CC BY
18
АУТОРЕГУЛЯЦИЯ И AYTOMHrM6MROBAHME OCHOBHMX ИЗOФORM NO-СИНТАЗ (КРАТКИЙ O63OR)
DOI: 10.17691/stm2023.15.3.06 УДК 612:661.982 Поступила 18.02.2023 г.
Н.А. Попова, научный сотрудник лаборатории клинической и экспериментальной биофизики1; научный сотрудник лаборатории химического и биотехнологического синтеза2; С.К. Соодаева, д.м.н., зав. лабораторией клинической и экспериментальной биофизики1; ведущий научный сотрудник лаборатории химического и биотехнологического синтеза2; И.А. Климанов, к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории клинической и экспериментальной биофизики1; В.М. Мишарин, к.м.н., ВРИО директора института1;
А.А. Темнов, д.м.н., зав. лабораторией химического и биотехнологического синтеза2
Научно-исследовательский институт пульмонологии ФМБА России, Ореховый бульвар, 28, Москва, 115682;
2Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет), Институтский переулок, 9, Долгопрудный, Московская область, 141701
Оксид азота (II) NO является важнейшим медиатором широкого спектра физиологических и патофизиологических процессов. Он синтезируется NO-синтазами (NOS), у которых выделяются три основные изоформы, отличающиеся друг от друга особенностями активации и ингибирования, уровнями продукции NO, субклеточной локализацией и т.д. При этом структурно все изоформы очень схожи, а указанные различия определяются ауторегуляторными элементами NOS.
Представлен анализ ауторегуляторных и аутоингибиторных механизмов редуктазного домена NOS, определяющих различия в продуктивности изоформ, а также их зависимости от концентрации ионов Ca2+. К основным регуляторным элементам в NOS, модулирующим перенос электронов от флавина к гему, относят кальмодулин ^M), аутоингибиторную вставку (AI) и С-концевой хвост (C-tail). Предполагается, что гидрофобные взаимодействия СаМ с поверхностью оксидазного домена NOS способствуют переносу электрона от флавинмононуклеотида (FMN). Связывание СаМ вызывает изменение междоменных расстояний, сдвиг AI, C-tail и, как следствие, уменьшение их ингибирующего влияния. Также СаМ сдвигает конформационное равновесие редуктазного домена в сторону более открытых конформаций, уменьшает время жизни конформаций, их стереометрическое распределение и ускоряет поток электронов через редуктазный домен. AI, по всей видимости, индуцирует конформационное изменение, которое препятствует переносу электронов внутри редуктазного домена по аналогии с шарнирным доменом в цитохроме Р450. C-tail совместно с СаМ регулируют поток электронов между флавинами, расстояние и относительную ориентацию изоаллоксановых колец, а также модулируют поток электронов от FMN к терминальному акцептору. Также AI совместно с C-tail предопределяют зависимость ней-рональной и эндотелиальной форм NOS от концентрации ионов Ca2+, а длина C-tail влияет на различия в продуктивности синтеза NO. Ингибирующее влияние C-tail, по всей вероятности, снижается при связывании CaM из-за сдвига C-tail за счет сил электростатического отталкивания отрицательно заряженных остатков фосфата и аспартата. Ауторегуляторные элементы NOS требуют дальнейшего изучения, поскольку механизмы их взаимодействия имеют сложный и разнонаправленный характер, благодаря которому обеспечивается широкий диапазон характеристик наблюдаемых изоформ.
Ключевые слова: оксид азота; NO-синтаза; моделирование NOS; ауторегуляция NOS; аутоингибиторная вставка; кальмодулин; С-концевой хвост; перенос электронов в NOS.
