CC BY
172
Статья поступила в редакцию 12.12.2013 Доработана 27.05.2014
УДК 615.072
АТТЕСТАЦИЯ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА МУТНОСТИ БАКТЕРИЙНЫХ ВЗВЕСЕЙ
В работе приведены результаты исследований, выполненных ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России с целью приведения процедуры аттестации стандартного образца (СО) мутности в соответствие с современными требованиями. Исследования включают: обоснование требований к аттестации СО мутности бактерийных взвесей, разработку программы и методики его аттестации, валидацию методики измерений значений аттестуемой характеристики СО, статистическую обработку результатов испытаний и расчет метрологических характеристик СО.
Ключевые слова: стандартизация бактерийных взвесей, стандартный образец мутности.
Фадейкина О.В.
Ведущий технолог лаборатории бактериофагов и препаратов нормофлоры с коллекцией микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России Тел.: 8 (499) 241-89-43 E-mail: [email protected]
Стандартизация бактерийных взвесей является необходимым элементом для многих лабораторных методов микробиологических исследований в области здравоохранения, ветеринарии, охраны окружающей среды и др.
Широкое распространение получил визуальный метод оценки концентрации бактерийных взвесей по степени их мутности. Возможность применения визуальных методов основана на том, что мутность бактерийных взвесей обусловлена рассеянием света на микробных клетках и является оптическим эквивалентом концентрации содержащейся в них микробной массы.
Определение мутности проводят путем визуального сравнения исследуемых бактерийных взвесей со стандартными образцами, оптические свойства которых соответствует определенным концентрациям микробных клеток. В настоящее время Всемирной организацией здравоохранения рекомендован к применению 5-й Международный стандартный образец мутности (5th International reference preparation of opacity (5th IRP), которому присвоен показатель 10 международных единиц (МЕ) мутности [1, 2]. По материалам аттестации данного стандартного образца 1 МЕ соответствует мутности взвеси коклюшных микробов с концентрацией 1,1 млрд клеток в 1 мл [3].
В Российской Федерации использовали отраслевые стандартные образцы мутности ОСО 42-28-85 (10 МЕ), ОСО 42-28-86 (5 МЕ), разработанные в Государственном институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (в настоящее время - ФГБУ «НЦ ЭСМП») [4].
Целью настоящей работы было проведение метрологической аттестации стандартных образцов мутности бактерийных взвесей (далее - СО мутности) в соответствии с положениями ГОСТ 8.315-97 и рекомендациями по метрологии РМГ 93-2009 [5, 6].
Материалы и методы
исследования
В качестве исследуемого образца использовали опытную партию материала СО мутности, который представляет собой взвесь частиц стекла в дисперсионной среде и воспроизводит оптические свойства бактериальных взвесей.
Установление значений метрологических характеристик стандартных образцов проводили в одной лаборатории в соответствии с требованиями ГОСТ 8.315-97 с использованием Международного эталона мутности ВОЗ (5th International Reference Preparation оf Opacity (IRP), № 76/522) и вали-дированной методики измерений оптической плотности материала СО мутности (далее - методика) [5].
В качестве аттестуемой характеристики CO выбрана оптическая плотность, являющаяся количественной характеристикой мутности исследуемого материала. Измерение значений оптической плотности материала СО проводили на фотометре фотоэлектрическом КФК-З-ЗОМЗ при длине волны 540 ± 3 нм и кювете с длиной оптического пути 5 мм.
Валидацию методики и расчет показателей точности методики проводили в соответствии с рекомендациями по метрологии РМГ 61-2003 [7].
Расчет значений неопределенности, связанной со способом установления аттестованного значения (uchar), стандартной неопределенности от неоднородности (uh), стандартной неопределенности от нестабильности (ustab) проводили в соответствии с рекомендациями по метрологии РМГ 93-2009 и Р 50.2.058-2007 [6, 8].
Исследование однородности материала СО, соответствующего мутности (10 МЕ) и (5 МЕ) проводили в соответствии с ГОСТ 8.531-2002 [9].
