CC BY
88
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.841.93:578.81].083.12
Шах Махмуд Р., Гарифулина К.И., Ульянова В.В., Евтюгин В.Г., Миндубаева Л.Н., Хазиева Л.Р., Дудкина Е.В., Вершинина В.И., Колпаков А.И., Ильинская О.Н.
бактериофаги почвенных БАЦИЛЛ: НОВЫЙ ПОЛИВАЛЕНТНЫЙ
фАГ BACILLUS ALTITUDINIS
ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», 420008, Казань
Бактерии рода Bacillus - почвенные сапрофиты, факультативные анаэробы, развивающиеся в диапазоне температур 28-37oC. На основе 16S рРНК каталогизации они образуют когерентный кластер с широкой вариабельностью по вирулентности. В связи с неограниченными возможностями использования бактериофагов бацилл для фаготипирования бактерий при контроле состояния почвы, воды и пищевых продуктов, а также в качестве векторов, участников горизонтального переноса генов и потенциальных терапевтических агентов, характеристика биоразнообразия фагов рода Bacillus вносит вклад в пул перспективных инструментов молекулярной биологии и биомедицины. В настоящем исследовании унифицирована схема выделения почвенных бактериофагов, позволившая выделить 10 фагов бацилл из различных типов почв. Показано, что общее количество фагов зависит от уровня плодородия и убывает в ряду почв «чернозем - каштановая полевая - серая лесная - городская незагрязненная - городская нефтезагрязненная». Детально охарактеризован новый поливалентный ДНК-содержащий бактериофаг SRT01hs B. altitudinis, способный заражать также B. subtilis, B. cereus, B. pumilus, но не B. licheniformis и B. atrophaeus. Классическая структура этого бактериофага общей длиной 360 нм включает головку в виде икосаэдра размером 100 нм в диаметре. Несколько фагов одновременно атакуют клетку B. altitudinis, повышая уровень внутриклеточной низкомолекулярной РНК. Инфицирование фагом практически полностью элиминирует стационарную фазу роста зараженных бацилл и приводит к перманентному возрастанию количества фага в культуральной жидкости, исключая период высокой активности секретируемой РНКазы.
Ключевые слова: почвенные фаги; Bacillus; B. altitudinis; бактериофаг B. altitudinis; внутриклеточная РНК; секретируе-мая РНКаза.
Для цитирования: Шах Махмуд Р., Гарифулина К.И., Ульянова В.В., Евтюгин В.Г., Миндубаева Л.Н., Хазиева Л.Р., Дудкина Е.В., Вершинина В.И., Колпаков А.И., Ильинская О.Н. Бактериофаги почвенных бацилл: новый поливалентный фаг Bacillus al-titudinis. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35 (2): 59-64. DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-59-64.
Бактериофаги - наиболее многочисленная, широко распространенная в биосфере группа вирусов, основной нишей которых служит плодородная почва. Лизируя клетки бактерий и архей, фаги осуществляют контроль численности микробных популяций. Количество бактериофагов (1032) [1] на земле во много раз превышает общее количество бактерий (4,1-6,4 х 1030) [2]. За 1 секунду на планете происходит 1023 заражений [3], причем каждый цикл репродукции фага путем «взрыва» одной клетки приводит к выходу до нескольких сотен новых вирусных частиц. В процессе трансдукции фаги могут передавать от одного хозяина к другому собственные и «захваченные» гены. Бактериофаги используют в качестве векторов в генной инженерии, на их основе разработан метод фагового дисплея для изучения белок-белковых и ДНК-белковых взаимодействий [4-6]. Фаготерапия бактериальных инфекций, особенно вызванных антибиотикорезистентными микроорганизмами, еще не до конца реализовала свой потенциал. В связи с этим значительное число исследований посвящено спо-
Для корреспонденции: Шах Махмуд Раихан (Shah Mahmud Raihan), e-mail: [email protected]
собности фагов поражать возбудителей инфекций [7] и переносить гены устойчивости к антибиотикам [8]. Растет количество публикаций, связанных с исследованием фаговых интегронов и генных кассет, их функционированием и путями распространения среди клинических штаммов бактерий [9, 10].
Ресурс биоразнообразия почвенных фагов практически не охарактеризован. В связи с этим настоящее исследование проведено с целью выделения и характеристики новых почвенных бактериофагов, поражающих наиболее распространенные виды бацилл. Жизнедеятельность представителей рода Bacillus, секре-тирующих разнообразные гидролитические ферменты - рибонуклеазы, протеазы, хитиназы, липазы [11-14] и др. - вносит вклад в плодородие почв, приводит к образованию пула легкодоступных веществ, стимулирующих рост растений [15]. Бациллы широко варьируют по уровню патогенности. Вследствие горизонтального переноса генов, во многом связанного с интегронами в составе фагов, функциональные свойства почвенных бацилл меняются. Зафиксированы случаи сепсиса, вызванного транзитными B. pumilus, обычно не имеющими клинических проявлений [16]. У B. subtilis установлено наличие в геноме фаговых генов, кодирующих полиглу-тамат гидролазу, необходимую фагам для разрушения клеточного чехла; вследствие горизонтального переноса эти гены обнаружены и у других почвенных бактерий [17]. Фаговые ферменты - эндолизины, разрушающие клеточные стенки бактерий, рассматривают как потенциальную альтернативу антибиотикам [18].