Как цитировать: Popova N.A., Soodaeva S.K., Klimanov I.A., Misharin V.M., Temnov A.A. Autoregulation and autoinhibition of the main NO synthase isoforms (brief review). Sovremennye tehnologii v medicine 2023; 15(3): 53, https://doi.org/10.17691/stm2023.15.3.06
Для контактов: Попова Наталия Алексеевна, e-mail: [email protected]
Autoregulation and Autoinhibition
of the Main NO Synthase Isoforms (Brief Review)
N.A. Popova, Researcher, Laboratory of Clinical and Experimental Biophysics1; Researcher,
Laboratory of Chemical and Biotechnological Synthesis2;
S.K. Soodaeva, MD, DSc, Head of Laboratory of Clinical and Experimental Biophysics1;
Leading Researcher, Laboratory of Chemical and Biotechnological Synthesis2;
I.A. Klimanov, MD, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Clinical and Experimental Biophysics1;
V.M. Misharin, MD, PhD, Acting Director of the Institute1;
A.A. Temnov, MD, DSc, Head of Laboratory of Chemical and Biotechnological Synthesis2
1Pulmonology Research Institute, Federal Medical and Biological Agency of Russia,
28 Orekhovy Boulevard, Moscow, 115682, Russia;
2Moscow Institute of Physics and Technology (National Research University), 9 Institutskiy Per.,
Dolgoprudny, Moscow Region, 141701, Russia
Nitric oxide (II) (NO) is the most important mediator of a wide range of physiological and pathophysiological processes. It is synthesized by NO synthases (NOSs), which have three main isoforms differing from each other in terms of activation and inhibition features, levels of NO production, subcellular localization, etc. At the same time, all isoforms are structurally very similar, and these differences are determined by NOS autoregulatory elements.
The article presents an analysis of the autoregulatory and autoinhibitory mechanisms of the NOS reductase domain that determine differences in the productivity of isoforms, as well as their dependence on the concentration of Ca2+ ions. The main regulatory elements in NOS that modulate the electron transfer from flavin to heme include calmodulin (CaM), an autoinhibitory insert (AI), and the C-terminal tail (C-tail). Hydrophobic interactions of CaM with the surface of the NOS oxidase domain are assumed to facilitate electron transfer from flavin mononucleotide (FMN). CaM binding causes a change in the inter-domain distances, a shift of AI and the C-tail, and, as a result, a decrease in their inhibitory effect. CaM also shifts the conformational equilibrium of the reductase domain towards more open conformations, reduces the lifetime of conformations, their stereometric distribution, and accelerates the flow of electrons through the reductase domain. The AI element, apparently, induces a conformational change that hinders electron transfer within the reductase domain, similar to the hinge domain in cytochrome P450. Together with CaM, the C-tail regulates the electron flow between flavins, the distance and relative orientation of isoalloxane rings, and also modulates the electron flow from FMN to the terminal acceptor. Together with the C-tail, AI also predetermines the dependence of neuronal and endothelial forms of NOS on the concentration of Ca2+ ions, and the C-tail length affects differences in the productivity of NO synthesis. The inhibitory effect of the C-tail is likely to be reduced by CaM binding due to the C-tail shift due to the electrostatic repulsive forces of the negatively charged phosphate and aspartate residues. The autoregulatory elements of NOS require further study, since the mechanisms of their interaction are complex and multidirectional, and hence provide a wide range of characteristics of the observed isoforms.
Key words: nitric oxide; NO synthase; NOS modeling; NOS autoregulation; autoinhibitory insert; calmodulin; C-tail; electron transfer to NOS.
English
Введение
Оксид азота (II) NO является важнейшим межклеточным медиатором широкого спектра физиологических и патофизиологических процессов. Так, он регулирует тонус, проницаемость и структуру сосудов, тонус гладких мышц внутренних органов, процессы воспаления и иммунного ответа, свободнорадикаль-ные процессы, вовлечен в патогенез большинства воспалительных заболеваний, может служить биологическим маркером воспаления и пр. [1-3].
NO-синтазы (NOS), образующие NO и представляющие собой ферментативную часть более общего цикла NO, являются цитохром-Р450-подобными ге-мопротеинами. Они окисляют L-аргинин (Arg) в двух-стадийном процессе, включающем в качестве промежуточного продукта L-гидроксиаргинин (NOHA).
В цикле катализа участвуют ряд кофакторов: нико-тинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH), фла-винадениндинуклеотид (FAD), флавинмононуклео-тид (FMN), тетрагидроптерин, кальмодулин (CaM) и т.д. [4-6].
Три основные изоформы NOS (nNOS, eNOS, iNOS) имеют ряд существенных различий: кодируются разными генами, отличаются субклеточной локализацией, продуцируемыми концентрациями NO, степенью зависимости от концентрации Ca2+. Несмотря на это, основные структурные элементы NOSs идентичны для всех изоформ [7-9] (рис. 1).
Как видно из рис. 1, димер оксигеназного домена в центре NOS содержит связывающие центры для те-трагидробиоптерина (BH4), гема и L-аргинина. К окси-геназному домену присоединен редуктазный, состоящий из NADPH, FAD и FMN. CaM при его связывании
//////////////////////^^^^
54 СТМ I 2023 I том 15 j №3 Н.А. Попова, С.К. Соодаева, И.А. Климанов, В.М. Мишарин, А.А. Темнов
Рис. 1. Структурная модель NOS [5, 7]
Рис. 2. Трехтактный цикл катализа NOS [10]
ферментом находится между FMN и оксигеназным доменом [5, 7, 9].