Подготовку взвеси материала СО осуществляли под контролем визуального сравнения с Международным эталоном мутности ВОЗ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИй
Валидация методики измерений оптической
плотности материала СО
Для установления значений параметров точности методики проводили многократные измерения аттестуемой характеристики - оптической плотности материала СО: 10 групп измерений в условиях промежуточной
Таблица 1
Значения метрологических характеристик методики измерения оптической плотности материала СО фотометрическим методом
Измеряемая характеристика Диапазон измерений, нм Метрологические характеристики методики
Показатель повторяемости °f Кош %) Показатель промежуточной прецизионности Кош %) Показатель правильности ( аС,о™ %) Показатель точности s (5оТн, %)
Оптическая плотность, отн. ед. 400-600 0,001 (0,2 %) 0,005 (1,1 %) 0,006 (1,13 %) 0,015 (3,2 %)
прецизионности по фактору «время» (р = 10). Измерение значения оптической плотности каждой пробы материала СО проводили в условиях повторяемости (п = 2).
Значения метрологических характеристик методики измерений, полученные по результатам статистической обработки данных при доверительной вероятности Р = 0,95, приведены в табл. 1.
Как следует из данных, приведенных в таблице, границы относительной погрешности 5отн по данной методике составляют ± 3,2 % при доверительной вероятности Р = 0,95. Показатель повторяемости сготн или относительное стандартное отклонение повторяемости Sr методики равно 0,2 %. Показатель промежуточной прецизионности сЯотн или относительное стандартное отклонение промежуточной прецизионности SR методики равно 1,1 %. Показатель правильности сСотн или относительное стандартное отклонение неисключенной систематической погрешности методики равно 1,13 %.
Метрологическая прослеживаемость результатов измерений оптической плотности обеспечена посредством использования поверенного средства измерения (фотометра), погрешность которого учитывалась при расчете неисключенной систематической погрешности, проведенном в рамках валидации методики измерений.
Аттестуемой метрологической характеристикой СО мутности бактерийных взвесей является аттестованное значение оптической плотности материала СО и неопределенность аттестованного значения.
При установлении значений метрологических характеристик СО мутности бактерийных взвесей использовали валидированную нами методику измерений оптической плотности данных взвесей, повторяемость и воспроизводимость которой установлена при внутри-лабораторном исследовании.
В связи с тем что материал СО, соответствующий мутности 5 МЕ, готовят из материала СО 10 МЕ, для
Примечания:
SSe - сумма квадратов отклонений результатов измерений от средних значений для каждой пробы;
SSH - сумма квадратов отклонений средних результатов для каждой пробы от среднего арифметического значения всех
результатов;
- средний квадрат отклонений результатов измерений от средних значений для каждой пробы;
- средний квадрат отклонений результатов измерений от средних значений между пробами.
Таблица 2
Результаты исследования неоднородности материала СО, соответствующих мутности (10 МЕ) и (5 МЕ)
Индекс Среднее значе- Результаты промежуточных расчетов Стандартная неопределен-
образца ние оптической плотности, отн.ед. SSe SSW Ми ность от неоднородности, и
СО(10 МЕ) 0,46 0,000011 0,000226 7,310-7 0,000016 0,003 или 0,6 %
СО (5 МЕ) 0,23 0,000007 0,000144 4,310-7 0,000011 0,002 или 0,9 %
экземпляра СО 5 МЕ принимали результаты по изучению неоднородности, стабильности и установлению срока годности материала СО 10 МЕ.
Экспериментальное установление значения оптической плотности материала СО, статистическую обработку экспериментальных данных и определение значения аттестуемых характеристик СО проводили в соответствии с разработанной программой испытаний и методикой аттестации.
Исследование неоднородности
материала стандартного образца
Для проведения исследований неоднородности материала СО мутности бактерийных взвесей отбирали случайным образом по пять проб в начале, середине и в конце розлива - всего 15 проб. Значение оптической плотности каждой пробы измеряли дважды и рассчитывали среднее значение.
