Бактерии рода Bacillus, выделенные из почв района солеразработок Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2008 Биология Вып. 9(25)

УДК 579.222:579.851.11

БАКТЕРИИ РОДА BACILLUS, ВЫДЕЛЕННЫЕ ИЗ ПОЧВ РАЙОНА СОЛЕРАЗРАБОТОК

О. В. Ястребоваa, Л. Н. Ананьинаa, Е. Г. Плотниковаa,b

a Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13

b Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Из почв района солеразработок (г. Березники, Пермский край) методом накопительных культур выделено семь штаммов бактерий рода Bacillus. По результатам анализа REP- и BOX-ПЦР большинство выделенных штаммов входят в одну геномогруппу (I), штаммы SN501, И10Ь и И12Ь различаются между собой по REP- и BOX-ДНК профилям и выделены в три геномогруп-пы (II, III и IV, соответственно). Принадлежность штаммов SN501, И10Ь и И12Ь к разным ге-номогруппам подтверждена результатами рестрикционного анализа амплифицированных ри-босомальных ДНК (ARDRA). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что штаммы И12Ь, И23 и И27 являются представителями рода Bacillus, штамм И10Ь принадлежит к роду Paenibacillus. Большинство штаммов растет при 9-11% NaCl в среде культивирования и в щелочных условиях (pH 7.0-9.0). Штамм Bacillus sp. SN501 растет на нафталине как единственном источнике углерода и энергии при концентрации NaCl 5%.

Введение

Бактерии рода Bacillus представлены грампо-ложительными, аэробными, каталазоположитель-ными, палочковидными клетками, образующими овальные эндоспоры, высокоустойчивые ко многим неблагоприятным воздействиям. Бактерии данного рода широко распространены в почвенных, водных экосистемах и варьируют по физиологическим свойствам. Ряд галофильных и алка-лофильных штаммов рода Bacillus выделен из соленых и содовых озер (Nielsen et al., 1995; Vargas et al., 2005; Lim et al., 2006); термофильные штаммы Bacillus thermophleovorans (Annweiler et al., 2000) и Bacillus sp. JF8 (Shimura et al., 1999) изолированы при 60°C с использованием нафталина в качестве субстрата. Из нефтезагрязненных почв и донных отложений выделен ряд штаммов Bacillus spp., использующих фенантрен (Doddamani, Nin-nekar, 2000) и дизельное топливо в качестве единственного источника углерода (Stapleton et al., 2000). Данная группа бактерий представляет интерес в связи с высоким биотехнологическим потенциалом для получения осмопротектерных соединений, термостабильных и гидролитических ферментов; создания препаратов для очистки почв и стоков со сложным, полихимическим характером загрязнения (Margesin, Schinner, 2001; Zhuang et al., 2002).

Цель работы - характеристика бактерий рода Bacillus, выделенных из засоленных почв.

Методы исследования

Бактериальные культуры. В работе использованы бактериальные штаммы, выделенные из почв и донных отложений, загрязненных отходами соледобывающего предприятия БКРУ-1 г. Березники (Пермский край), обозначенные SN501, И10Ь, И12Ь, И23, И26, И27, И28.

Среды и условия культивирования. Бактерии выращивались в минеральной среде Раймонда (Розанова, Назина, 1982) с разным содержанием хлорида натрия (от 3 до 20%). В качестве полноценной среды использовали среду Раймонда при добавлении триптона (5 г/л) и дрожжевого экстракта (2.5 г/л). При культивировании в жидкой минеральной среде нафталин, фенантрен, гентизат и орто-фталат использовали как субстраты в концентрации 1 г/л, салицилат - в концентрации 0.5 г/л. При выращивании бактерий на агаризованной среде нафталин, фенол, жидкие алифатические углеводороды (октан, декан, пентадекан) и дизельное топливо добавляли на крышку перевернутой чашки Петри. Культивирование проводили при температуре 28°С.

Изучение физиологических свойств бактерий. Устойчивость к №С1 (3, 5, 7, 9, 10, 11, 13, 17, 20%) определяли на полноценной агаризованной минеральной среде Раймонда. Рост учитывали на 7-й день.