Бациллярные бактериофаги (ББ) являются дцДНК-содержащими бактериофагами и согласно классификации Международного комитета по таксономии вирусов ICTV (2015) (http://ictvonline.org/) относятся к порядку Caudovirales, а также к независимому семейству Tectiviridae, не принадлежащему ни к одному из порядков. Представители порядка Caudovirales имеют хвост и головку, оболочки нет, ДНК линейная, вирусы семейства Tectiviridae не имеют хвоста. Порядок Caudovirales включает семейства Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae. Из 50 известных видов бациллярных фагов 24 вида представляют подсемейства Spounavirinae (1 вид) и независимые роды (23 вида) семейства Myoviridae, характеризующегося наличием сократительного хвоста. Фаг Bacillus virus SP01 из семейства Spounavirinae имеет размеры 108 нм (головка) и 140 нм (хвост), содержит в вирионе линейную ДНК размером 147 тыс. п.о., поражает бактерии B. subtilis [19]. ББ из Myoviridae, представленные семью независимыми родами: Agatevirus (3 вида), B4virus (5 видов), Bastillevirus (2 вида), Bc431virus (4 вида), Cp51virus (3 вида), Nit1virus (3 вида), Wphvirus (1 вид), имеют геном 138-165 тыс. п.о. (www.ncbi.nlm. nih.gov/genome) и поражают такие виды бацилл, как B. pumilus, B. subtilis или бактерии группы B. cereus. К семейству Siphoviridae относятся 18 видов бациллярных фагов. Они имеют длинный несократительный хвост, размер ДНК генома составляет в среднем от 36 до 81 тыс.
п.о., они представлены родами Andromedavirus (8 видов), Cecivirus (2 вида), Slashvirus (4 вида), Spbetavirus (1 вид), Tp21virus (2 вида), Wbetavirus (1 вид) и заражают бактерии B. pumilus, B. subtilis, B. megaterium или патогенные бактерии из группы B. cereus (B. cereus, B. thuringiensis, B. anthrasis) [20]. Бактериофаг Bacillus virus SPbeta (род Spbetavirus) заражает бактерии B. subtilis. ДНК фага имеет размер 134 тыс. п.о., размер хвоста около 355 нм (ExPASy Портал SIB биоинформатических ресурсов, http://viralzone.expasy.org/). Малочисленные ББ из семейства Podoviridae имеют короткий несократительный хвост и представлены подсемейством Picovirinae, родом Phi29virus (3 вида). Фаг, поражающий B. subtilis имеет ДНК размером около 19 тыс. п.о. Независимый род Pagevirus семейства Podoviridae содержит 5 видов фагов с геномами 40 тыс. п.о., заражающими B. megaterium. К роду Tectivirus семейства Tectiviridae относятся 2 вида ББ с размером генома 15 тыс. п.о. Они не имеют хвостов и обычно покрыты липидной мембраной, заражают бактерии из группы B. cereus [21].
Современные публикации в основном посвящены исследованиям бактериофагов E. coli [22]. Естественные регуляторы численности почвенных бацилл - бациллярные бактериофаги - изучены недостаточно: их специфичность, тип и размер нуклеиновой кислоты, взаимодействие с клеткой хозяина и роль в модификации функций зараженной клетки - эти вопросы во многом нуждаются в современной проработке. В связи с вышеизложенным целью настоящей работы стало выделение почвенных ББ, оценка их специфичности и характеристика основных свойств. Проведенные нами эксперименты позволили выделить 10 штаммов ББ из почвенных образцов, выявить преобладающие по специфичности ББ в разных типах почв и детально охарактеризовать бактериофаг SRT01hs B. altitudinis, не описанный ранее.
Материал и методы исследования
Почвенные образцы и штаммы бацилл. Бактериофаг-содержащие образцы почв отбирали с глубины 10 см и хранили в темноте при 4oC. В качестве индикаторных культур использовали штаммы B. subtilis 9а, B. altitudinis B-388, B. atrophaeus, B. cereus, B. pumilus 7р, B. licheniformis из коллекции кафедры микробиологии Казанского федерального университета) и штаммы, выделенные нами из черноземной (B. subtilis MGS1 и B. megaterium MGS1) и каштановой (B. pumilus MGS2 и B. megaterium MGS2) почв Республики Татарстан. Для выделения ББ использовали также незагрязненную и загрязненную нефтью почвы с территории Альметьевска. Идентификация всех бактериальных штаммов, используемых в работе, подтверждена масс-спектрометрически на MALDI «Biotyper», серия «Microflex» («Bruker Corporation», Германия). Предварительно индикаторные бактерии были проверены на наличие в геноме профагов, выход которых индуцировали облучением бактерий (10 мин, расстояние 10 см от УФ-лампы «Vilber lourformat», Франция) с последующей инкубацией (жидкая среда LB, 90 мин, 37oC). После осаждения бактерий (25 мин, 5000 g) надосадочную жидкость обрабатывали хлороформом (50 мкл на 1 мл суспензии, 10 мин). Содержание фага в суспензии определяли по методу Грациа [23]. Отсутствие умеренных фагов у индикаторных бацилл позволило использовать их при выделении ББ.