По результатам измерений провели расчет неопределенности от неоднородности. Результаты расчетов, полученные для материалов СО 10 МЕ и СО 5 МЕ, приведены в табл. 2.
Стандартную неопределенность от неоднородности иь оценивали по формуле:
щ=^1К=от. (1)
На основе статистической обработки результатов измерения оптической плотности материала СО с целью определения неоднородности были установлены значения стандартной неопределенности от неоднородности для числа степеней свободы vuh = 14, которая для СО мутности (10 МЕ) равна 0,003, или 0,6 %, а для СО мутности (5 МЕ) - 0,002, или 0,9 %.
Определение аттестованных значений
Значения аттестуемой характеристики и неопределенности от способа установления оценивали в соответствии с рекомендациями по метрологии РМГ 93-2009 [3].
Для установления аттестованного значения СО проводили многократные измерения аттестуемой характеристики - оптической плотности: 10 групп измерений (р = 10) в условиях промежуточной прецизионности (по фактору «время»). На каждом уровне промежуточной
Таблица 3
Результаты обработки данных, полученных при установлении аттестованного значения СО мутности (10 МЕ, 5 МЕ) в условиях промежуточной прецизионности по фактору время
Наименование образца Число уровней промежуточной прецизионности, р Число измерений в условиях повторяемости, п Стандартное отклонение повторяемости, Sf, % Стандартное отклонение промежуточной прецизионности, SRm, %
СО (10 МЕ) 10 3 0,0007 (0,1 %) 0,003 (0,7 %)
СО (5 МЕ) 10 3 0,0006 (0,2 %) 0,003 (1,1 %)
прецизионности выполнялось по 3 измерения (п = 3) в условиях повторяемости.
По результатам статистической обработки данных, полученных при установлении аттестованного значения СО мутности (10 МЕ, 5 МЕ) в условиях промежуточной прецизионности по фактору «время», рассчитаны значения стандартного отклонения повторяемости Sr и промежуточной прецизионности SRiT)
Приемлемость результатов измерения значения аттестуемой характеристики, полученных с использованием предварительно валидированной методики, оценивали с помощью критерия хи-квадрат, проверяя выполнение неравенств (2) и (3). В случае их выполнения к расчетам принимали все результаты измерения.
Для результатов, полученных в условиях повторяемости, критерий хи-квадрат, описывается неравенством:
s2r < /0,95 (V)
(2)
где Sr - стандартное отклонение повторяемости результатов измерения;
сг - стандартное отклонение повторяемости методики;
/о,95(у) - квантиль х2-распределения; V = р{п - 1) - число степеней свободы. Для СО 10 МЕ:
а2 0,0012 V 20
Для СО 5 МЕ: Si 0,00062
ог2 0,0012
v 20
Для результатов, полученных в условиях промежуточной прецизионности, критерий хи-квадрат, описывается неравенством:
S\- ( 1- I
ч n
1-
\ n
(3)
где SR - стандартное отклонение промежуточной прецизионности результатов измерения;
- стандартное отклонение промежуточной прецизионности методики;
/0,95(у) - квантиль х2-распределения;
V = р - 1 - число степеней свободы.
Для неравенства (3) коэффициент х1,95^У) равен 16,919 при числе степеней свободы V = 9, значение
у2 ЛЛ
отношения равно 1,879. Левая часть нера-
венства (3) для СО 10 МЕ и СО 5 МЕ равна 0,12, что меньше, чем 1,879.
Поскольку неравенства (2) и (3) выполнены, все результаты измерений приемлемы по критерию хи-квад-рат, и аттестованные значения СО мутности оценивали как среднее арифметическое по всем результатам.
Стандартную неопределенность от способа установления аттестованного значения СО и^аг оценивали по формуле:
uchar ~
1
Р
о2с+— + --0,01, (4)
где сс - стандартное отклонение неисключенной систематической погрешности;
SR - стандартное отклонение промежуточной прецизионности результатов измерения;
Sr - стандартное отклонение повторяемости результатов измерения;
р - число уровней промежуточной прецизионности.
