CC BY
16УДК 530.145 + 620.3
Атомно-силовая микроскопия биологических наночастиц на воздухе
112 3
И.И. Бобринецкий , Р.А. Морозов , В.В. Трошин , Е.Ю. Чаплыгин
1 Национальный исследовательский университет «МИЭТ»
2ООО «Наноинженерия органических и биологических интегрируемых
систем» (г. Москва)
3ЗАО «Зеленоградский нанотехнологический центр» (г. Москва)
Развита аналитическая модель, показывающая влияние адсорбата воздуха на разрешение биологических наночастиц в атомно-силовой микроскопии. Выявлено, что латеральные топографические размеры изображения биологических наночастиц не отражают их реальные поперечные размеры и необходимы, главным образом, для определения протяженности объектов и их конфигурации на подложке. Показано, что высота (диаметр) протяженных наночастиц на подложке определяется с достаточной точностью, что согласуется с известными экспериментальными данными, полученными другими методами.
Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, биологические наночастицы, адсорбат воздуха, латеральное разрешение, разрешение по высоте, математическая модель.
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) используется в биологии сравнительно давно [1, 2]. На сегодняшний день известны основные геометрические артефакты, связанные с геометрией зонда, подложки и образца. Как правило, имеется в виду вакуумная АСМ, влияние окружающей среды не учитывается, тем более, если речь идет об исследовании биологических нанообъектов.
АСМ нанообъектов на подложках на воздухе существенно отличается от аналогичной микроскопии в вакууме. В атмосферных условиях поверхности зонда и образцов покрыты слоем адсорбата. В основном это адсорбированная вода. При этом толщина слоя адсорбата определяется относительной влажностью воздуха, задаваемой атмосферным давлением и температурой воздуха. Например, при 50%-ной влажности и нормальном давлении слой адсорбата на поверхности золота может достигать 6 нм [3, 4], в то время как диаметр одностенных углеродных нанотрубок менее 1 нм. В этом случае углеродные нанотрубки на золотой подложке могут «плавать» в адсорбате и не будут отображаться на подложке. Это один из существенных недостатков атомно-силовой микроскопии на воздухе. Наличие пленки адсорбата на поверхности и зависимость ее толщины от относительной влажности воздуха успешно используются в зондовой нанотехнологии для локального анодного окисления подложек [5, 6]. Однако АСМ на воздухе имеет существенное преимущество перед вакуумной АСМ, так как позволяет существенно экономить время исследования и материальные ресурсы, а самое главное имеется возможность исследовать биообъекты в естественной среде.
Зондовая микроскопия нанообъектов имеет существенную особенность при сканировании. Нанообъект, находящийся на подложке, сканирует поверхность зонда. Таким образом можно оценить радиус и топологию нанообъекта на поверхности [7].
© И.И. Бобринецкий, Р.А. Морозов, В.В. Трошин, Е.Ю. Чаплыгин, 2013
Рассмотрим влияние адсорбата воздуха на АСМ-разрешение биологических наночастиц на воздухе. Будем считать пленку адсорбата квазижидкой [3]. На рис.1 представлена геометрическая схема для описания сканирования зондом радиусом Я, покрытым пленкой адсорбата толщиной АЯ, наночасти-цы радиусом г, покрытой пленкой адсорбата толщиной Аг. Толщина адсорбата на подложке равна АП, ё - зазор между зондом и поверхностью подложки, I - ширина поперечного изображения наночастицы. Рассмотрим случай, когда АП < 2г.
Наночастица может быть сферической или протяженной. Толщина адсорбата на разных концах молекул разная из-за наличия гидрофобных или гидрофильных окончаний. Существует проблема закрепления нано-частиц на подложках, поскольку зонд может свободно их сметать за пределы области сканирования. В связи с этим для сканирования наноразмерных образцов предпочтительно использовать полуконтактную моду сканирования. Наночастицы нужно размещать на нагретой подложке до температуры более 100 °С, когда пленка адсорбата воды станет минимальной. Такой прием позволяет в большей мере использовать ван-дер-ваальсовые силы для сцепления с подложкой. Здесь важно, чтобы нанотрубки или биомолекулы были протяженными для увеличения суммарной силы притяжения. При этом покрывающая пленка дополнительно способствует прижатию наночастицы к поверхности подложки.