Рост при разных значениях рН определяли при концентрации №+ 0.8-0.85 М в буферных системах (для рН 5 - ацетатный буфер, для рН 7-8 -

© О. В. Ястребова, Л. Н. Ананьина, Е. Г. Плотникова, 2008

58

фосфатный буфер, для рН 9-10 - трис-HCl буфер) (Методы общей бактериологии, 1983), приготовленных на основе минеральной среды Раймонда, содержащей глюкозу в качестве источника углерода и энергии. Штаммы культивировались на агаризованной среде при рН 5, 7, 8, 9, 10. Рост учитывали на 7-й день.

Идентификация бактерий. Культуральные, морфологические и биохимические свойства изучали согласно руководств «Определитель бактерий Берджи» (1997) и «Методы общей бактериологии» (1983). Морфологию и жизненный цикл бактерий изучали у выращенных на агаризованной среде 12-72-часовых культур с использованием световой микроскопии (фазововый контраст).

Амплификация гена 16S рРНК. Для амплификации использовали бактериальные праймеры 27F и 1492R. Амплификацию проводили так, как описано у Е.Ю. Гавриш с соавт. (2004).

Определение нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. Секвенирование гена 16S рРНК, амплифицированного с использованием универсальных бактериальных праймеров (Гавриш и др., 2004), проводили с применением набора реактивов CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе MegaBASE 1000 (JSC GE Healthcare, США).

Филогенетический анализ. При предварительном анализе нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК использовали программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Далее нуклеотидную последовательность 16S рДНК изучаемого изолята сравнивали с нуклеотидными последовательностями типовых штаммов близкородственных видов с помощью программы CLUSTAL W (Thompson et al., 1994) и корректировали вручную. Эволюционное расстояние, выраженное как число замен на 100 нуклеотидов, рассчитывали согласно Jukes, Cantor (1969). Построение филогенетического древа производили с помощью пакета программ TREECON (van de Peer, DeWachter, 1994) c использованием метода «neighbor-joining» (NEIGHBOR). Статистическую достоверность ветвления («bootstrap-анализ») оценивали с использованием соответствующей функции программы TREECON на основе 1000 альтернативных деревьев.

REP-ПЦР (полимеразная цепная реакция повторяющихся экстрагенетических палиндромных последовательностей ДНК) и BOX-ПЦР (полимеразная цепная реакция повторяющихся Box-элементов) проводили по методу J. Versalovic et al. (1994). Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1.5% агарозном геле, приготовленном на 1 х ТВЕ буфере (Маниатис и др., 1984).

Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции. 5 мкл ПЦР продукта 16S рДНК были обрабо-

таны 1 ед. рестрикционных ферментов HhaI, MseI, HaeIII (Fermentas, Литва) с использованием для каждой эндонуклеазы рекомендованного буфера и при соответствующем температурном режиме (Scortichini et al., 2002). Фрагменты рестрикции разделяли электрофорезом в 1.2% агарозном геле.

Результаты и их обсуждение

При использовании метода накопительных культур из почв, загрязненных отходами химических и соледобывающего производств (г. Березники, Пермский край), выделен ряд штаммов грамположительных бактерий, способных к деструкции различных алифатических и ароматических углеводородов (Плотникова и др., 2001; Плотникова и др., 2007).

Семь штаммов были идентифицированы как представители рода Bacillus. Данные штаммы имели круглые, гладкие, непрозрачные колонии бледно-желтого цвета. Клетки штаммов - грампо-ложительные, аэробные палочки, каталазоположи-тельные, оксидазоотрицательные. Образуют округлые, расположенные на концах клеток споры.

Проведена сравнительная характеристика исследуемых штаммов с использованием методов REP-ПЦР и BOX-ПЦР (рис. 1, 2). Анализ полученных профилей фрагментов ДНК выявил, что штаммы И23, И26 и И27 входят в одну геномо-группу (I группа). Штаммы SN501, И10Ь и И12Ь не входят в данную геномогруппу, различаются между собой по REP- и BOX-ДНК профилям, они выделены в три геномогруппы (II, III и IV группы соответственно) (рис. 1, 2).