В предложенной нами ранее [10] структурной схеме трехтактной модели катализа NOS учитывается значительная разница в скорости восстановления комплекса гем^е(П)-02 электроном из редуктазного домена и коферментом BH4. Кинетическая предпочтительность второго пути позволила сделать предположение о работе BH4 по бинарной логике: восстановление комплекса гем^е(И)-02, окисление комплексов гем-Fe(II) и гем^е(И)^0. Получаемый в таком случае замкнутый цикл последовательного окисления и восстановления BH4 дает непротиворечивую картину его роли в катализе.
На рис. 2 представлен алгоритм трехтактного каталитического цикла NOS при физиологических
условиях, разработанный с целью последующего имитационного моделирования. Зеленым цветом выделена нормальная последовательность этапов катализа, в результате которой фермент синтезирует NO, серым цветом показаны патологические цепочки. Коричневым цветом выделена замкнутая цепь последовательных окислений и восстановлений кофермен-та BH4.
Каталитический цикл начинается с переноса первого электрона по электрон-транспортной цепи редуктаз-ного домена, затем — на гем трехвалентного железа (гем^е(Ш)). Согласно современным представлениям [4, 5], NADPH связывает молекулу, содержащую флавины FAD и FMN, восстанавливает FAD, затем электроны диспропорционируют между FAD и FMN. CaM связывает два иона Ca2+, после чего становится
способным присоединиться к соответствующему связывающему центру NOS, но этого недостаточно для инициации конформационных изменений фермента, позволяющих передать электрон от FMN на оксигеназ-ный домен к гему трехвалентного железа (гем-Fe(Ш)). Для указанной передачи необходимо, чтобы два оставшихся центра связывания CаM также заполнились ионами Ca2+.
Каждый такт трехтактного цикла катализа NOS запускается описанным процессом переноса электрона по электрон-транспортной цепи редуктазного домена и восстановлением гем-Fe(Ш) до гем-Fe(II). Такты нормального продуктивного цикла NOS указаны на рис. 2 зеленым цветом и соответствующими цифрами.
В первом такте reNi-Fe^II) восстанавливается первым электроном до гем—^П), который при достаточности кислорода окисляется до комплекса гем-Fe(II)-О2. Для того чтобы этот комплекс был способен прореагировать с субстратом, он активируется восстановленным после предыдущего каталитического цикла коферментом BH4 до гем—^Щ-О-. BH4 превращается при этом в радикал BH4+, а комплекс гем-Fe(II)-О- уже способен прореагировать с аргинином, превращая его в NOHA с выделением одной молекулы H2O и окислением гема до его первоначального состояния (гем-Fe(Ш)). На этом первый такт цикла заканчивается.
Второй такт является промежуточным и служит для восстановления кофермента BH4, окисленного в предыдущем такте. При этом второй электрон от редук-тазного домена сначала восстанавливает гем-Fe(Ш) до гем-Fe(II) по аналогии с первым тактом, а затем радикал BH4+ окисляет гем-Fe(II) до гем-Fe(Ш), таким образом восстанавливаясь для третьего такта цикла катализа.
В третьем такте по аналогии с первым тактом гем-Fe(III) восстанавливается до гем-Fe(II) третьим электроном от редуктазного домена, затем окисляется до комплекса гем-Fe(II)-О2, активируется тетрагидробио-птерином, восстановленным во втором такте, до гем-Fe(II)-О- и реагирует с NOHA, образуя цитруллин, молекулу H2O и комплекс гем-Fe(II)-NO, высвобождение NO из которого происходит крайне медленно. Радикал BH4+, образовавшийся после восстановления гем-Fe(II)-О2, немедленно окисляет гем-Fe(II)-NO до гем-Fe(Ш)-NO, который способен высвобождать NO значительно быстрее своей восстановленной формы. При этом восстановленный BH4 становится готовым для следующего цикла катализа.
Если оксид азота, высвободившийся из комплекса гем-Fe(Ш)-NO, успевает выйти из кармана фермента до момента прихода нового электрона, то каталитический цикл завершается продуктивно и фермент становится готовым к новому циклу. В противном случае новый электрон восстанавливает гем-Fe(Ш)-NO до гем-Fe(II)-NO, который при достаточности кислорода реагирует с ним, образуя NO-, а при недостаточности
кислорода фактически блокирует фермент из-за медленного высвобождения NO.