Введем следующие обозначения: Яе = Я + АЯ, ге = г + Аг. Тогда из геометрии рис.1 получим
г = {(Яе + г)2 - (Яе + й + АП - г)2}/2. (1)
При г = 0 имеем й = . Тогда из формулы (1)
йШах = ге + Г-АП = 2г + Аг-АП. (2)
Если наночастица находится на поверхности подложки из того же материала, что и частица, то можно принять, что
Аг = АП и йтах = 2г . (3)
Иначе говоря, высота изображения наночастицы на топографии соответствует ее диаметру. Например, такая ситуация возникает при расположении углеродных нанот-рубок на поверхности подложки из пиролитического графита, если еще учесть, что толщина пленки адсорбата на графите примерно 0,7 нм [4]. Формула (3) в первом приближении может быть справедлива и в большинстве случаев для разных наночастиц на разных подложках, поскольку квазижидкий адсорбат «обтекает» наночастицу, выравнивая толщину. Эффект малого радиуса кривизны частицы для пленки адсорбата (эффект Лапласа) должен проявляться в меньшей мере, поскольку частица находится на поверхности подложки. Проводя измерения при разной относительной влажности воздуха, это утверждение можно проверить.
Запишем уравнение (1) в других координатах. Для этого примем
C = Re + г,
t2 + (C + d - dmax )2 = C 2.
(4)
Уравнение окружности со смещенным центром (4) в общем виде описывает зависимость t = t (ё) (рис.2).
Из рис.2 видно, что изображение частицы радиусом г существенно «уплощается». Полуширина изображения наночастицы ^шо. = радиусом г максимальна, когда
ё = 0, и определяется экспериментально. В соответствии с формулой (4) можно на основании экспериментальных данных ^ах, ётах
определить
C = R + г =
t* + d.
2
max
2d_
(5)
Рис.2. Общий вид поперечного изображения наночастицы радиусом r
Из формулы (5) следует, что наличие пленки адсорбата приводит в любом случае к увеличению межцентрового расстояния между зондом и наночастицей, а также к увеличению латерального изображения наночасти-цы. Латеральное изображение обычно значительно превышает максимальную высоту изображения наночастицы:
2t„
(
d„
= 2
2(Re + Ге ) d
Л
1/2
-1
1
2R
d
(6)
Есть еще одна принципиальная проблема при сканировании протяженных нанообъектов на подложках. В силу того что поперечные размеры частиц на топографии существенно превышают реальные, короткие молекулы могут визуализироваться на поверхности подложки в виде бесформенных образований. А именно, согласно рис.2 длина протяженных частиц I должна превышать величину 2^тах:
l > 2tmax = 2(dmax(2C - d^))^ - ^ .
(7)
Здесь для оценок приведено также приближенное выражение, когда Аг = АЯ = 0, т.е. пленкой адсорбата можно пренебречь. Например, при радиусе одностенных нанотру-бок г = 0,35 нм и радиусе зонда R = 10 нм длина трубок должна превышать длину протяженных частиц, т.е. I > 7,4 нм, чтобы они отображались в микроскопе как протяженные объекты.
Рассмотрим случай, когда АП > 2г + Аг (см. рис.1). Наночастица находится под слоем адсорбата и ее просто можно не обнаружить. Для уменьшения влияния адсорбата на результаты измерений, учитывая, что пленка является квазижидкой, необходимо вытеснять адсорбат из контакта между поверхностью зонда и поверхностью наночастицы. Сила, с которой действует острие кантилевера в контактной моде Е, задается прогибом балки. В полуконтактной моде действующая сила равна [4]:
F = 4n2MAdf2 , (8)
где f - частота колебаний острия кантилевера; M - его масса; Ad - амплитуда колебаний.
