Бактериофаги псевдомонад из желудочно-кишечного тракта зубров: выделение и первичный анализ Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 578.4:579.678 БАКТЕРИОФАГИ ПСЕВДОМОНАД ИЗ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА ЗУБРОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ И

ПЕРВИЧНЫЙ АНАЛИЗ PSEUDOMONAS BACTERIOPHAGES FROM THE GASTROINTESTINAL TRACT OF THE EUROPEAN BISON: ISOLATION AND PRIMARY ANALYSIS

Зимин Андрей Антонович, к.б.н.,

Никулин Никита Алексеевич,

Сузина Наталья Егоровна, к.б.н.,

Институт биологии и физиологии микроорганизмов

им. Г. К. Скрябина РАН,

Российская Федерация, г. Пущино

Землянко Ирина Ивановна,

Приокский-террасный государственный заповедник им. М.А. Заблоцкого, Российская Федерация, пос. Данки Кононенко Сергей Иванович, д.с.-х.н.,

Северо-Кавказский научно-исследовательский институт животноводства, Российская Федерация, г. Краснодар Zimin Andrej Antonovich, Cand. Biol. Sci., Nikulin Nikita Alekseevich, Suzina Natalia Egorovna, Cand. Biol. Sci.,

Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Pushchino, Russia Zemlyanko Irina Ivanovna, M.A. Zablotskyy Prioksky Terraced State Reserve Donki, Moscow Region, Russian Federation Kononenko Sergey Ivanovich, Dr. Agr. Sci.,

North-Caucasus Research Institute of Animal Husbandry, Krasnodar, Russian Federation

Аннотация: бактериофаги псевдомонад были обнаружены у зубров, обитающих в Центральном зубровом питомнике При-окского террасного заповедника, животных родственных крупному рогатому скоту. Методом трансмиссионной электронной микроскопии были идентифицированы фаги P.aeruginosa мор-

фотипов А1, A2 и F1 отмечается возможная связь обнаружения этих фагов с диареей одного из молодых животных.

Ключевые слова: животноводство; зубры; кишечная микрофлора; бактериофаги; фаги морфотипов А1, A2 и F1. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 16-44-230855-р_а.

Abstarct:рseudomonas bacteriophages have been found in European bison living in the Central bison nursery of Prioksky terraced reserve, animals related to cattle. P.aeruginosa phages of morphotypes A1, A2 and F1 were identified by transmission electron microscopy. It noted a possible link of detection of these phages with diarrhea of one of the young animal. The reported study was partially supported by RFBR, research projects No. No. 16-44-230855-р_а., 15-07-05783 and 13-04-00991.

Key words: livestock; European bison; intestinal microflora; bacteriophages; phages of morphotypes A1, A2, and F1.

На основе изучения литературы мы пришли к выводу о необходимости подробного исследования ассоциации P.aeruginosa с коровами и другими представителями крупного рогатого скота. Данный микроорганизм не считается нормальным обитателем кишечного тракта у большинства сельскохозяйственных животных, тем не менее давно уже известно о его размножении в ЖКТ крупного рогатого скота в связи с различными инфекциями при дисбиозе [1, 2].

Чаще всего P.aeruginosa связывают с дополнительными бактериальными инфекциями при мастите вымени коров. Основным возбудителем этой инфекции является стафиллококк, а P.aeruginosa может быть одним из дополнительных возбудителей. В кишечном тракте у большинства животных, тем не менее, различные инфекции время от времени наблюдаются. Подробное изучение литературы показало необходимость получения дополнительной информации об ассоциации P.aeruginosa с животными.

В некоторых стадах коров достаточно часто сталкиваются с инфекциями, вызванными P.aeruginosa [3, 7]. Использование в качестве модельного объекта для этой цели европейского зубра весьма интересно тем, что данное животное обитает не в усло-

виях фермы, а в лесу. P.aeruginosa, это микроорганизм часто встречающийся в почве и природных водоемах. Попадание его в корм как животных, выращиваемых на ферме, так в особенности животных полувольного обитания в вольерах большой площади, таких как зубры Центрального зубрового питомника ПТГЗ им. М.А.Заблоцкого, весьма вероятно. Выделенные из ЖКТ зубров бактериофаги могут послужить основой для новых терапевтических препаратов [4-6], как для лечения этих животных, так и крупного рогатого скота.

Методика. Материалом для исследования послужили пробы фекалий зубров из различных загонов, включая загон для ослабленного молодняка, стандартный загон для содержания мини стад, и загон для содержания стада подросших животных.

После отбора пробы взвешивались и их ресуспендировали в буферном растворе, аликвотировались, после чего центрифугировались. Из супернатанта делали серию 10-кратных разведений, из которых производили высевы на питательную среду, и на культуры лабораторных штаммов E.coliB и С600 методом агаровых слоев; после чего посевы инкубировались 24 ч при 37°C. Высев на штамм Pseudomonas aeruginosa PAO1 проводили после 3 месяцев хранения при -20°С.Для хранения, к суспензии фагов добавляли глицерин до 50 % (об/об) и хранили при -20°C. После обработки, проводился высев фагов на штамм Pseudomonas aeruginosa PAO1 методом Грациа.