Необходимо отметить, что катализ NO лимитируется наиболее медленной стадией, а именно переносом электрона внутри редуктазного домена, а также с FMN на гем. Этот перенос необходим для восстановления гем^е^П) в начале каждого такта цикла. Соответственно регуляция скорости этого переноса отвечает за «производительность» NOS в нормальном каталитическом цикле, а регуляторные механизмы являются исключительно важными для понимания функционирования фермента. Мало того, в случае NOS именно ауторегуляторные механизмы переноса электрона в редуктазном домене определяют и объясняют разницу различных изоформ по продуктивности синтеза NO и по зависимости от концентрации ионов Ca2+.
Целью настоящего обзора является анализ результатов исследований основных ауторегуляторных механизмов редуктазного домена NOS, к которым относят кальмодулин (CaM), аутоингибиторную вставку (AI) и С-концевой хвост (C-tail). На сегодняшний день механизмы их функционирования недостаточно изучены, но имеющиеся данные позволяют сделать вывод о сложном, разнонаправленном алгоритме взаимодействия, который обеспечивает широкий диапазон характеристик наблюдаемых изоформ.
Материалы и методы
В качестве основного источника научных данных были выбраны поисковики https://scholar.google.ru/ и база PubMed (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/). Глубина поиска составила 33 года (с 1990 по 2023 г.), метод анализа данных — голографический. В качестве ключевых использовались следующие слова: "NOS", "NO synthase", "nitric-oxide synthase", "electron flow", "electron transfer", "regulation", "autoinhibition", "modulation by", "conformational control", "conformational dynamics", "C-tail", "C-terminus", "cytochrome С-reduction", "ferricyanide reduction", "autoinhibitory insert". Общее количество источников при сочетании ключевых слов [("NOS" OR "NO synthase" OR "nitric-oxide synthase") AND ("electron flow" OR "electron transfer") AND ("regulation" OR "autoinhibition" OR "conformational control" OR "modulation by" OR "conformational dynamics") AND ("C-tail" OR "C-terminus")] составило 3100 в https://scholar.google. ru/ при очень низкой релевантности (только 6 работ затрагивают исследуемую проблематику) и всего 11 в PubMed, из которых только 4 работы достаточно релевантны. При сочетании [("NOS" OR "NO synthase" OR "nitric-oxide synthase") AND ("regulation" OR "autoinhibition" OR "modulation by") AND ("C-tail" OR "C-terminus") AND ("cytochrome C-reduction" OR "ferricyanide reduction")] найдено 247 источников в https://scholar.google.ru/ с низкой релевантностью, а работ в базе PubMed не обнаружено. При этом в большинстве работ анализируется регуляторная роль
//////////////////////^^^^
56 СТМ | 2023 | том 15 j №3 Н.А. Попова, С.К. Соодаева, И.А. Климанов, В.М. Мишарин, А.А. Темнов
кальмодулина, тогда как другие ауторегуляторные элементы только упоминаются. Так, выявлено 3 работы, где количественно оценивалась регуляторная роль аутоингибиторной вставки и C-tail с использованием мутантных форм ферментов. Следует отметить, что это работы 1999-2001 гг., и они по ряду данных недостаточно согласуются друг с другом, а их дизайн в большей степени соответствует пилотным исследованиям.
Крайне малое количество высокорелевантных работ по указанной тематике свидетельствует о том, что механизмы ауторегуляции NO-синтаз на сегодняшний день являются малоизученной областью, объем существующих экспериментальных количественных оценок недостаточен для адекватного понимания работы ау-тоингибирующих и регуляторных элементов, а также для их моделирования.
Регуляторные функции кальмодулина и Ca2+
Ключевую роль в регуляции трансфера электронов в NOS играет белок кальмодулин. Когда два из четырех центров связывания CaM, обладающих более высокой аффинностью, заполняются Ca2+, CaM связывается с NOS, располагаясь, как принято считать, между FMN и гемом. Это инициирует конфор-мационные изменения, ускоряющие электронный трансфер внутри редуктазного домена: от NADPH в FAD, от FAD в FMN. После заполнения Ca2+ двух оставшихся свободных центров связывания CaM становится способным ускорять перенос электрона от FMN к гему [4].