На основании статистической обработки результатов измерений оптической плотности материала СО были установлены аттестованное значение оптической плотности материала СО, соответствующего мутности 10 МЕ, равное 0,46; аттестованное значение оптической плотности материала СО, соответствующего мутности 5 МЕ, равное 0,23; оценена стандартная неопределенность от способа установления аттестованного значения иса, которая равна 0,01, или 2,1 %; вычислено эффективное число степеней свободы vchаree1f, которое равно 45.
Исследование стабильности
и установление срока годности
Значение неопределенности от нестабильности и$аь оценивали по классическому способу исследования стабильности в соответствии с рекомендациями по метрологии РМГ 93-2009 и Р 50.2.031-2003 [6,10].
Измерение значений аттестуемых характеристик проводили через равные промежутки времени (3 мес.) в течение 12 месяцев.
Результаты исследования нестабильности и вспомогательные расчеты представлены в табл. 4.
В качестве начального значения D1 принимали ё1 = 0.
По табл. 6.2. РМГ 93-2009 [3] выбирали значение а из интервала от 0,1 до 0,3 в зависимости от значения отношения стандартного отклонения промежуточной прецизионности по фактору «время» сД(Т) к допускае-
Таблица 4
Результаты исследования нестабильности материала СО мутности (10 МЕ)
Номер измерения 1 Временной интервал t, мес. Результат измерения, x d d, % ad. (1 - «Di Di R,
1 0 0,472 0 0 0 0 0 -
2 3 0,468 0,004 1,6 0,0012 0 0,0012 0,0012
3 6 0,462 0,01 3,7 0,003 0,007 0,01 0,0088
4 9 0,455 0,017 6,1 0,0051 0,0119 0,017 0,007
5 12 0,442 0,03 8 0,009 0,021 0,03 0,013
Примечание:
d¡ = X,- - х1 - отклонение результата измерения х, в ¡-й момент времени от первоначального значения х^ D¡ = ad¡ + (1 - - сглаженное значение разности результатов измерений в /-й момент времени (/ = 2,...п); Я-! = D¡ - D¡-1 - скользящий размах; / = 1, 2,...л, где п = 5.
мому значению расширенной неопределенности аттестованного значения СО идоп в соответствии с техническим заданием на разработку СО.
п ая(т) 0,005 Л „„ ,
В данном случае для —w = -= 0,22, коэф-
Uдоп 0,023
фициент а = 0,3.
На основании статистической обработки результатов измерений оптической плотности материала СО мутности с целью исследования стабильности было установлено, что для числа степеней свободы vstab = 3 значение стандартной неопределенности от нестабильности ustab СО мутности равно 0,004, или 0,8 %.
Установлено, что материал стабилен в течение времени исследования.
Из данных, приведенных в табл. 3, следует, что к концу времени исследования стабильности снижение значения оптической плотности материала СО мутности не превышает 10 % и соответствует допустимым отклонениям значения аттестованной характеристики, приведенным в технических условиях на изготовление. Временной интервал исследования, в течение которого изменение оптической плотности не превышает 10 %, принят в качестве срока годности стандартного образца мутности бактерийных взвесей и составляет при соблюдении условий хранения не менее 12 месяцев с момента изготовления, что соответствует требованиям технического задания.
Определение метрологических характеристик
В соответствии с РМГ 93-2009 [6] основными источникам неопределенности аттестованного значения СО являются:
- неоднородность материала СО;
- нестабильность значений аттестуемой характеристики СО;
- способ определения аттестованного значения СО.
При установлении метрологических характеристик
СО рассчитывали суммарную стандартную неопределенность аттестованного значения ис, учитывая вклад составляющих неопределенности от неоднородности иЛ, от способа установления аттестованного значения исЬаг, от нестабильности и5ЙЬ.