Фаголизаты получали на среде LB. Частичную очистку фаголизатов проводили путем фильтрации через фильтры фирмы Mülipore с отверстиями 0.22 мкм. Препараты для исследования с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) проводили путем смачивания металлической сеточки для электронной микроскопии, покрытой формваровой пленкой, высушивания и контрастирования 1 % раствором уранилацетата.

Результаты исследований и их обсуждение. В большинстве проб титр фагов на штамме P. aeruginosa PAO1 был от 15 до 120 бляшек на грамм фекалий, лишь в пробе, отобранной из загона для ослабленного молодняка, переболевшего диареей титр составлял 102 БОЕ. Исследование морфологии фагов. Все бактериофаги первой группы могут быть отнесены к морфотипу А1 семейства Миовириды. Скорее всего, они относятся к двум

видам фагов: один вид — это бактериофаг 2А1 и другой бактериофаг — это частицы 2А2. Головка частиц имеет длину 88,5 ± 1 нм, ширину 82±1 нм. Это изометрические головки, что и позволяет отнести эти бактериофаги к морфотипу А1. При этом хвосты бактериофагов немного варьируют, как по длине (примерно 100 нм), так и по диаметру (примерно 23 нм). Также были обнаружены бактериофаги морфотипа А2 близкие по диаметру головок к описанным.

На ТЭМ снимках были обнаружены также нитчатые бактериофаги семейства Inoviridae морфотипа F1. Длина частиц была 1100±15 нм и толщина около 17±1 нм. Было замечено различное устройство концов частиц. У обнаруженных на ТЭМ -снимках фагов один из концов представляет собой заостренную головку, а другой немного расширен. Последний имеет диаметр 22± 1 нм. Бактериофаги группы f1 используют для фагового дисплея. Дисплей на новых нитчатых бактериофагах молекулярных меток используется для получения тест систем для экспресс-определения штаммов хозяев таких бактериофагов в пробах из природы. Обнаруженные нами нитчатые фаги могут послужить основой для получения тест-систем для идентификации в пробах из природы или животных патогенных штаммов Pseudomonas aeruginosa.

Выводы. Нами были определены титры фаговов из фекалий зубров и бизонов на штамме P. aeruginosa PAO1. Показано с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, что биоразнообразие бактериофагов псевдомонад в фекалиях зубра весьма ограничено. С помощью ТЭМ в фекалиях зубра обнаружены бактериофаги псевдомонад семейств Myoviridae и Inoviridae морфотипов А1, А2 и F1. С помощью ТЭМ в фаголи-затах штамма P. aeruginosa PAO1 были обнаружены многочисленные везикулы размером от 40 до 150 нм в диаметре.

Фаги псевдомонад были обнаружены во всех пробах фекалий зубров и бизонов. Это, вероятно, связано с летним кормлением свежими зелеными кормами. Более высокий титр этих фагов был у переболевшего диареей животного. Вероятно, P.aeruginosa был дополнительным возбудителем при диарее. С помощью ТЭМ выявлено мало морфотипов бактериофагов псевдомонад в ЖКТ этих быков. Возможно, фаги P.aeruginosa не

адаптированы к этим условиям. Выделенные фаги могут оказаться перспективными для антибактериальной терапии при их применении против инфекций, вызываемых P.aeruginosa у животных и людей.

Список литературы

1. Bhatt VD, Ahir VB, Koringa PG, Jakhesara SJ, Rank DN, Nauriyal DS, Kunjadia AP, Joshi CG. Milk microbiome signatures of subclinical mastitis-affected cattle analysed by shotgun sequencing. J Appl Microbiol. 2012 Apr;112(4):639-50. doi:

2. Patel TR, Jackman DM. Susceptibility of psychrotrophic pseudomonads of milk origin to psychrotrophic bacteriophages. Appl Environ Microbiol. 1986Feb; 51(2):446-8.

3. Kubo M, Osada M, Konno S. Morphology of sulfur granules produced by Pseudomonas aeruginosa in cows. Natl Inst Anim Health Q (Tokyo). 1981 Spring; 21(1):26-31.

4. Зимин, А.А. Использование бактериофагов для борьбы с колибактериозом и кампилобактериозом в птицеводстве / А.А. Зимин, Ф.В. Кочетков, С.И. Кононенко, Д.В. Осепчук, Н.Э. Скобликов // Политематический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета. 2016. № 123. С. 421-432. - http://ej.kubagro.ru/2016/09/pdf/29.pdf

5. Скобликов, Н.Э., Забашта Н.Н., Москаленко Е.А., Зимин А.А. Особенности возрастной динамики E.coli кишечного микробиоценоза поросят // Сборник научных трудов СевероКавказского научно-исследовательского института животноводства. - 2012. - Т. 1, - № 1. - С.8-11.

6. Скобликов, Н.Э., Забашта Н.Н., Зимин А.А. Особенности возрастной динамики бактериофагов E.coli кишечного микробиоценоза поросят // Сборник научных трудов СевероКавказского научно-исследовательского института животноводства. - 2012. - Т. 1, - № 1. - С.22-26.

7. Скобликов, Н.Э. Оптимальная схема применения не-трансдуцирующих бактериофагов E. coli для профилактики пост-отъемной диареи поросят / Н.Э. Скобликов, С.И. Кононен-ко, А.А. Зимин // Труды Кубанского государственного аграрного университета. - 2012. - № 37. - С. 169-173.