Согласно имеющимся данным [4], механизмы снятия репрессии на ключевых этапах переноса электрона не связаны с изменением термодинамики реакций. Поскольку редуктазный домен может существовать в любых состояниях — от одно- до четырехэлектрон-ного восстановленного, как динамическая система открытых и закрытых конформаций, — основными механизмами регулирующего влияния СаМ предполагаются следующие:
сдвиг конформационного равновесия в сторону более открытых конформаций;
сокращение времен жизни конформаций и ускорение переходов между ними;
сужение стереометрических распределений кон-формаций;
ограничение степеней свободы внутри фермента, что направляет перемещения домена FMN в пространстве.
Вышеописанные механизмы, по всей вероятности, обусловлены способностью CaM формировать ионные связи и гидрофобные взаимодействия с оксидаз-ным доменом NOS, что помогает направлять стыковку домена FMN и формирует оптимальную «электронную тропу». СаМ, предположительно, также устраняет ин-гибирующее влияние AI на участок стыковки FMN с гемом [4, 11, 12].
В отсутствие СаМ nNOS практически не синтезирует NO (концентрации не определяются), а eNOS продуцирует NO на уровне 2,5% от уровня синтеза в присутствии СаМ. Заполнение ионами Са2+ центров связывания СаМ является фактически триггером переноса электронов на гем, по всей вероятности, за счет смещения ингибирующих регуляторных элементов: AI и C-tail. При этом iNOS в отличие от двух других изоформ не имеет AI и сразу экспрессируется с СаМ, что делает ее практически независимой от концентрации ионов Са2+ [11].
Регуляторные функции аутоингибиторной вставки
Основное отличие в строении трех главных изоформ NOS млекопитающих — наличие последовательности из 52-55 аминокислот в редуктазном домене nNOS и eNOS. Ключевые функции этой вставки, определенные с помощью химер NOS, полученных ее удалением, позволяют утверждать, что это аутоинги-биторный элемент. Кроме того, именно AI во многом определяет зависимость активности NOS от концентрации Са2+. Например, химерам eNOS с удаленной AI требуется в 7 раз меньшая концентрация Са2+ для активации (20 вместо 150 нМ) [13].
Ингибирующее влияние AI носит довольно сложный характер, который иллюстрируется несколькими параметрами [12, 13]:
1) общей восстановительной активностью редуктазного домена NOS, которую можно оценить по интенсивности восстановления цитохрома С (как искусственного акцептора электронов), присоединенного к FMN;
2) эффективностью переноса электрона от NADPH на FAD, оцениваемой по восстановлению феррициа-нида, присоединенного к FAD;
3) продуктивностью синтеза NO.
Для eNOS и nNOS связывание СаМ ускоряет восстановление цитохрома С (общую восстановительную активность редуктазного домена) примерно в 10 раз. Изначально такую же активность (и она сравнима с цитохромом Р450) имеет iNOS, так как экспрессируется с уже связанным СаМ. В случае мутантых nNOS, eNOS (с удаленной AI) редуктазная активность без СаМ усиливается радикально, в 1030 раз. В присутствии СаМ и при физиологических концентрациях солей калия, натрия и кальция редуктазная активность мутантных форм выше, чем у исходных, всего в 3 раза [13].
На восстановлении феррицианида, т.е. на переносе электронов с NADPH на FAD, влияние AI сказывается значительно слабее: в присутствии СаМ и при физиологических концентрациях солей эффективность мутантных форм всего в 2 раза превышает эффективность нормальных, а в отсутствие СаМ удаление AI дает рост эффективности в 3-6 раз. Удаление AI приводит также к заметному увеличению
максимального синтеза N0, особенно при физиологических концентрациях солей калия и натрия. Исходя из результатов экспериментов с мутантными формами конститутивных N0S с удаленной А1 можно сделать ряд предварительных выводов о принципах ее функционирования [13]:
1. А1 примерно в 7 раз повышает уровень Са2+, необходимый для связывания СаМ конститутивными N0S, что является одной из причин их значительно большей зависимости от Са2+.
2. А1 также увеличивает зависимость конститутивных N0S от Са2+ за счет того, что радикально (в 10-30 раз) снижает редуктазную активность N0S без связанного СаМ. В случае связанного СаМ А1 снижает эту активность значительно слабее (в 3 раза).
