CC BY
51Фізика живого, Т.20, Nol, 2Q12. С. 61-64.
© Шепель І О., Шелюк О.В., Кременецька К. О.
УДК 577.353.24
АТФазна АКТИВНІСТЬ ТА РЕАКЦІЯ СУПЕРПРЕЦИПІТАЦІЇ АКТОМІОЗИНУ СКЕЛЕТНИХ МЯЗІВ ПІД ВПЛИВОМ БАГАТОСТІННИХ НАНОТРУБОК ТА БАГАТОСТІННИХ НАНОТРУБОК ДОТОВАНИХ ЗАЛІЗОМ
Шепель І.О., Шелюк О.В., Кременецька К.О.
Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, Україна Надійшла до редакції 19.04.2012
Досліджено вплив багатостінних нанотрубок (БВНТ) та БВНТ датованих залізом на основні функціональні показники актоміозину скелетних м’язів кроля. Виявлені протилежні ефекти БВНТ та БВНТ датованих залізом на показники реакції суперпреципітації і АТФазної активності актоміозину, що можна пояснити, наприклад, присутністю у складі БВНТ сполук металів (зокрема, заліза), які можуть бути ефективними інгібіторами даних функціональних показників.
Ключові слова: багатостінні вуглецеві нанотрубки, АТФазна активність, суперпреципітація актоміозину, скелетні м’язи.
ВСТУП
Пошук нових нанорозмірних хімічно-інертних сполук, здатних впливати на клітинні процеси, є актуальним завданням нанобіотехнологій. З огляду на це інтенсивно досліджується наноструктури, яким притаманні унікальні фізико-хімічні властивості, що робить їх перспективними для біологічного й медичного застосування [1]. Наприклад, здатність вуглецевих нанотрубок (ВНТ) проникати крізь клітинні мембрани уможливлює їх використання для транспортування протеїнів, антигенів, вакцин та лікарських препаратів у клітину [2]. Також досліджено властивість ВНТ унаслідок їх електричної стимуляції переносити сигнали до нервових клітин. Відомо, що вплив ВНТ на біологічні структури залежить від їхнього типу (одно-чи багатостінні), розміру, концентрації в середовищі, способів функціоналізації (функціональних груп, приєднаних до поверхні ВНТ) та домішок металів у суспензії [3]. На сьогодні ВНТ також планують застосовувати для створення штучних м’язів, які можуть бути втричі міцнішими за біологічні і не змінюватимуть своїх властивостей під впливом високих температур та багатьох хімічних реагентів [2, 4]. Також не існує даних про дію ВНТ на скоротливі білки, зокрема на актоміозиновий комплекс. Основною метою даної роботи було з'ясування впливу багатостінних вуглецевих нанотрубок (БВНТ) та БВНТ з залізом на функціональні характеристики м'язових білків, а саме на реакцію суперпреціпітації, яка являє собою спрощену модель м'язового скорочення, а також на АТФ-азну активність актоміозину, що є основним показником його функціональної активності [5].
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ
Дослідження проводили на актоміозині скелетних м’язів кроля породи Радянська Шиншила. Забій тварин здійснювали, попередньо наркотизуючи їх нембуталом. Bидiлення актоміозину проводили за методикою Перрі, описаною в роботі Tартаковського [6].
Для дослідження впливу БBHT та БBHT з залізом
на актоміозиновий комплекс була виміряна ATФ-азна
активність нативного актоміозину в присутності
магнію і кальцію (Mg2+,Са2+-ATФ-азна активність), та • .. • f~\ 2+
чутливість цієї активності до Са в присутності
хелатора іонів Ca2+ - ErTA (К+(EGTA)-ATФ-азна
активність). B ряді експериментів проводили
вимірювання зміни ATФ-азноЇ активності білкового
комплексу в присутності ряду концентрацій БBHT та
БBHT з залізом від 10-5 до 10-9 мг/мл. При цьому
інкубаційне середовище (370C) містило в першому
випадку: 2.5 мM MgC12, 0.1 мM CaCl2, 50 мM KCI,
0.28 мг/мл актоміозину, 20 мM імідазольного буферу
(pH 7.5), в другому випадку, для визначення К+-ATФ-
азної активності, замість двовалентних іонів додавали
1мМ ErTA. ATФ-азну активність AM визначали за
кількістю неорганічного фосфату (Фн), що
утворюється при гідролізі ATФ і виражали в нмоль
Фн • хв-1 • мг-1 білка [7].