Суммарную стандартную неопределенность аттестованного значения СО ис оценивали по ее составляющим по формуле:
-^Char+Ut +"
2
stab
Число эффективных степеней свободы суммарной стандартной неопределенности усе11 вычисляли по формуле:
.. _ <{А)
4 4 4
uchar ! uh ! ustab
УсЫгуА,е#
Суммарная стандартная неопределенность аттестованного значения комплекта СО мутности (10 МЕ, 5 МЕ) для эффективного числа степеней свободы ус1 = 32 составляет ис = 0,011, или 2,4 %.
При вычислении неопределенности результатов измерений делали предположение о нормальности закона распределения возможных значений измеряемой величины, то есть для доверительной вероятности Р = 0,95 значение коэффициента охвата к принимали равным 2.
Примечание:
исШ - стандартная неопределенность от способа установления аттестованного значения СО;
иь - стандартная неопределенность от неоднородности СО;
изаь - стандартная неопределенность от нестабильности СО;
ис - суммарная стандартная неопределенность аттестованного значения СО;
ир - расширенная неопределенность аттестованного значения СО;
и - стандартная неопределенность;
и - расширенная неопределенность.
Таблица 5
Бюджет неопределенности аттестованного значения СО мутности (комплект 10 МЕ, 5 МЕ)
Индекс СО Аттестуемая характеристика Аттестованное значение Uchar , (%) Uh, (%) Ustab , (%) Uc, (%) Up , (%)
СО (10 МЕ) Оптическая плотность, отн. ед. 0,46 0,01 (2,1) 0,003 (0,6) 0,004 (0,8) 0,011 (2,4) 0,023 (4,8)
СО (5 МЕ) 0,23
Границы расширенной неопределенности аттестованного значения СО мутности для к = 2 рассчитывали по формуле:
ир=к-ис = 2д/и2сЫг +и2к+ и2шЬ.
Аттестованные значения, расширенная неопределенность аттестованных значений, составляющие расширенной неопределенности аттестованных значений стандартных образцов мутности бактерийных взвесей (комплект 10 МЕ, 5 МЕ) приведены в табл. 5.
Таким образом, по результатам испытаний было установлено, что оптическая плотность материала СО, соответствующая мутности Международного эталона ВОЗ (5Ш ^Р, 76/522), эквивалентна следующим значениям аттестуемой характеристики экземпляров стандартных образцов при доверительной вероятности Р = 0,95 и коэффициенте охвата к = 2:
- значение оптической плотности экземпляра СО мутности бактерийных взвесей (10 МЕ) составляет 0,46 ± 0,023 отн. ед.
Значение оптической плотности экземпляра СО мутности бактерийных взвесей (5 МЕ) составляет 0,23 ± 0,013 отн. ед.
Прослеживаемость аттестованного значения комплекта стандартных образцов обеспечивается к единицам СИ (объем (дм3), длина волны (нм), оптическая плотность) посредством применения поверенных средств измерений (дозаторов, фотометра фотоэлектрического).
Определение области применения стандартного образца мутности бактерийных взвесей
Стандартный образец мутности бактерийных взвесей предназначен для установления и определения концентрации микробных клеток в бактерийных взвесях
визуальным методом и может быть использован для валидации методик определения концентрации микробных клеток в бактерийных взвесях. По литературным данным и результатам собственных исследований 10 МЕ ориентировочно соответствуют следующим концентрациям клеток в 1 мл:
11 ■ 109 клеток/мл для микробов коклюшной группы;
0,93 ■ 109 клеток/мл для микробов кишечной группы;
1,7 ■ 109 клеток/мл для бруцеллезных микробов;
2,2 ■ 109 клеток/мл для холерного вибриона;
5 ■ 109 клеток/мл для туляремийных микробов [11,
12].
Для СО 5 МЕ концентрация микробных клеток в 2 раза меньше, чем для ОСО 10 МЕ.