3. Кроме А1, по всей вероятности, существуют другие факторы, определяющие зависимость конститутивных N0S от Са2+, поскольку, несмотря на повышенную редуктазную активность ферментов без А1, для синтеза N0 им все равно требуется связывание СаМ. Кроме того, мутантные формы iN0S с добавленной А1 синтезируют N0 даже при концентрациях Са2+ значительно ниже пороговых.
4. Разные изоформы N0S при удалении А1 начинают показывать схожую редуктазную активность, причем у связанных с СаМ мутантных форм эта активность выше, чем у связанных с СаМ исходных форм.
5. Суммарное аутоингибирование N0S ослабляется при связывании СаМ и для мутантных форм с удаленной А1, и для нормальных исходных ферментов, причем связывание СаМ в большей степени усиливает редуктазную активность мутантных N0S с удаленной А1, чем исходных.
6. Предположительно самая низкая продуктивность eN0S по сравнению с другими изоформами объясняется ее наиболее эффективной А1, которая продолжает частично ингибировать активность фермента даже при связанном СаМ и достаточности Са2+. В случае nN0S ингибирующий эффект А1 на редук-тазную активность полностью компенсируется связыванием СаМ и достаточностью Са2+. Это подтвержда-
Рис. 3. Базовая аминокислотная последовательность (основание хвоста, выделено прямоугольником) и С-концевые аминокислотные последовательности (отсутствуют в цитохром-Р450-редуктазе) для мышиной iNOS, крысиной nNOS, коровьей eNOS, а также NOS фруктовой мушки и бабочки бражника [15]
ется тем, что при удалении AI редуктазная активность мутантной eNOS сравнивается с таковой для мутант-ной nNOS.
Имеющиеся данные пока не позволяют делать выводы о механизмах влияния AI на редуктазную активность NOS. AI может стереометрически мешать цитохрому С и феррицианиду контактировать с ре-дуктазным доменом, а также может индуцировать конформационное изменение, которое препятствует переносу электронов внутри редуктазного домена по аналогии с шарнирным доменом в цитохроме Р450, который улучшает перенос электронов между флави-нами [12, 14].
Регуляторные функции С-концевого хвоста
В отличие от цитохром-Р450-редуктазы все изо-формы NOS на С-конце имеют удлинение из 20-40 аминокислот, причем базовая последовательность из восьми аминокислот С-конца (основание хвоста) оказалась абсолютно идентичной для мышиной iNOS, крысиной nNOS, коровьей eNOS, а также NOS фруктовой мушки и бабочки бражника, а удлинения (непосредственно хвост — C-tail) имеют разную длину и последовательность аминокислот [15] (рис. 3).
Эксперименты с мутантными формами NOS (с удаленным в разной степени C-tail) показали, что C-tail оказывает ингибирующее влияние. В противоположность этому основание хвоста служит для эффективного синтеза NO. При удалении в iNOS одновременно удлинения (C-tail) и базовой последовательности синтез NO падает на 70%. При удалении только удлинения синтез NO растет на 15%, а редуктазная активность увеличивается в 10 раз. Эти данные получены в присутствии СаМ, так как iNOS не удавалось экспрес-сировать без него [12, 15].
Поскольку nNOS и eNOS легко экспрессировать как со связанным СаМ, так и без него (меняя уровень концентрации Са2+), то можно зафиксировать влияние C-tail в обоих случаях. Для исходных нормальных ферментов связывание СаМ усиливает редуктазную активность в 10 раз для nNOS и в 3 раза для eNOS.
Для мутантных форм (с удаленным C-tail) связывание СаМ, наоборот, замедляет редуктазную активность примерно на 36% для nNOS и на 46% — для eNOS. При этом в отсутствии СаМ редуктаз-ная активность мутантных eNOS примерно в 7 раз, а nNOS — в 21 раз больше, чем редуктазная активность исходных нормальных конститутивных NOS, т.е. СаМ работает как частичный неконкурентный ингибитор редуктазной активности мутантных форм. В то же время для нормальных конститутивных форм NOS с со-
//////////////////////^^^^
58 СТМ | 2023 | том 15 j №3 Н.А. Попова, С.К. Соодаева, И.А. Климанов, В.М. Мишарин, А.А. Темнов
храненными С4аП СаМ выступает как катализатор ре-дуктазной активности [15, 16].
