,2-5,5) для M. avium (р>0,05 по сравнению со средой Myco/F Lytic - различия недостоверны).
Время появления роста культуры немикобакте-риальных бактерий на жидких средах составляло в среднем 1,2 (1-3) сут, рост единственной культуры Candida - 3 сут. Среднее время появления роста микобактерий туберкулеза на среде Myco/F Lytic было 28,2 (17-38) сут, M. avium - 19,1 (7-26) сут, для единственной культуры M. intracellulare -34 сут. Тест ПЦР-РВ на выявление ДНК микобактерий туберкулеза в образцах крови занимал один рабочий день.
Спектр выделенных микроорганизмов на всех средах представлен в табл. 2. Значительную долю среди выделенных культур составили коа-гулазонегативные стафилококки (S. epidermidis и S. saprophyticus), являющиеся представителями нормальной микрофлоры человека (38,8% от всех выделенных штаммов, 95% ДИ=25,2-53,8), что может быть результатом нарушения асептики при взятии крови.
Обсуждение результатов
Востребованность быстрых и эффективных методов этиологической диагностики при синдроме системного воспаления у больных ВИЧ-инфекцией обусловлена непосредственной угрозой жизни для таких пациентов, связанной с быстрым прогресси-рованием полиорганной недостаточности.
Бактериемию как ключевой фактор в патогенезе специфического воспалительного процесса при туберкулезе в историческом аспекте отмечали многие исследователи. Однако, по обобщенным данным, бактериемия отмечалась у 3,7-5,3% больных с различными формами туберкулеза [10, 11]. По данным последних десятилетий, при использовании молекулярно-генетических методов ДНК микобактерий туберкулеза в крови обнаружили у 3,5% пациентов с различными клиническими формами туберкулеза и отрицательным ВИЧ-статусом и у 14,6-21,4% (при исследовании периферической крови) с ко-инфекцией туберкулеза и ВИЧ [12, 13].
На основании полученных нами результатов можно сделать вывод, что наиболее эффективным методом выявления возбудителей сепсиса/септических состояний у больных ВИЧ-инфекцией является культуральный метод с помощью автоматизированной системы BACTEC (среда Myco/F lytic): микроорганизмы были выделены в 37,7% образцов. Применение комплекса микробиологических и молекулярно-генетического методов позволило выявить возбудителя сепсиса в 45,4% случаев у ВИЧ-инфицированных больных с синдромом системного воспаления. Микобактерии были выявлены в 11 из 49 случаев выделения возбудителей культуральным методом. Дополнительно к методу посева, ПЦР-РВ, специфичный для микобакте-рий туберкулеза, позволил выявить инфекционный агент (микобактерии туберкулезного комплекса) еще в 10 случаях.
Эффективность ПЦР-РВ для выявления M. tuberculosis составила 14,6% против 6,9% при использовании наиболее эффективной среды Myco/F Lytic. Сравнение временных затрат ПЦР-РВ диагностики и бактериологических методов в случае туберкулезного сепсиса показывает значительные преимущества молекулярно-генетической технологии: подтверждение туберкулезной природы системного воспаления методом ПЦР-РВ соста-
вило 1 сутки, а при посеве на жидкую среду Myco/F Lytic - в среднем 28 суток (от 17 до 38 суток).
Однако только посев на жидкую среду позволил выделить культуру возбудителя немикобактери-альной природы и нетуберкулезных микобактерий у 6 пациентов, на этом основании установить достоверный диагноз и начать адекватную терапию.
Применение молекулярно-генетических методов для идентификации как туберкулезных, так и нетуберкулезных микобактерий, вместо методов биохимической и фенотипической идентификации, позволило сократить время постановки этиологического диагноза от нескольких суток до двух недель.