Применение СО мутности позволяет получать сопоставимые результаты при оценке концентрации микробных клеток при производстве и контроле качества иммунобиологических лекарственных препаратов (ИЛП); при стандартизации ветеринарных бактерийных препаратов; при определении чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам; для микробиологического определения активности антибиотиков, изучения динамики роста и размножения микроорганизмов; при контроле качества при микробиологических исследованиях воды и пищевых продуктов и в других областях частной микробиологии.
Нами проведен анализ сведений о реализации ГИСК им. Л.А. Тарасевича ОСО мутности ОСО 42-28-85 (10 МЕ) и ОСО 42-28-86 (5 МЕ). Установлена специфика пользователей и их процент от общего числа, которые представлены на рисунке ниже.
Как видно из данных, представленных на рисунке, стандартные образцы мутности применяют при осуществлении своей деятельности предприятия-производители
МИБП, ветеринарные лаборатории, центры гигиены и эпидемиологии, водоканалы. В графе «прочие» представлены предприятия пищевой промышленности, туберкулезные диспансеры, научно-исследовательские институты. Коммерческие организации, как правило, выполняют функции поставщиков указанным потребителям.
На основании вышесказанного определена область планируемого применения СО - стандартизация микробных взвесей для испытаний, осуществляемых в области здравоохранения, ветеринарии, пищевой промышленности, охраны окружающей среды, научных исследований в Российской Федерации.
Таким образом, в соответствии с техническим заданием экспериментально определены метрологические характеристики материала СО мутности бактерийных взвесей (комплект 10 МЕ, 5 МЕ), подготовлены проекты технической и нормативной документации на СО, определена область применения СО.
ЛИТЕРАТУРА
1. "World Health Organization Expert Committee on Biological Standardization International Reference Preparation of Opacity". World Health Organization Technical Report Series 594. 1976. P. 16.
2. WHO International Standard Opacity 5IRP. Instruction for use. URL: www.nibsc.org/documents/ifu/76-522.pdf.
3. Csizer Z. et al. "Estimation of bacterial mass of pertussis vaccine by opacity and dry weight determinations". Journal of Biological Standardization. 1977. V. 5. Pp. 289-295.
4. Распоряжение Правительства Российской Федерации от 17 ноября 2010 г. № 2058-р. URL: www.rg.ru/2010/11/23/minzdrav-site-dok.html#comments.
5. ГОСТ 8.315-97 ГСИ. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Основные положения.
6. РМГ 93-2009 ГСИ. Оценивание метрологических характеристик стандартных образцов.
7. РМГ 61-2003 ГСИ. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа.
8. Р 50.2.058-2007 ГСИ. Оценивание неопределенности аттестованных значений стандартных образцов.
9. ГОСТ 8.531-2002 ГСИ. Стандартные образцы состава монолитных и дисперсных материалов. Способы оценивания однородности.
10. Р 50.2.031-2003 ГСИ. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. Методика оценивания характеристики стабильности.
11. Фихман Б.А. Оптическая стандартизация бактерийных препаратов. М.: Бюро научной информации, 1960. 264 с.
12. Петухов В.Г. Рассеяние света бактерийными суспензиям: автореф. дис. ... канд. биол. наук. М.: Истринская типография, 1966. 17 с.
CERTIFICATION OF REFERENCE MATERIAL OF BACTERIAL SUSPENSION TURBIDITY
O.V. Fadeikina
The article presents the results of research carried out FSBI "SCEMAP" of the Ministry of Health of the Russian Federation in order to bring qualification procedures for opacity standard samples of bacterial suspensions in line with current requirements for certified reference materials. The studies include: the justification requirements for the certification of opacity standard samples of bacterial suspensions, the development of the program and procedure of its evaluation, validation of the measurement procedure for the certified characteristics, statistical analysis of test results and calculation of metrological characteristics.
Key words: Standardization of bacterial suspensions, standard sample of opacity.
Ветеринарные лаборатории
3%
Центры гигиены эпидемиологии
17%
Водоканалы
13%
Предприятия
Рис. Специфика пользователей ОСО мутности