Реєстрацію кінетичних кривих СПП актоміозину проводили на спектрофотометрі SPECORD М40 (Иімеччина). Кінетику процесу СПП актоміозину реєстрували за зміною оптичної густини на довжині хвилі 450 нм в 1 см кюветах при температурі 25 оС в реакційній суміші (загальний об'єм - 3 мл): 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 100 мМ KCl, 0.1мМ ErTA та 20 мМ тріс-HCl, при рH 7.5, кінцева концентрація білка -
0,2 мг/мл. Реакцію СПП актоміозину ініціювали
Шепель І.О., Шелюк О.В., Кременецька К.О.
внесенням до реакційної суміші розчину АТФ (кінцева концентрація 0,1 мМ). З отриманих кінетичних кривих значення суперпреціпітаціі розраховувалась за формулою (Dmax - D0), де D0 і Dmax є значеннями початкової та максимальної оптичної густини актоміозину. У роботі вивчали вплив БВНТ та БВНТ з залізом у концентраціях 10-5-10-9мг/мл. Статистичну обробку результатів експериментів та механокінетичний аналіз проводили в програмі Origin 8.0 (OriginLabCorporation, СшА).
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив БВНТ та БВНТ з залізом на АТФазну активність актоміозину. Отримані результати свідчать, що нанотрубки в концентраціях 10-9, 10-1 та 10-5 мг/мл підвищують показники як Mg2+,Ca2+-АТРазної, так і К+-АТРазної активності актоміозину (рис. 1, А), а саме: значення Mg2+,Ca2+-ATPазної активності зростають практично однаково на 25% відносно контролю за дії вище вказаних концентрацій БВНТ; БВНТ у концентраціях 10-9, 10-1 та 10-5 мг/мл підвищують К+-АТРазну активність на 17, 10 та 14%, відповідно, відносно контролю.
Як показано на рис. 1, B БВНТ з залізом мали концентраційну залежність та знижували АТФазну активність актоміозину в присутності ряду концентрацій від 10-5до 10-9 мг/мл. БВНТ з залізом в концентрації10-5 мг /мл справляли значний інгібуючий вплив. При 10-1 мг/мл величини активності зменшувались на 42,5% і 30% від контрольних показників. Застосування концентрацій БВНТ з залізом порядку 10-9 мг/мл призводило до пригнічення на 30% Мg2+,Са2+-ATФази і на 20% для К -АТФазної активності в порівнянні з контрольними значеннями.
Враховуючи відносні розміри актоміозину (у розчині актоміозин має вигляд циліндричної
структури, довжина якої складає 580 нм, а діаметр -116 нм) та досліджуваних наноструктур (2-5 мкм), можна припустити ймовірну взаємодію між ВНТ та активним центром актоміозинового комплексу, а саме з SH-групами, які є суттєвими в роботі цього центру
/тт* 688 а 698 т т і100 а 108\ /-
(ms - Asp та Val - Arg ), що потребує
підтвердження [8]. Це є суттєвим, оскільки такі висококонсервативні групи як SH1 i SH2 знаходяться
у складі двох
100 108
a-спіралей, в тому числі Val - Arg , які проходять під АТФ-зв'язуючим центром і є суттєвими в його роботі.
Вплив БВНТ та БВНТ з залізом на реакцію суперпреципітації актоміозину. Типові криві реакції суперпреципітації актоміозину в присутності різних концентрацій БВНТ та БВНТ з залізом як функцію часу представлені на рис. 2. Отримані результати засвідчують, що внесення у пробу БВНТ у концентраціях 10-9, 10-1 та 10-5 мг/мл спричиняє достовірне зростання величини суперпреципітації відносно контролю (рис. 2, A). За присутності 10-1 та 10-5 мг/мл БВНТ величина суперпреципітації зростає на 10 і 32% відносно контролю і становить 0.085 та
0.102 відн.од., відповідно. При використанні БВНТ у концентрації 10-9 мг/мл величина суперпреципітації майже не змінюється відносно контролю (її зростання знаходиться в межах похибки вимірювання).
Час (т), необхідний для досягнення половини величини суперпреципітації, для концентрації БВНТ 10-9 мг/мл майже не відрізнявся від контролю (10.1 хв) і становив 9.7 хв. Зі збільшенням концентрації БВНТ до 10-1 та 10-5 мг/мл значення т зростало і складало 6.5 і 8.7 хв, відповідно.