Культивирование микроорганизмов. Бациллы культивировали на жидкой среде LB при 37oC на вибростенде «Multitron standard» («Infors», Швей-
цария) при 200 об/мин. Влияние фагов на динамику роста B. altitudinis оценивали при 0.01 МЖИ (множественность инфекции, соотношение клеток и фагов 10:1) и 100 МЖИ (соотношение клеток и фагов 1:100). Рост бактерий измеряли фотометрически (590 нм, КФК-2, Россия)
Получение фагосодержащей суспензии. Для получения первичных суспензий фагов 200 мкг исследуемых почвенных образцов, 700 мкл инокулята индикаторной культуры и 2 мл свежей среды LB инкубировали с аэрацией (24 ч, 37oC). Почву и бактерии осаждали (25 мин, 5000 g). Супернатант после обработки хлороформом фильтровали («Millipore», США; диаметр пор 0,45 мкм). В полученной суспензии выявляли наличие фагов модифицированным методом Фишера [23]. Для определения количественного содержания бактериофагов первичные суспензии фагов инкубировали с индикаторной культурой (вторичная культура ББ), после удаления бактериальной массы определяли титр фагов по методу Грациа.
Характеристика нуклеиновой кислоты фага. Выделение ДНК бактериофага проводили стандартным фенол-хлороформным методом [24]. Определение типа нуклеиновых кислот (НК) фага проводили, обрабатывая НК фага ДНКазой I («Thermo Scientific», США) и РНКа-зой А («Thermo Scientific», США) согласно инструкции производителя.
Активность внеклеточной РНКазы B.altitudinis. РНКазную активность культуральной жидкости определяли в реакции с дрожжевой РНК («Sigma», ФРГ) по образованию кислоторастворимых продуктов. За единицу активности принимали количество РНКазы, которое вызывает увеличение поглощения РНК (1 мкг/ мл) на одну оптическую единицу при 260 нм за 1 ч инкубации при 37oC в пересчете на 1 мл культуральной жидкости [12].
Электронная микроскопия. Ультратонкие срезы (70 нм) готовили на ультрамикротоме «Leica UC7» (Германия). Для негативного контрастирования использовали очищенный и сконцентрированный препарат бактериофага SRT01hs и бактериофага с клетками B. altitudinis. Микрофотосъемку образцов проводили на автоэмиссионном сканирующем электронном микроскопе «Merlin» («Carl Zeiss», Германия) в STEM режиме при ускоряющем напряжении 30 кэВ.
Выделение РНК B. altitudinis. Тотальная РНК B. altitudinis, зараженной фагом B. altitudinis при 100 МЖИ, была получена из клеток экспоненциальной фазы роста. Зараженные клетки инкубировали в среде LB 30 мин при 37oC. После осаждения клетки промывали 0,9% NaCl и 10 мМ Трис-HCl, рН 8,0. К 109 бактериальных клеток добавляли 600 мкл лизирующего буфера RLT («QiaÄmp
Наличие вирусов бактерий рода Bacillus в почвенных образцах Альметьевском района Республики Татарстан
Тип почвы
Штамм бактерий чернозем каштановая лесная городская чистая городская нефтеза-грязненная Всего фагов
B. altitudinis B-388 B. .subtilis 9A B. pumilus MGS2 B. megaterium MGS2 B. subtilis MGS1 B. megaterium MGS1
Всего. 60
10
+
5
+
+
+
+
+
+
+
+
+
4
3
1
1
RNA Blood mini Kit») и 300 мг гомогенизирующих шариков Silica с диаметром 0,1 мм («Thomas Scientific», США). Клетки обрабатывали в гомогенизаторе FastPrep-24 (MP Biomedicals, США) 4 раза по 5 с при мощности 5 M/S. Осаждение и очистку тотальной РНК осуществляли по инструкции к набору «QiaAmp RNA Blood mini Kit». Аналогично выделяли РНК незараженных бактерий. Полученные образцы РНК хранили при -80oC.
Для количественной оценки выделенной РНК бактерий использовали флуориметр «Qubit 2.0» («Life Technologies», США). Качественную оценку содержания всех типов РНК клеток проводили на биоаналайзере («Agilent 2100 Bioanalyzer», США) с использованием набора реактивов «Agilent 6000 pico Kit» и чипа «Alilent RNA pico» согласно инструкции производителя.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью подпрограммы статистического анализа графической программы «SigmaPlot 10» («Systat Software Inc.», США) и «Microsoft Excel 2010» («Microsoft Corporation», США).