Однако эта сила в расчете на единицу площади должна быть меньше напряжений пластической деформации материалов зонда, подложки и образца: F/ S < tí , т0, тp, где
Т, та, т - соответственно напряжения пластической деформации зонда, подложки и
образца; S - площадь контакта. В противном случае результаты сканирования будут необратимы. Время выдавливания адсорбата можно оценить из [4] по адаптированной формуле для рассматриваемой задачи, считая, что между сближающимися электродами имеет место вязкое течение Куэтта:
t ж_3D®2__(9)
в F(AR + Ar - 5)2'
здесь ^ - динамическая вязкость адсорбата; 5 - толщина адсорбата, остающаяся при контакте острия зонда с поверхностью наночастицы.
Динамическую вязкость пленки адсорбата трудно оценить, поскольку пленка адсорбата неоднородна. На поверхности подложки есть неподвижные («твердые») молекулярные слои, внешние слои пленки адсорбата являются подвижными («жидкими»). Тем не менее, оценим порядок времени выдавливания адсорбата. Примем, что вязкость
адсорбата ц = 102 г/см • с, для золотой подложки т0 = 28,5 ГПа, F / S = 0,1 т0, R = 10-6см, AR + Ar = 5•ÍO-7см , 5 = 3•ÍO-8см. Из (9) получаем tB = 4-10"6с, что позволяет кантилеверу в полуконтактной моде даже с высокой резонансной частотой при каждом соприкосновении с подложкой вытеснять адсорбат. Формула (8) полезна для выбора параметров сканирования. При прочих неизменных параметрах необходимо стремиться к минимальному времени выдавливания адсорбата из межэлектродного зазора в заданной точке. От этого времени зависит латеральная скорость сканирования и в конечном счете разрешение микроскопа. Выдавливание адсорбата имеет место и в туннельном режиме на воздухе (так называемый «самосжатый» режим). При этом возможно получение атомного разрешения поверхности углеродных нанотрубок [4].
При выдавливании адсорбата из межэлектродного зазора возможно смещение на-ночастиц на поверхности подложки, так как балка кантилевера обычно находится под некоторым углом к поверхности подложки. При прижатии острия кантилевера к нано-частице возникают сдвиговые силы вдоль поверхности подложки.
Таким образом, как в вакуумной АСМ, так и в АСМ на воздухе наиболее достоверное разрешение имеет высота наночастиц на подложке. Однако разрешение на воздухе может зависеть от степени прижатия (прогиба) балки кантилевера и в каждом конкретном случае необходимо проведение небольшой исследовательской работы для получения удовлетворительного решения.
Рассмотренные теоретические соображения являются обобщением множества экспериментальных результатов и для иллюстрации основных положений теории приведем результаты АСМ-исследования бактериальных ДНК.
В качестве подложки использовался полированный кремний, предварительно очищенный химически и подвергнутый термообработке при температуре около 300 °С. Исследования проводились на микроскопе Solver P-47 в полуконтактной моде, использовались кантилеверы Micromash SPM Probe, 325 кГц, 46 Н/м. На первом этапе осуще-
ствлялись АСМ-исследования подложки для определения её шероховатости и наличия возможного наноразмерного мусора с тем, чтобы не перепутать его с образцами ДНК. Обычно имеются серповидные частиц высотой 1,5 нм и глобулообразные частицы высотой 3-20 нм.
Бактериальные ДНК высаживались из водного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл каплей с объемом 0,1 мкл. После высыхания капли проводилось топографирование различных участков капли в различных режимах прогиба балки кантилевера для получения наиболее четких изображений молекул и наименьшей их высоты на подложке.