Как и в случае А1, регуляторное влияние С4аП на эффективность разных этапов синтеза N0 конститутивными формами N0S имеет сложный характер [15, 16]:
в присутствии СаМ редуктазная активность (именно восстановление цитохрома С, соединенного с FMN, а не перенос электрона на гем) для мутантных и нормальных форм nN0S и eN0S примерно одинакова, удаление хвоста не имеет радикального влияния;
в отсутствие СаМ редуктазная активность обеих изоформ при удалении С4аП возрастает в 7-21 раз, но при этом скорость синтеза N0 для мутантной nN0S оказывается самой низкой (возможно, из-за образования супероксида путем диссоциации комплекса гем-Fe(II)-02 в оксидазном домене);
С4аП вносит вклад в зависимость конститутивных форм N0S от Са2+, так как при наличии С4аУ связывание СаМ увеличивает редуктазную активность, а при его отсутствии, наоборот, уменьшает.
Предполагается [15], что С4аУ не взаимодействует непосредственно с гемовым доменом, А1 и СаМ, так как эти домены находятся далеко от него. Наиболее вероятным считается, что СаМ находится на одной стороне флавиновой стенки, а С4аП покрывает другую ее сторону. При этом СаМ и С4аП модулируют поток электронов между флавинами, координируя расстояние и относительную ориентацию изоаллоксановых колец, а также регулируют поток электронов от FMN к терминальному акцептору (цитохрому С, феррициа-ниду или гемовому домену). Эксперименты с заменой серина на аспартат в С4аУ показали, что связывание СаМ вызывает перемещение С4аП для меньшего ин-гибирования потока электронов, вероятнее всего, за счет сил электростатического отталкивания отрицательно заряженных остатков фосфата или аспартата.
Заключение
СаМ, А1 и С4аУ являются основными элементами ауторегуляции N0S, модулирующими перенос электронов от флавина к гему. Связывание СаМ вызывает изменение междоменных расстояний, сдвиг и, как следствие, уменьшение ингибирующего влияния А1 и С4аП [12, 15, 16]. Эффекты СаМ, по всей видимости, реализуются через формирование временных ионных и гидрофобных взаимодействий с поверхностью оксидазного домена N0S, помогающих его взаимодействию с FMN. Также СаМ сдвигает кон-формационное равновесие редуктазного домена в сторону более открытых конформаций, сокращает время жизни и стереометрическое распределение конформаций, ускоряя переходы между ними и поток электронов через редуктазный домен. А1, вероятно, индуцирует конформационное изменение, которое препятствует переносу электронов внутри редуктаз-ного домена по аналогии с шарнирным доменом в цитохроме Р450 [12, 14].
C-tail совместно с СаМ модулируют поток электронов между флавинами, изменяя расстояние и относительную ориентацию изоаллоксановых колец, а также регулируют поток электронов от FMN к терминальному акцептору. Предполагаемый механизм — сдвиг C-tail и, как следствие, снижение его ингибирующего влияния на перенос электронов при связывании СаМ за счет сил электростатического отталкивания отрицательно заряженных остатков фосфата и аспартата.
Функционирование регуляторных элементов NOS требует дальнейшего изучения, которое позволит детализировать их сложный, разнонаправленный алгоритм взаимодействия. Более полное понимание механизмов ауторегуляции NO-синтаз в норме, а также при патологических состояниях необходимо для современных технологий моделирования NOS, что будет способствовать выявлению особенностей патогенеза различных социально-значимых заболеваний, повышению эффективности их диагностики и таргетной терапии.
Вклад авторов: Н.А. Попова — концепция статьи; Н.А. Попова, С.К. Соодаева, И.А. Климанов — подготовка первоначального варианта текста; В.М. Мишарин, А.А. Темнов — обзор и редактирование статьи.
Финансирование исследования и конфликт интересов. Исследование не финансировалось какими-либо источниками, и конфликты интересов, связанные с данным исследованием, отсутствуют.
Литература/References
1. Carlstrom M. Nitric oxide signalling in kidney regulation and cardiometabolic health. Nat Rev Nephrol 2021; 17(9): 575-590, https://doi.org/10.1038/s41581-021-00429-z.
2. Liy P.M., Puzi N.N.A., Jose S., Vidyadaran S. Nitric oxide modulation in neuroinflammation and the role of mesenchymal stem cells. Exp Biol Med (Maywood) 2021; 246(22): 23992406, https://doi.org/10.1177/1535370221997052.
3. Iwakiri Y., Kim M.Y. Nitric oxide in liver diseases. Trends Pharmacol Sci 2015; 36(8): 524-536, https://doi.org/10.1016/j. tips.2015.05.001.