БВНТ з залізом в концентраціях 10-1 і 10-5 мг / мл знижували реакцію СПП, але при концентрації 10-9 підвищувалось значення СПП (рис. 2, Б).
160
* 120ва в
Н 100
а я я
80-
X
8 60^
Рч
^ 40-1 <
20-
0
______ 2+ 2+
І_____I Mg ,Ca -ATPазна активність
К+-ATPазна активність
* ,
*
10
1 II
II II
1 і
ш ш
10-7 10-5
Контроль
концентрація мг/мл
-Q 100
Н
О
‘ас 03 80 S н
S 60
CS
X
З 40 о. н << 20
10-9
2+ 2+
J Mg ,Ca -ATPазна активність ] К+-ATPазна активність
Контроль
10-7 10-5
концентрація мг/мл
А
В
120 -
*
£ 140-
*
*
*
*
*
*
*
*
0
Рис 1.Вплив багатостінних вуглецевих нанотрубок (БВНТ) (А)та БВНТ датованих залізом (Б) на АТФазну активність актоміозину скелетних м’язів кроля: (п=10); * - р<0.05.
АТФазна АКТИВНІСТЬ ТА РЕАКЦІЯ СУПЕРПРЕЦИПІТАЦІЇ АКТОМІОЗИНУ СКЕЛЕТНИХ МЯЗІВ ПІД ВПЛИВОМ БАГАТОСТІННИХ НАНОТРУБОК ТА БАГАТОСТІННИХ НАНОТРУБОК ДОТОВАНИХ ЗАЛІЗОМ__________________
час, хв
час, хв
А
В
Рис. 2. Типові кінетичні криві реакції суперпреципітаціїактоміозинового комплексу скелетних м’язів кроляпри різних концентраціях БВНТ (А) та БВНТ з залізом (Б) :1- контроль; 2 - 10-5; 3 - 10-7; 4 - 10-9 мг/мл.
При дослідженні впливу БВНТ з залізом встановлено, що значення т зменшувалося зі
збільшенням концентрації БВНТ з залізом від 10-9, 107 до 10-5 мг/мл відносно контролю (4.8 хв) і становило 12.1, 11.5 і 9.5 хв, відповідно.
Відомо, що загальною ознакою для більшості захворювань м’язів (прогресуючі м’язові дистрофії, атрофія м’язів, запальні міопатії, у тому числі міозит та поліміозит, тощо), які супроводжуються м’язовою слабкістю (наприклад, хронічна м’язова
втомлюваність), є різке зниження у м’язах вмісту міофібрилярних білків.[9] Також при патології м’язової тканини можна спостерігати певну
закономірність у зміні активності білків, зокрема і зниження АТФазної активності міозину.[10] У зв’язку з цим перспективне значення для подальших досліджень може мати виявлений ефект активації реакції суперпреципітації і АТФазної активності актоміозину БВНТ .
Деякі фізіологічні стани, навпаки, супроводжуються гіперактивністю м’язів. У зв’язку з цим практичне значення може мати виявлений ефект пригнічення реакції суперпреципітації і АТФазної активності актоміозину скелетних м’язів БВНТ з залізом.
Отже, за умов норми та патології цілком можлива регуляція скорочення-розслаблення скелетних м’язів за участю обох типів досліджуваних багатостінних вуглецевих нанотрубок [11].
ВИСНОВКИ
У присутності БВНТ при концентраціях 10-9, 10-7 10-5 та мг/мл підвіщувалась як Мg2 ,Са2 + -, так і К -АТФазна активність актоміозину. Найбільш чутливою виявилась Мg2+, Са2-АТФазна активність. У випадку реакції суперпреципітації актоміозіну за присутностіБВНТ у вище вказаних концентраціях виявлено дозозалежний характер їх впливу.
Найбільшу активність спостерігали за концентрації БВНТ 10-5 мг/мл. Результати дослідження БВНТ з залізом при різних концентраціях на Mg2 +,Са2 +- і К +-АТФазну активність актоміозинового комплексу виявили дозо залежний інгібуючий вплив. Більш чутливими до БВНТ з залізом виявилися Mg2 +, Ca2 +-АТФазна активність.