Результаты и обсуждение
Бактериофаги рода Bacillus в разных типах почв
Для обнаружения и выделения ББ мы использовали различные образцы почв, которые можно выстроить в традиционную линейку по убыли плодородия и содержания бацилл: чернозем - каштановая почва - серая лесная почва - городская почва - нефтезагрязненная городская почва. Всего нами было получено 10 штаммов ББ с различной специфичностью в отношении бацилл. Среди ББ, выделенных нами по действию на шесть индикаторных штаммов, преобладали почвенные бактериофаги B. subtilis в связи с широкой распространенностью этого вида (см. таблицу). Сравнительный анализ показал, что количественное содержание фагов в почве пропорционально снижается с уменьшением количества доступных питательных веществ в почвенных образцах. По сравнению с черноземом, содержание бактериофагов B. subtilis в полевой каштановой, серой лесной, городской чистой и городской нефтезагрязненной почве уменьшалось в 1,4, 1,5, 9 и 35 раз, соответственно (рис. 1, А).
Обнаружено, что в различных почвах присутствуют ББ, отличающиеся по специфичности. Отличается и содержание бактериофагов бактерий разных видов внутри одного рода Bacillus. Так, содержание бактериофагов B. megaterium в каштановой почве более чем в два раза превышает таковое в черноземе, а фаг B. pumilus по численности в каштановой почве соответствует содержанию фага B. megaterium в черноземе. В полевой почве количество фага B. megaterium на 50% ниже, чем фага B. pumilus, а в черноземе его на 19% ниже, чем такового B. subtilis (см. рис. 1, Б, В).
Новый поливалентный бактериофаг SRT01hs B. al-titudinis
Мы сконцентрировали свое внимание на изучении фага SRT01hs B. altitudinis, учитывая, что эта бактерия хорошо охарактеризована как продуцент внеклеточной рибонуклеазы, аналог которой, известная РНКаза бина-за, проявляет противовирусные и противоопухолевые свойства [25, 26], а бактериальный геном секвенирован [27]. Этот фаг, выделенный нами из чернозема, оказался поливалентным: он способен заражать 4 из 6 индикаторных штаммов - B. altitudinis, B. subtilis, B. cereus, B. pumilus, и не действует на B. licheniformis и B. atro-phaeus (рис. 2, а). Специфичность фага SRT01hs к B. altitudinis максимальна; по отношению к B. subtilis и B. pumilus она снижается на 4 порядка, соответственно; а по отношению к B. cereus - на 5 порядков. Эти различия
4-108-,
2
ïr „ о з-ю8-
ш
1Ю8-
У////////Ь
О 20 40 60 80 100120 Тип вируса (БОЕ/мл), %
0 20 40 60 80 100120 Тип вируса (БОЕ/мл), %
Рис. 1. Количественное содержание бациллярных бактериофагов в почвенных образцах. А - фаги B. subtilis 9A, выделенные из различных почв: 1 - чернозема, 2 - серой лесной, 3 - полевой каштановой, 4 - городской чистой, 5 -городской нефтезагрязненной почвы. Фаг B. megaterium MGS2 (а), фаг B. pumilus MGS2 (б), фаг B. megaterium MGS1 (в), фаг B. subtilis MGS 1 (г), выделенные из полевой каштановой (Б) и черноземной (В) почв.
зависят от наличия вирус-специфических рецепторов на мембране клеток, особенностей механизмов регуляции транскрипции вирусного генома и экспрессии вирусных белков. Так, наличие у бактерий генов системы CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats), осуществляющей защиту от вторжения фагов сходным с
Рис. 2. Спектр действия выделенного из чернозема поливалентного бактериофага SRT01hs В. altitudinis (а) и его жизнеспособность (б) после 6 мес хранения. К - титр вируса в вируссодержащей суспензии до хранения.
Рис. 3. Бактериофаг SRT01hs В. аШМт^. незараженная бактерия-хозяин бактериофага (а); свободный бактериофаг (б); фаги (указаны стрелками) на клетке В. altitudinis (в); электрофореграмма, позволяющая определить тип нуклеиновой кислоты бактериофага SRT01hs В. altitudinis. К - нуклеиновая кислота фага без обработки, 1 - обработанная РНКазой, 2 - обработанная ДНКазой (г).
РНК-интерференцией механизмом путем захвата и последующей деградации чужеродных ДНК, значительно снижает уровень инфицирования [28]. Возможно, у В. altitudinis эта система отсутствует.