4. Stuehr D.J., Haque M.M. Nitric oxide synthase enzymology in the 20 years after the Nobel Prize. Br J Pharmacol 2019; 176(2): 177-188, https://doi.org/10.1111/bph.14533.
5. Campbell M.G., Smith B.C., Potter C.S., Carragher B., Marletta M.A. Molecular architecture of mammalian nitric oxide synthases. Proc Natl Acad Sci U S A 2014; 111(35): E3614-E3623, https://doi.org/10.1073/pnas.1413763111.
6. Cinelli M.A., Do H.T., Miley G.P., Silverman R.B. Inducible nitric oxide synthase: regulation, structure, and inhibition. Med Res Rev 2020; 40(1): 158-189, https://doi. org/10.1002/med.21599.
7. Krol M., Kepinska M. Human nitric oxide synthase — its functions, polymorphisms, and inhibitors in the context of inflammation, diabetes and cardiovascular diseases. Int J Mol Sci 2020; 22(1): 56, https://doi.org/10.3390/ ijms22010056.
8. Tsutsui M., Tanimoto A., Tamura M., Mukae H., Yanagihara N., Shimokawa H., Otsuji Y. Significance of nitric
чшшшшт^тчтчшшшшш^тчтчтчшт
Ауторегуляция и аутоингибирование основных изоформ NO-синтаз СТМ | 2023 | том 15 | №3 59
oxide synthases: lessons from triple nitric oxide synthases null mice. J Pharmacol Sci 2015 127(1): 42-52, https://doi. org/10.1016/j.jphs.2014.10.002.
9. Li H., Jamal J., Plaza C., Pineda S.H., Chreifi G., Jing Q., Cinelli M.A., Silverman R.B., Poulos T.L. Structures of human constitutive nitric oxide synthases. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2014; 70(Pt 10): 2667-2674, https://doi. org/10.1107/s1399004714017064.
10. Попова Н.А., Климанов И.А., Соодаева С.К., Тем-нов А.А. Формирование структурной схемы универсальной модели каталитического цикла NO-синтаз. Современные проблемы науки и образования 2022; 4: 130, https://doi. org/10.17513/spno.31989.
Popova N.A., Klimanov I.A., Soodaeva S.K., Temnov A.A. Formation of the structural scheme for universal NO-synthase catalytic cycle model. Sovremennye problemy nauki i obrazovania 2022; 4, https://doi.org/10.17513/ spno.31989.
11. Kobayashi K., Tagawa S., Daff S., Sagami I., Shimizu T. Rapid calmodulin-dependent interdomain electron transfer in neuronal nitric-oxide synthase measured by pulse radiolysis. J Biol Chem 2001; 276(43): 39864-39871, https://doi.org/ 10.1074/jbc.m102537200.
12. Hanson Q.M., Carley J.R., Gilbreath T.J., Smith B.C.,
Underbakke E.S. Calmodulin-induced conformational control and allostery underlying neuronal nitric oxide synthase activation. J Mol Biol 2018; 430(7): 935-947, https://doi. org/10.1016/j.jmb.2018.02.003.
13. Nishida C.R., Ortiz de Montellano PR. Autoinhibition of endothelial nitric-oxide synthase. Identification of an electron transfer control element. J Biol Chem 1999; 274(21): 1469214698, https://doi.org/10.1074/jbc.274.21.14692.
14. Li J., Zheng H., Feng C. Deciphering mechanism of conformationally controlled electron transfer in nitric oxide synthases. Front Biosci (Landmark Ed) 2018; 23(10): 18031821, https://doi.org/10.2741/4674.
15. Roman L.J., Martasek P., Miller R.T., Harris D.E., de la Garza M.A., Shea T.M., Kim J.J.P., Masters B.S.S. The C termini of constitutive nitric-oxide synthases control electron flow through the flavin and heme domains and affect modulation by calmodulin. J Biol Chem 2000; 275(38): 29225-29232, https://doi.org/10.1074/jbc.m004766200.
16. Panda S.P., Li W., Venkatakrishnan P., Chen L., Astashkin A.V., Masters B.S., Feng C., Roman L.J. Differential calmodulin-modulatory and electron transfer properties of neuronal nitric oxide synthase mu compared to the alpha variant. FEBS Lett 2013; 587(24): 3973-3978, https://doi.org/10.1016/ j.febslet.2013.10.032.
///////////////////////^^^^
60 СТМ | 2023 | том 15 j №3 Н.А. Попова, С.К. Соодаева, И.А. Климанов, В.М. Мишарин, А.А. Темнов