Виявлені протилежні ефекти - зростання реакції суперпреципітації і АТФазної активності актоміозину БВНТбез домішок та пригнічення реакції суперпреципітації і АТФазної активності актоміозину скелетних м’язів БВНТ з залізом - можна пояснити, наприклад, присутністю у складі БВНТ сполук металів (зокрема, заліза), які можуть бути
ефективними інгібіторами даних функціональних показників .
Підводячи підсумки, отримані дані свідчать про здатність обох типів БВНТ впливати на
функціонування актоміозинового комплесу та
визивають зацікавленість стосовно подальшого вивчення даних наносистем в регуляції м'язових скорочень для лікування м’язових патологій.
Література
1. Ajayan P. M., Zhou O. Z. Drug delivery and biomolecular transport // Carbon. - 2GG5. - Vol.43. - P. 389-415.
2. Гусев А.И. Наноматериалы, наноструктуры, нанотехнологии. - М.: Физматлит, 2007. - 416 с.
3. Ch. Vauthier, N. Tsapis, P. Couvreur, Nanomedicine -2011. - Vol 6. - P. 99.
4. Dresselhaus M.S.,Dresselhaus G., Avouris Ph. Carbon
Nanotubes: Synthesis, Structure, Properties and
Applications. - Springer: Berlin, 2001. - 463 p.
5. Бендолл Дж. Мышцы, молекулы и движение. - М.: Мир, 19TC. - 256 с.
6. Тартаковский А.Д. // Сб.: Биофизические и
биохимические методы исследования мышечных белков / Под.ред. ИваницкогоГ.Р. - Л.: Наука. - 1918. -С. 55-16.
1. Fiske C.H., Subbarow G. The coloremitric determination of phosphorus//J.Biol.Cem. - 1925. - Vol.66., N1.- P.315-380.
з
Шепель І.О., Шелюк О.В., Кременецька К.О.
8. Данилова В.М. Біохімічні механізми регуляції скорочення гладеньких м'язів // Биополимеры и клетка. -1996. - Т.12, №4. - С.5 - 24.
9. Поглазов Б.Г., Левицкий Д.И. Миозин и биологическая подвижность. - М.: Наука. - 1982. - 160 с.
10. Медведева Н.В., Блюменфельд Л.А., Рууге Э.К. О релаксационном характере изменения активности
некотрых ферментов при скачкообразных рН и температурных переходах // Биохимия. - 1974. - Т.39, №5. - с. 999 - 1002.
11. Parc K. N., Chhowalla M., lqbal Z., Sesti F. Single -walled carbon nanotubes are a new class of ion chanellblocers J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278, N50. - P. 50212-50216.
АТФазная АКТИВНОСТЬ И РЕАКЦИЯ СПЕРПРЕЦИПИТАЦИИ АКТОМИОЗИНА СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ ПОД ВЛИЯНИЕМ МНОГОСТЕННЫХ НАНОТРУБОК И МНОГ ОСТЕННЫХ НАНОТРУБОК ДОТИРУЕМЫХ ЖЕЛЕЗОМ
Шепель И.А, Шелюк О.В., Кременецкая К.А.
Исследовано влияние многостенных нанотрубок (БВНТ) и БВНТ датированных железом на основные функциональные показатели актомиозина скелетных мышц кролика. Выявленные противоположные эффекты БВНТ и БВНТ датированных железом на показатели реакции суперпреципитации и АТФазной активности актомиозина, что можно объяснить, например, присутствием в составе БВНТ соединений металлов (в частности, железа), которые могут быть эффективными ингибиторами данных функциональных показателей.
Ключевые слова: многостенные углеродные нанотрубки, АТФазная активность, суперпреципитация актомиозина, скелетные мышцы.
ATPase ACTIVITY AND SUPERPRECIPITATION ACTOMYOSIN OF SKELETAL MUSCLES UNDER THE INFLUENCE MULTI-WALLED CARBON NANOTUBES AND MULTI-WALLED IRON-FILLED CARBON NANOTUBES
Shepel I.O., Shelyuk O.V., Kremenetska K.O.
The influence multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) and multi-walled iron-filled carbon nanotubes on the basic functional parameters actomyosin rabbit skeletal muscle. Identified opposite effects MWCNTs and Fe-MWCNTs on performance and superprecipitation and ATPase actomyosin activity, which may explain, for example, in the presence MWCNTs metal compounds (such as iron) that may be effective inhibitors of data functional parameters.
Key words: carbon nanotubes, ATPase activity, superprecipitation, actomyosin.