Установлено, что фаг сохраняет 100% жизнеспособности вне хозяина в течение полугода при -80оС, а также и при 4оС, однако в этом случае жизнеспособность была
Рис. 4. Динамика роста вирус-зараженных клеток В. altitudinis на богатой питательной среде (А), содержания вируса и активности РНКаз в культуральной жидкости (Б). (а) - контрольные незараженные фагом 8ЯТ01Ь8 клетки В. (б) - клетки, зараженные при 100 множественных инфекций; (в, д) - клетки, зараженные при 0.01 множественных инфекций; (г) - титр вируса, (е) - активность РНКазы в культуральной среде.
на порядок ниже. При комнатной температуре, как на свету, так и в темноте все вирусы погибали (см. рис. 2, Б).
Электронная микрофотосъемка позволила установить комбинированную морфологическую структуру фага 8ЯТ0Ш8 В. аШ-tudinis, сходную с морфотипом Т-серийных фагов: головка в виде икосаэдра имеет размер 100 нм в диаметре (см. рис. 3, Б, В), длина отростка составляет 180 нм. Общая длина фага примерно 360 нм (см. рис. 3, Б). Хозяйская клетка В. altitudinis имеет размер 1,0 х 2,5 мкм (см. рис. 3, А). Выявлено, что выделенный нами бактериофаг 8ЯТ0^ В. altitudinis является ДНК-содержашим (см. рис. 3, Г). На основе морфологии бактериофаг 8КТ0^ В. altitudinis может быть отнесен к семейству Myoviridae: у него обнаружен сократительный хвост (рис. 3, В), достаточно большая голова, что косвенно указывает на большой размер генома. Размер хвоста бактериофага 8ЯТ0Ш8 более чем 200 нм (рис. 3, Б), что не характерно для ББ 8Р01 из семейства Spounavirinae [19].
Секреция РНКазы В. altitudinis, зараженных бактериофагом
Характер динамики роста зараженных фагом клеток бактерий В. altitudinis значительно отличался от такового у незараженных клеток. При 0,01 МЖИ, экспоненциальная фаза длится на 2 ч, а при 100 МЖИ на 4 ч дольше, чем у незараженных клеток. У зараженных фагом клеток практически отсутствует стационарная фаза роста, они сразу переходят в стадию лизиса - при 100 МЖИ на 12 ч в культуре уже нет жизнеспособных клеток, при меньшем уровне заражения (0,01 МЖИ) сохраняется примерно четверть от максимальной плотности клеток (рис. 4, А).
Титр бактериофага в культуральной среде увеличивается с ростом числа клеток (см. рис. 4, Б). Однако с 8 до 14 ч роста, в период наибольшей активности се-кретируемой РНКазы у вирус-зараженных В. altitudinis, титр вируса практически не возрастает. После 14 ч, когда активность РНКазы резко падает, титр вируса в среде снова возрастает. Вероятно, бактериальная РНКаза токсична для бактериофага. Аналогичный факт был зафиксирован нами ранее и для вируса гриппа А [12, 29]. Сходное действие оказывала РНКаза В. intermedius, снижавшая титр ДНК-содержащего вируса псевдобешенства (вирус болезни Ауески) в перевиваемой культуре клеток почек эмбрионов свиней [30]. Можно предположить, что РНКаза взаимодействует с фагами внутри клеток в момент их перехода от репликации к синтезу белков, снижая продукцию и выход дочерних фагов и, как следствие, общий титр фага в среде.
Влияние бактериофага 8ЯТ0Ш8 на уровень РНК в клетках В. altitudinis
Нами впервые было исследовано влияние бактериофага 8ЯТ0^ В. altitudinis на уровень всех видов РНК зараженной бактерии. Показано, что независимо от инфицирования содержание 168 и 238 рибосомных РНК в клетке остается неизменным. В то же время содержание малых РНК в зараженных клетках в два раза превышает таковое в незараженных (рис. 5, пик 2). Поскольку 58 рРНК в комплексе с 238 рРНК входит в состав большой субъединицы рибосомы, а содержание 238 рРНК в опытном и контрольном образцах было одинаково, вероятно, что возрастание уровня малых РНК происходит за счет активации синтеза тРНК. Последнее физиологически обосновано, так как при заражении клеток вирусом
5
£ ¡E 50-|
25 200 500 1000 2000 4000
Количество нуклеотидов
¡£ í 608 ° 50-¡ § 40-
Я 25 200 500 1000 2000 4000
Количество нуклеотидов
Рис. 5. Профили тотальной РНК неинфицированных (а) и инфицированных вирусом SRTOlhs (б) клеток B. altitudinis.
1 - РНК-маркер, 2 - малые РНК, 3 - 16S рибосомальная РНК, 4 - 23S рибосомальная РНК, 5 - матричные РНК.
за короткое время синтезируется весь спектр вирусных белков, необходимых для завершения его жизненного цикла.