1 2 3 4 З 1 2 3 4 З

I II

Рис. 1. Электрофореграмма продуктов REP-ПЦР штаммов Bacillus spp.:

I: 1- маркер 1/HindIII; 2 - SN5G1; 3 - ИЮ^

4 - И12Ь; З - отрицательный контроль;

II: 1 - маркер УНіпШ; 2 - И2З; 3 - И26;

4 - И27; З - отрицательный контроль

Результаты рестрикционного анализа ампли-фицированных рибосомальных ДНК (ARDRA) с использованием рестриктаз MboI, HhaI и MseI подтвердили принадлежность штаммов SN5G1, Ишь и И12Ь к разным геномогруппам (рис. З).

1 2 3 4 З 6 7 8

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов BOX-ПЦР штаммов Bacillus spp.:

1 - маркер ШЫШ; 2, 3 - SN5G1; 4, З - ИЮЬ; 6, 7 -И12Ь; 8 - отрицательный контроль

У штаммов И10Ь, И12Ь, И23 и И27 определены нуклеотидные последовательности 16S рДНК. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК показал, что штаммы И12Ь, И23 и И27 являются представителями рода Bacillus. На филогенетическом древе изоляты по-

1 2 3 4 З 6 7 8 9 10 11

Рис. З. Электрофореграмма гидролиза ПЦР-продуктов амплификации 16s рДНК, обработанных эндонуклеазами рестрикции MboI (2 - 4), HhaI (З - 7), MseI (8 - 10):

1 - маркер длин фрагментов pUCl9 DNA/MspI; 2, З, 8 -штамм SN5G1; 3, 6, 9 - штамм ИЮЬ; 4, 7, 10 - штамм И12Ь; 11 - маркер длин фрагментов lkb DNA Ladder (Life Technologies, США)

падают в разные 16s рДНК-группы бацилл (Ash et al., 1991): штаммы И2З и И27 группируются с представителями 1-й группы, а штамм И12Ь образует кластер с видами б-й группы (рис. 4).

58

100

100

100

100

99

100

97

84

99

- Bacillus mojavensis IF015718 (AB021191)

Bacillus subtiHs DSM10T (AJ276351)

Bacillus tequilensis 10bT (AY197613)

Bacillus subtiUs srtsp. spizizenii NRRL B-23049T (AF074970) BacHus valMstnorHs DSM11031T (AB021198)

L Baciilus amyloliquefadens ATCC 23350T (X60605)

- Bacillus atrophaeus JCM9070T (AB021181)

00 r~ Bacillus sonorensis NRRL B-23154T (EU138473)

«3^ Bacillus aerus 24KT (AJ831843)

I Bacillus lichemformis DSM 13T (X68416)

Bacillus aerophus 28KT (AJ831844)

Baciilus stratosphericus 41KF2aT (AJ831841)

Bacillus aliiiudims 41KF2bT (AJ831842)

Bacillus safensis F0-036bT (AF234854)

Bacilluspumius DSMZ27T (AY456263)

И23 И27

Bacillus idriensis SMC 4352-2T (AY904033) г Bacillus indicus Sd/3T (AJ583158)

""!■ Bacillus cibi JG-30T (AY550276)

Bacillus decoloraionis LMG 19507T (AJ315075)

Bacillus taeanensis BH030017T (AY603978)

BaciUus algicola KMM 3737T (AY228462)

И12Ь

- Bacillus hwajinpoensis SW-72T (AF541966)

Paenibaciilus macquariensis DSM 2T (AB073193)

Paenibacillus antarcticus LMG 22078T (AJ605292)

Paenibadlus xylaniyticus XIL14T (AY427832)

Paenibacilus ilinoisensis JCM 9907T (AB073192)

Paet^jadHu^ bardnonensis BP-23T (AJ716019)

100

- PaembadUuspabuli JCM 9074T (AB073191)

И10Ь

1 PaembadUus anylofyticm NBRC 15957T (AB363743)

1---------------------------AHcydtibacUlUs addocaldarius NBRC 15652T (AB271754)

Рис. 4. Филогенетическое древо, построенное с использованием метода «neighbor-joining», основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рДНК видов родов Bacillus и Paenibacillus, близкородственных исследуемым штаммам. Масштаб соответствует 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap»-анализа 1000 альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%)

Максимальный уровень 16S рДНК сходства, видами Bacilluspumilus и Bacillus safensis, а изолят

составляющий 99.5%, штаммы И23 и И27 имеют с И12Ь - с видом Bacillus hwajinpoensis. На данном

этапе работы штаммы идентифицированы как Bacillus spp.