На рис.3 представлены топография молекул ДНК и их профили для различных участков. Из рисунка видно, что высота единичных ДНК составляет 2,1 нм (профиль 1), двойных ДНК - в два раза больше, что соответствует литературным данным [1, 2]. Отношение максимальной ширины изображения молекулы к ее максимальной высоте составляет / « 90, что согласно формуле (6) свидетельствует о достаточно сильном «боковом» налипании адсорбата между подложкой и молекулами ДНК (см. рис.1) и слабом выталкивании адсорбата острием кантилевера. По паспортным данным радиус острия кантилевера не превышает 20-30 нм. Согласно экспериментальным данным [3] высота пленки адсорбата на кремнии составляет 4,4 нм, а высота молекул ДНК -2,1-4,2 нм. В этом случае формула (6) не справедлива, однако оценки по этой формуле показывают наличие острия с большим радиусом закругления, косвенно свидетельствуя, что толщина пленки адсорбата на подложке превышает высоту молекул.
à
М/
Рис.3. Топография молекул ДНК на подложке (а) и их характерные профили (б)
Таким образом, латеральные топографические размеры изображения биологических наночастиц не отражают их реальные поперечные размеры и необходимы в основном для определения протяженности объектов и их конфигурации на подложке.
Высота (диаметр) протяженных наночастиц на подложке определяется с достаточной точностью. В целом можно констатировать, что атомно-силовая микроскопия наночастиц на воздухе является более адекватной и доступной для биологических объектов. Имеющиеся методические трудности решаемы в каждом конкретном случае.
Авторы выражают благодарность В.К. Неволину за полезные обсуждения результатов работы.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации на оборудовании ЦКП «МСТ и ЭКБ» на базе Национального исследовательского университета «МИЭТ».
Литература
1. Morris V.J., Kirby A.R., Gunning A.P. Atomic force microscopy for biologists. - Imperial College Press, l999. - 332 p.
2. Force microscopy. Applications in biology and medicine I Edited by Bhanu P. Jena, J.K. Heinrich Horber. - Published simultaneously in Canada, 2006. - 2В7 p.
3. Булатов А.Н., Хартов С.В. Исследование адсорбата воздуха на твердотельных подложках методами атомно-силовой микроскопии II Изв. вузов. Электроника. - 2004. - № 4. - С. 9-16.
4. Неволин В.К. Зондовые нанотехнологии в электронике. - M.: Техносфера, 2006. - 159 с.
5. Булатов А.Н., Неволин В.К. Анодное окисление тонких пленок алюминия в атомно-силовом микроскопе // Mикросистемная техника. - 2003. - № 11. - C. 42-44.
6. Исследование особенностей процесса локального окисления пленок титана с использованием сканирующей зондовой микроскопии I С.А. Гаврилов, С.В. Лемешко, В.М. Рощин и др. // Изв. вузов. Электроника. - 2000. - № 3. - С. 27-33.
7. Бобринецкий И.И., Неволин В.К., Строганов A.A., Чаплыгин Ю.А. Тестовая структура для определения геометрических размеров острия иглы сканирующего зондового микроскопа // Патент РФ №230В414. - 2006.
Статья поступила 26 сентября 2012 г.
Бобринецкий Иван Иванович - доктор технических наук, профессор, ведущий научный сотрудник научно-образовательного центра «Зондовая микроскопия и нано-технология» (Н0Ц ЗMНТ) MИЭТ. Область научных интересов: зондовая микроскопия и нанотехнология, нанобиосенсорика. E-mail: [email protected]
Морозов Роман Андреевич - аспирант Н0Ц ЗMНТ MИЭТ. Область научных интересов: зондовая микроскопия биологических клеточных структур.
Трошин Владислав Владимирович - научный сотрудник OOO «НИ0БИС» (г. Mоск-ва). Область научных интересов: зондовая микроскопия, комбинационная спектроскопия биологических объектов.
Чаплыгин Евгений Юрьевич - руководитель инвестиционного департамента ЗА0 «Зеленоградский нанотехнологический центр» (г. Mосква). Область научных интересов: разработка и создание биомедицинских приборов.