Заключение Выделено 10 почвенных фагов бацилл из различных типов почв. Общее количество фагов зависит от уровня плодородия почв: оно максимально в черноземе и минимально в городской нефтезагрязненной почве. Охарактеризован новый поливалентный ДНК-содержащий бактериофаг SRTOlhs B. altitudinis, в разной степени поражающий близкородственные бациллы. Инфицирование фагом элиминирует стационарную фазу роста зараженных клеток, повышает уровень внутриклеточной низкомолекулярной РНК и вызывает постепенное увеличение количества фага в культуральной жидкости. Во время максимальной активности секретируемой РНКазы B. altitudinis титр фага не возрастает, что свидетельствует о токсическом влиянии РНКазы на бактериофаг.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
финансирование. Работа выполнена в рамках Программы повышения конкурентоспособности Казанского федерального университета и поддержана грантом РНФ № 14-14-00522 в части, касающейся взаимодействия фагов с бактериями. Выделение и характеристику фагов проводили в рамках РФФИ № 15-04-07864 с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета (ID RFMEFI59414X0003).
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-22, 24-29 см. REFERENCES)
23. Шах Махмуд Р., Гарифулина К.И., Никитина Е.В., Ильинская О.Н. Выделение вирусов бактерий из природных экологических ниш Республики Татарстан. Вестник Казанского технологического университета. 2013; 16 (10): 173-8. 30. Алексеева И.И., Куриненко Б.М., Клейнер Г.И., Скуя А.Ж., Пен-зикова Г.А., Орешина М.Г. Сравнительное изучение противовирусной активности панкреатической и микробной РНКаз. Антибиотики. 1981; 26 (7): 527-32.
REFERENCES
1. Wittebole X., de Roock S., Opal S.M. A historical overview of bacteriophage therapy as an alternative to antibiotics for the treatment of bacterial pathogens. Virulence. 2014; 5 (1): 226-35.
2. Clokie M.R.J., Millard A.D., Letarov A.V., Heaphy S. Phages in nature. Bacteriophage. 2011; 1: 31-45.
3. Guzina J., Djordjevic M. Inferring bacteriophage infection strategies from genome sequence: analysis of bacteriophage 7-11 and related phages. BMCEvol. Biol. 2015; 15: S1. DOI:10.1186/1471-2148-15-S1-S1.
4. Yang J., Fuller P.J., Morgan J., Shibata H., McDonnell D.P., Clyne C.D. et al. Use of phage display to identify novel mineralocorticoid receptor-interacting proteins. Mol. Endocrinol. 2014; 28 (9): 1571-84.
5. Pranjol M.Z.I., Hajitou A. Bacteriophage-derived vectors for targeted cancer gene therapy. Viruses. 2015; 7 (1): 268-84.
6. Rawlings A.E., Bramble J.P., Tang A.A.S., Somner L.A., Monnington A.E., Cooke D.J. et al. Phage display selected magnetite interacting Adhirons for shape controlled nanoparticle synthesis. Chem. Sci. 2015; 6: 5586-94. DOI: 10.1039/C5SC01472G.
7. Kwiatek M., Mizak L., Parasion S., Gryko R., Olender A., Niemcewicz M. Characterization of five newly isolated bacteriophages active against Pseudomonas aeruginosa clinical strains. Folia Microbiol. 2015; 60 (1): 7-14.
8. Balcazar J.L. Bacteriophages as vehicles for antibiotic resistance genes in the environment. PLoS Pathog. 2014; 10 (7): e1004219. DOI: 10.1371/journal.ppat.1004219
9. Nogrady N., Kiraly M., Borbas K., Toth A., Paszti J., Toth I. Antimicrobial resistance and genetic characteristics of integron-carrier shigellae isolated in Hungary (1998-2008). J. Med. Microbiol. 2013; 62: 1545-51. DOI: 10.1099/jmm.0.058917-0.
10. Clewell D.B., Weaver K.E., Dunny G.M., Coque T.M., Francia M.V., Hayes F. Extrachromosomal and mobile elements in enterococci: transmission, maintenance, and epidemiology. In: Gilmore M.S., Clewell D.B., Ike Y., Shankar N. (Eds.). Enterococci: from Commensals to Leading Causes of Drug Resistant Infection [internet]. Boston: Massachusetts Eye and Ear Infirmary; 2014.
11. Tang Y., Zou J., Zhang L., Li Z., Ma C., Ma N. Anti-fungi activities of Bacillus thuringiensis H3 chitinase and immobilized chitinase particles and their effects to rice seedling defensive enzymes. J. Nanosci. Nanotechnol. 2012; 12 (10): 8081-6.
12. Shah Mahmud, Ilinskaya O.N. Antiviral activity of binase against the pandemic influenza A (H1N1) virus. Acta Naturae. 2013; 5 (4): 44-51.
13. Nassar F.R., Abdelhafez A.A., El-Tayeb T.S., Abu-Hussein S.H. Proteases production by a bacterial isolate Bacillus amyloliquefaciens 35s obtained from soil of the Nile Delta of Egypt. Br. Microbiol. Res. J. 2015; 6 (6): 315-30.