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК штамма И10Ь выявил принадлежность его к роду Paenibacillus, который был предложен для объединения видов, относящихся к 3-й 16S рДНК-группе рода Bacillus (Ash et al., 1994). Наибольший уровень сходства (98%) изолят имеет с Paenibacillus amylolyticus. Штамм идентифицирован как Paenibacillus sp.

Исследована способность выделенных штаммов к росту на различных ароматических и алифатических углеводородах. Установлено, что штаммы И10Ь и И12Ь используют дизельное топливо, нафталин и декан в качестве субстрата. Штаммы И23, И26, И27 и И28 растут на дизельном топливе и пентадекане. Штамм SN501 способен к росту на нафталине, фенантрене, салицилате, орто-фталате, а также на феноле и октане.

Установлено, что оптимальными для роста выделенных штаммов являются температуры в диапазоне 24-28°С. Большинство штаммов хорошо растет при щелочных значениях рН (до 9.0) среды культивирования, а штамм И23 - при pH 7.0-10.0. Изоляты способны к росту в полноценной среде в условиях повышенных концентраций хлорида натрия: до 9% - штаммы SN501, И10Ь, И12Ь, И23, И27 и до 11% - штаммы И26, И28. Штамм SN501 растет на нафталине при концентрации NaCl в среде культивирования - до 5%.

Работа поддержана грантами РФФИ-Урал №07-04-96078_а и РФФИ-Урал №07-04-97625_офи.

Библиографический список

Гавриш, Е.Ю. Три новых вида бревибактерий - Bre-vibacterium antiguum sp. nov., Brevibacterium au-rantiacum sp. nov. и Brevibacterium permense sp. nov. / Е.Ю. Гавриш, В.И. Краузова, Н.В. Поте-хина, С.Г. Карасев, Е.Г. Плотникова, О.В. Ал-тынцева, Л.А. Коростелева, Л.И. Евтушенко // Микробиология. 2004. Т. 73, № 2. С. 218-225. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж.Сэмбрук // Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 390с. Методы общей бактериологии / пер. с англ.; под ред. Ф. Герхардт и др. Т. 1-3. М.: Мир, 1983. Определитель бактерий Берджи / пер. с англ.; под ред. Дж. Хоулта и др. Т. 1, 2. М.: Мир, 1997. Плотникова, Е.Г. Бактерии-деструкторы полицик-лических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок / Е.Г. Плотникова, О.В. Алтын-цева, И.А. Кошелева, И.Ф. Пунтус, А.Е. Филонов, Е.Ю. Гавриш, В.А. Демаков, А.М. Боронин // Микробиология. 2001. Т. 70, № 1. С. 61-69. Плотникова, Е.Г. Разнообразие и функционирование микроорганизмов из техногенных почв рай-

она солеразработок Верхнекамья / Е.Г. Плотникова, Л.Н. Ананьина, О.В. Ястребова, Д.О. Рыбкина // Биотехнология: состояние и перспективы развития: материалы конгресса. Ч. 2. М., 2007. С. 135.

Розанова, Е.П. Углеводородокисляющие бактерии и их активность в нефтяных пластах / Е.П. Розанова, Т.Н. Назина // Микробиология. 1982. Т. 51. С. 324-348.

Annweiler, E. Naphthalene degradation and incorporation of naphthalene-derived carbon into biomass by the thermophile Bacillus thermoleovorans / E. Annweiler, H.H. Richnow, G. Antranikian, S. He-benbrok, C. Garms, S. Franke, W. Francke, W. Mi-chaelis // Appl. Environ. Microbiol. 2000. Vol. 66. P. 518-523.

Ash, C. Phylogenetic heterogeneity of the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small subunit - ribosomal RNA sequences / C. Ash, J.A.E. Farrow, S. Wallbanks, M.D. Collins // Lett. Appl. Microbiol. Vol. 13. P. 202-206.

Ash, C. Molecular identification of rRNA group 3 bacilli (Ash, Farrow, Wallbanks and Collins) using a PCR probe test / C. Ash, F.G. Priest, M.D. Collins // Antonie van Leeuwenhoek. 1993. Vol. 64. P. 253-260.