Несмотря на то что в связи с малым количеством исследованных образцов и выделенных культур, достоверных различий в эффективности применения жидкой среды и двух плотных сред не выявлено, на среде Myco/F Lytic удалось выделить больше культур M. tuberculosis и нетуберкулезных микобактерий, чем на плотных яичных средах. При этом не было ни одной культуры, которая выросла бы только на плотных средах и не выросла на жидкой среде. В связи с этим, мы считаем применение среды Myco/F Lytic предпочтительным, особенно при подозрении на микобактериоз.
Туберкулезная природа сепсиса была выявлена в 32,2% от всех всех этиологически верифицированных случаев. Нетуберкулезные микобактерии (M. avium/M. intracellulare) были выявлены в 9,2% от всех этиологически верифицированных случаев системного воспаления.
Применение комплекса микробиологических методов с использованием жидких питательных сред и молекулярно-диагностических методов для выявления этиологии септического состояния сегодня является наиболее эффективным способом верификации диагноза при синдроме системного воспаления и, особенно, у ВИЧ-инфицированных пациентов. При подозрении на туберкулезную природу воспаления в первоочередном порядке необходимо применять молекулярно-генетические методы.
Благодарность.
Исследование проводилось с реагентами и при использовании оборудования, предоставленными безвозмездно компанией BD Diagnostics.
Литература
1. Хаертынова И.М. Романенко О.М., Сиразиева Ф.К., Замятина Э.А., Курмашева Е.В., Микусев Р.Ю. и др. Особенности течения сепсиса у больных ВИЧ-инфекцией. В кн.: Материалы научно-практической конференции с международным участием «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики» Харьков, 2006. - С. 232-3.
2. Markowitz N., Hansen N.I., Hopewell P.C., et al. Incidence of tuberculosis in the United States among HIV-infected persons. The pulmonary complications of HIV infection study group. Ann Intern Med 1997; 126:123-32.
3. Пантелеев А.М. Туберкулез органов дыхания у больных с ВИЧ-инфекцией. ВИЧ-инфекция и иммуносу-прессия 2010; (1):16-22.
4. Грувер К.П., Белобородов В.Б. Клиническое значение бактериемии у больных сепсисом. Клин микробиол антимикроб химиотер 2011; 13(1):90-7.
5. Grinsztejn B., Fandinho F.C., Veloso V.G., et al. Mycobacteremia in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. Arch Intern Med 1997; 157:2359-63.
6. Waddell R.D., Lishimpi K., von Reyn C.F., et al. Bacteremia due to Mycobacterium tuberculosis or M. bovis, bacille Calmette-Guerin (BCG) among HIVpositive children and adults in Zambia. AIDS 2001; 15:55-60.
7. American College of Chest Physicians/society of Critical Care Medicine Consensus Conference Committee:
American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference. Definition for sepsis and multiple organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med 1992; 20:864-74.
8. Abraham Е., Matthay M.A., Dinarello C.A., et al. Consensus conference definitions for sepsis, septic shock, acute lung injury, and acute respiratory distress syndrome: Time for a reevaluation. Crit Care Med 2000; 28:232-5.
9. Приказ МЗ РФ от 21 марта 2003 г №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Приложение 11. Инструкция по унифицированным микробиологическим исследованиям при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза.
10. Беневоленский П.И. Туберкулезная бациллемия при туберкулезе и нетуберкулезных заболеваниях. Л.: Военно-морская медицинская академия, 1945. - 57 с.
11. Dalencour F. La bacillémie tuberculeuse et la phtisiogénèse;essai d'une synthèse de la phtisiologie. Paris: Doin (Clamart: impr. de Habauzit); 1954.
12. Richter С., Кох L.F., Van-Leeuwen J.V., Mtoni I., Kolk A.H. Clinical significan ce of mycobacteriemia in pulmonary tuberculosis. Eur J Clin. Microbiol Infect Dis 1996; 15:813-7.
13. Mumtaz A.K., Sajjad H.M., Shahid A.A., Tariq B., Masood A. Peripheral blood-based polymerase chain reaction in diagnosis of pulmonary tuberculosis. J Ayub Med Col Abbottabad 2006; 18:25-8.