14. Laachari F., El Bergadi F.E.B., Sayari A., Elabed S., Iraqui M., Har-chali H. et al. Biochemical characterization of a new thermostable lipase from Bacilluspumilus strain. Turk. J. Biochem. 2015; 40 (1): 8-14.
15. Glick B.R. Plant growth-promoting bacteria: mechanisms and applications. Scientifica. 2012; 2012 (963401): 1-15. DOI: 10.6064/2012/963401.
16. Kimouli M., Vrioni G., Papadopoulou M., Koumaki V., Petropoulou D., Gounaris A. et al. Two cases of severe sepsis caused by Bacillus pumilus in neonatal infants. J. Med. Microbiol. 2012; 61: 596-9.
17. Memberti S., Prati P., Cremaschi P., Seppi C., Morelli C.F., Galizzi A. et al. y-PGA Hydrolases of phage origin in Bacillus subtilis and other microbial genomes. PLoS One. 2015; 10 (7): e0130810. DOI: 10.1371/journal.pone.0130810.
18. Nakonieczna A., Cooper C.J., Gryko R. Bacteriophages and bacteriophage derived endolysins as potential therapeutics to combat gram positive spore forming bacteria. J. Appl. Microbiol. 2015; 119 (3): 620-31.
19. Stewart C.R., Casjens S.R., Cresawn S.G., Houtz J.M., Smith A.L., Ford M.E. et al. The genome of Bacillus subtilis bacteriophage SPO1. J. Mol. Biol. 2009; 388 (1): 48-70. DOI:10.1016/j.jmb.2009.03.009.
20. Grose J.H., Jensen G.L., Burnett S.H., Breakwell D.P. Genomic comparison of 93 Bacillus phages reveals 12 clusters, 14 singletons and remarkable diversity. BMC Genom. 2014; 15 (1): 855. DOI: 10.1186/1471-2164-15-855.
21. Sozhamannan S., McKinstry M., Lentz S.M., Jalasvuori M., McAfee F., Smith A., Dabbs J. et al. Molecular characterization of a variant of Bacillus anthracis-specific phage AP50 with improved bacteriolytic activity. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74 (21): 6792-6. DOI: 10.1128/AEM.01124-08.
22. Golomidova A.K., Kulikov E.E., Prokhorov N.S., Guerrero-Ferreira R.C., Ksenzenko V.N., Tarasyan K.K., Letarov A.V. Complete genome sequences of T5-related Escherichia coli bacteriophages DT57C and DT571/2 isolated from horse feces. Arch. Virol. 2015; 160 (12): 3133-7. DOI: 10.1007/s00705-015-2582-0.
23. Shakh Makhmud R., Garifulina K.I., Nikitina E.V., Il'inskaya O.N. Isolation of bacterial viruses from natural ecological nishes of Tatarstan Republic. Vestnik Kazanskogo tekhnologicheskogo universiteta. 2013; 16 (10): 173-8. (in Russian)
24. Massardo D.R., Borrelli G.M., Di Fonzo N., Alifano P., Del Giudice L. An efficient method for preparing high quality DNA from plant DNA libraries in lambda phage. Biotech. Let. 2002; 24 (14): 1199202.
25. Makarov A.A., Ilinskaya O.N. Cytotoxic ribonucleases: molecular weapons and their targets. FEBSLett. 2003; 540 (1-3): 15-20.
26. Ulyanova V., Vershinina V., Ilinskaya O. Barnase and binase: twins with distinct fates. FEBS J. 2011; 278 (19): 3633-43.
27. Shah Mahmud R., Ulyanova V., Malanin S., Dudkina E., Vershinina V., Ilinskaya O. Draft whole-genome sequence of Bacillus altitudinis strain B-388, a producer of extracellular RNase. Genome Announc. 2015; 3 (1): e01502-14. D0I:10.1128/genomeA.01502-14.
28. Seed K.D., Lazinski D.W., Calderwood S.B., Camilli A. A bacterio-phage encodes its own CRISPR/Cas adaptive response to evade host innate immunity. Nature. 2013; 494 (7438): 489-91.
29. Ilinskaya O.N., Shah Mahmud R. Ribonucleases as antiviral agents. Molecul. Biol. (Moscow). 2014; 48 (5): 615-23.
30. Alekseeva I.I., Kurinenko B.M., Kleyner G.I., Skuya A.Zh., Pen-zikova G.A., Oreshina M.G. Comparative study of the antiviral activity of pancreatic and microbial RNAse. Antibiotiki. 1981; 26 (7): 527-32. (in Russian)
Поступила 28.11.16
Shah Mahmud R, Garifulina K.I., Ulyanova V.V., Evtugyn V.G., Mindubaeva L.N., Khazieva L.R., Dudkina E.V., Vershinina V.I., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N.