Doddamani, H.P. Biodegradation of phenanthrene by a Bacillus species / H.P. Doddamani, H.Z. Ninne-kar // Curr. Microbiol. 2000. Vol. 41. P. 11-14. Jukes, T.H. Evolution of protein molecules / T.H. Jukes,

C.R. Cantor // Mamallian protein metabolism / Ed. H.N. Munro New York: Academic press. 1969. P. 21-132.

Lim, J.-M. Bacillus salarius sp. nov., a halophilic, spore-forming bacterium, isolated from a salt lake in China / J.-M. Lim, C.O. Jeon, S.-M. Lee, J.-C. Lee, L.-H. Xu, C.-L. Jiang, C.-J. Kim // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. Vol. 56. P. 373-377.

Margesin, R. Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology / R. Margesin, F. Schinner // Extremophiles. 2001. Vol. 5. P. 73-83. Nielsen, P. Phenetic diversity of alkaliphilic Bacillus strains; proposal for nine new species / P. Nielsen,

D. Fritze, F.G. Priest // Microbiology. 1995. Vol. 141. P. 1745-1761.

Scortichini, М. Bacteria associated with hazelnut (Cory-lus avellana L.) decline are of two groups: Pseudomonas avellanae and strains resembling P. syringae pv. syringae / М. Scortichini, U. Marchesi, M.-P. Rossi, P.D. Prospero // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 476-484.

Shimura, M. Isolation and characterization of a thermophilic Bacillus sp. JF8 capable of degrading polychlorinated biphenyls and naphthalene / M. Shimura, G. Mukeijee-Dhar, K. Kimbara, H. Nagato, H. Ki-ohara, T. Hatta // FEMS Microbiol. Lett. 1999. Vol. 178. P. 87-93.

Stapleton, R.D. Catabolic and genetic diversity of de-gradative bacteria from fuel-hydrocarbon contami-

nated aquifers / R.D. Stapleton, N.G. Bright, G.S. Sayler // Microb. Ecol. 2000. Vol. 39. P. 211-221. Thompson, J.D. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice / J.D. Thompson, D.G. Higgins, T.J. Gibson // Nucleic Acids Res. 1994. Vol. 22. P. 4673-4680. van de Peer, Y. TREECON for Windows a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. van de Peer, R. DeWachter // Comput. Appl. Biosci. 1994. Vol. 10. P. 569-570.

Vargas, A. V. Bacillus bogoriensis sp. nov., a novel al-kalophilic, halotolerant bacterium isolated from Ke-

nyan soda lake / A.V. Vargas, O.D. Delgado, R. Hatti-Kaul, B. Mattiasson // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. Vol. 55. P. 899-902.

Versalovic, J. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction / J. Versalovic, M. Schneider, F.J. de Bruin, J.R. Lupski // Meth. Mol. Cell. Biol. 1994. Vol. 5. P. 25-40.

Zhuang, W.Q. Bacillus naphthalinovorans sp. nov. from oil-contaminated tropical marine sediments and its role in naphthalene biodegradation / W.Q. Zhuang, J.-H. Tay, A.M. Maszenan, S.T.L. Tay // Appl. Microbiol. Biotechnol 2002. Vol.58. P. 547553.

Поступила в редакцию 10.04.2008

Bacteria of the genus Bacillus isolated from soils in the area of salt mining

O.V. Yastrebova, L.N. Ananyina, E.G. Plotnikova

Using method of enrichment culture seven bacterial strains of genus Bacillus have been isolated from soils in the area of salt mining. The analysis of REP- and BOX-PCR showed that the majority of the isolated strains formed one genomic group (I), strains SN501, I10b and I12b differed between each other in the REP- and BOX-DNA profiles and formed three genomic groups (II, III and IV respectively). Strains SN501, I10b and I12b distinguished among each other in the ARDRA profiles and represented different genomic groups. Phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences indicated that strains I12b, I23 and I27 belonged to the genus Bacillus, strain I10b belonged to the genus Paenibacillus. The majority of the strains grew at 9-11% NaCl in cultural medium and under the alkaline conditions (pH 7.0-9.0). The strain Bacillus sp. SN501 grew on naphthalene as the sole source of carbon and energy at 5% of NaCl.