BACTERIOPHAGES OF SOIL BACILLI: NEW MULTIVALENT PHAGE OF BACILLUS ALTITUDINIS
Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, 420008, Kazan, Russian Federation
Bacillus bacteria are soil saprophytes, facultative anaerobes that develop in the temperature range of 28-37°С. 16S rRNA cataloging shows that these bacteria form a coherent class with broad variability of virulence. Bacillus phages can be extensively used for phagotyping bacteria in the process of soil, water, and food monitoring. Bacillus phages can also be used as vectors in horizontal
gene transfer and potential therapeutic agents. Thus, description of the biological diversity of the Bacillus phages can prove useful for further development of tools used in molecular biology and bio-medicine. In this work, the scheme for isolation of soil bacteriophages was unified, which allowed 10 bacillus phages to be isolated from different types of soil. It was shown that the number of phages depended on the soil fertility, decreasing as the soil changes from black earth to brown earth to gray forest soil to uncontaminated urban soil to oil-contaminated urban soil. A new polyvalent DNA-containing bacteriophage SRT01hs of B. altitudinis (it is also able to infect B. subtilis, B. cereus, B. pumilus, but not B. licheniformis and B. atrophaeus) was described in detail. It has a typical structure: total length, 360 nm; icosahedrons-shaped head, 100 nm in diameter. Several phages simultaneously attack a B. altitudinis cell by increasing the level of intracellular low-molecular RNA. Infection with the phage virtually eliminates the stationary growth phase of infected bacilli and leads to a permanent increase in the number of phages in cultural liquor, with the exception of the time period of high activity of the secreted ribonuclease.
Key words: soil phages, Bacillus, B. altitudinis, bacteriophage of B. altitudinis, intracellular RNA, secreted ribonuclease
For citation: Shah Mahmud R., Garifulina K.I., Ulyanova V.V., Evtugyn V.G., Mindubaeva L.N., Khazieva L.R., Dudkina E.V., Vershinina V.I., Kolpakov A.I., Ilinskaya O.N. Bacteriophages Of Soil Bacilli: New Multivalent Phage of Bacillus altitudinis. Molekulyar-naya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology 2017; 35(2):59-64. (Russian). DOI 10.18821/0208-0613-2017-35-2-59-64.
For correspondence: Raihan Shah Mahmud, Institute of Fundamental Medicine and Biology, Kazan (Volga Region) Federal University, 420008, Kazan, Russian Federation; E-mail: raihan.shah@gmail. com
Acknowledgments. This work was performed within the framework of the Program of Competitive Growth of Kazan Federal University and partially supported by the Russian Science Foundation Grant No. 14-14-00522 (research into the interaction between bacteriophages and bacteria). Isolation and characterization of bacteriophages was performed within the framework of studies supported by the Russian Foundation for Basic Research Grant No. 15-04-07864 using the equipment of the Interdisciplinary Center for Collective Use of the Kazan Federal University.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017 УДК 579.843.1:579.222]:577.21.08
Заднова С.П., Челдышова Н.Б., Крицкий А.А., Адамов А.К., Девдариани З.Л., Кутырев В.В.
сравнительный анализ метаболизма глюкозы в штаммах VIBRIO
CHOLERAE БИОВАРА эль ТОР
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб"», 4100005, Саратов
Проведен сравнительный анализ ферментации глюкозы у типичных штаммов V. Ло1егае биовара Эль Тор, выделенных в Российской Федерации в 1970-1990 гг., и высоко вирулентных штаммов геновариантов, завезенных в 1993-2012 гг. Показано, что у геновариантов V. Ло1егае биовара Эль Тор с приобретением профага СТХ классического типа (или только его гена ахБ) и повышением вирулентности изменился метаболизм глюкозы, что фенотипически выражается в отсутствии роста на минимальной среде с добавлением 1 % углевода и сниженной способности к его ферментации до ацетоина в реакции Фогеса-Проскауэра. Возможные причины сниженного метаболизма глюкозы связаны с присутствием SNP в гене а№, кодирующем фермент ацето-
Для корреспонденции: Заднова Светлана Петровна - д-р биол. наук, вед. науч. сотр. ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», 410005, г. Саратов, ул. Университетская, д. 46; E-mail: [email protected]
лактат декарбоксилазу и входящим в als оперон, участвующим в образовании ацетоина, а также с увеличенной экспрессией регу-ляторного белка AphA, контролирующего биосинтез ацетоина. Ключевые слова: Vibrio cholerae; геноварианты; метаболизм глюкозы; образование ацетоина; экспрессия генов.
Для цитирования: Заднова С.П., Челдышова Н.Б., Крицкий A.A., Адамов А.К., Девдариани З.Л., Кутырев В.В. Сравнительный анализ метаболизма глюкозы в штаммах Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017; 35 (2): 64-69. DOI 10.18821/0208-0613-2017-352-64-69.
Начиная с 1961 г. и по настоящее время продолжается 7-я пандемия холеры, самая длительная (55 лет) из всех известных, вызванная типичными токсигенными штаммами Vibrio cholerae О1 серогруппы Эль Тор био-
