CC BY
83
© коллектив авторов, 2013
УДк 616.71-006.04-092:612.6.05]-07
Н.Е. Кушлинский, Ю.С. Тимофеев, Э.в. Генерозов, в.А. Наумов, Ю.Н. Соловьев, И.в. Булычева, М.Д. Алиев
ассоциации одиночных нуклеотидных полиморфизмов со злокачественными и пограничными опухолями костей
ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Новообразования костей - редкая группа заболеваний, этиология и патогенез которых остаются неизученными. Нами исследованы ассоциации 6 одиночных нуклеотидных полиморфизмов rs7921(GH1), rs7956547(IGF1), rs3761243(GNRH2), rs11737764(FGF2), rs6599400(FGFR3), rs1690916(MDM2) на выборке больных с новообразованиями костей. Выявлены ассоциации ряда нуклеотидных полиморфизмов (IGFLrs7956547, GNRH2.rs3761243, FGFR3.rs6599400) у больных с злокачественными и пограничными опухолями костей.
Ключевые слова: опухоли костей; одиночные нуклеотидные полиморфизмы
Опухоли костей - редкая, но сложная в диагностике и лечении группа онкологических заболеваний. Этим заболеваниям свойственны быстрое течение, высокий метастатический потенциал и в ряде случаев неблагоприятный прогноз. Среди злокачественных опухолей костей наиболее распространенной является остеосар-кома, реже диагностируются хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная фиброзная гистиоцитома, а пограничные представлены гигантоклеточной опухолью кости. Лабораторные методы диагностики и мониторинга опухолей костей в настоящий момент играют вспомогательную роль вследствие низкой специфичности.
Генетические исследования открывают перспективы для разработки в ближайшем будущем методов раннего выявления опухолей костей, прогнозирования их течения и ответа на химиотерапию. Отдельным классом стоят геномные исследования. Несмотря на малую изученность роли наследственного компонента в развитии новообразований костей, предполагается, что генетические механизмы играют важную роль в патогенезе данной группы онкологических заболеваний.
Одним из методов выявления геномных вариаций является изучение одиночных нуклеотидных изменений и их ассоциация с заболеванием и его особенностями. Точечные нуклеотидные полиморфизмы могут не быть прямой причиной развития той или иной патологии, однако способны модулировать риск развития определенных заболеваний в комплексе с рядом других факторов. Выявление подобных полиморфизмов позволит улучшить понимание этиологии и патогенеза заболевания, а в перспективе использовать для разработки предиктив-ных тестов.
Достаточно значимым в данной области является исследование, проведенное L. Mirabello и соавт. при помощи чипа "Custom Infinium BeadChip", в ходе которого получены данные о 4836 точечных нуклеотидных полиморфизмах в 255 кандидатных генах на выборке из 96 случаев остеогенной саркомы. Наличие достоверных полиморфизмов получено для генов MDM2, MPG, FGF2, FGFR3, GNRH2, IGFI [11].
В работе, проведенной нами ранее [1] методом ми-кросеквенирования, подтверждены ассоциации с поли-
Для корреспонденции:
Кушлинский Николай Евгеньевич, д-р мед. наук, проф., член-корр. РАМН, зав. лаб. клин. биохимии Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24 E-mail: [email protected]
морфизмами в генах FGFR3 и MDM2 на выборке из 66 пациентов с различными опухолями костей. В работе D. Caronia и соавт., в которой включены 102 пациента с остеогенной саркомой, изучены 346 одиночных нуклеотидных полиморфизмов. В результате авторы выявили полиморфизмы, связанные с общей выживаемостью: один полиморфизм в гене ABCC3 и три полиморфизма в гене ABCB1 [2].
Исследование, проведенное Sh.A. Savage и соавт., включало изучение 52 нуклеотидных полиморфизмов в 13 генах и проводилось с участием 104 пациентов с диагнозом остеогенной саркомы. В ходе исследования авторы выявили 2 полиморфизма в гене IGF2R, которые ассоциированы с риском развития остеогенной саркомы по сравнению с нормальным контролем [16].
В работе J. Wang и соавт. [19] в китайской популяции из 158 пациентов с саркомой Юинга подробно изучен полиморфизм в гене CD86, влияющий на Т-клеточный ответ при этой опухоли. Результаты исследования показали ассоциацию полиморфизма +1057 G/F в гене CD86 с повышенной предрасположенностью к саркоме Юинга в случае наличия генотипа А или АА.
Вместе с тем ассоциации нуклеотидных полиморфизмов у больных с новообразованиями костей считаются малоизученной проблемой и настоятельно необходимы дальнейшие исследования на больших выборках в различных популяциях.
Цель настоящего исследования - изучение влияния изменений в генах, отвечающих за рост и развитие костей, GH1, IGF1, GNRH2, FGF2, FGFR3 и репарации MDM2 и выявление ассоциаций нуклеотидных полиморфизмов rs7921(GH1), rs7956547(IGF1), rs3761243(GNRH2), rs11737764(FGF2), rs6599400(FGFR3), rs1690916(MDM2) среди пациентов российской популяции с различными новообразованиями костей, валидация данных предшествующих исследований на большей выборке.
Материалы и методы. В исследование включены 119 пациентов c различными новообразованиями костей: остеосаркома - 43, саркома Юинга - 6, хондросаркома -40, злокачественная фиброзная гистиоцитома - 2, фибросаркома - 1, лимфома кости - 1, хордома - 1, ги-гантоклеточная опухоль - 25. Обследование и лечение пациентов проводили в хирургическом отделе общей онкологии НИИ клинической онкологии ФГБУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН. Контрольную группу составили 93 человека без онкологических заболеваний. В группу новообразований костей вошло 58 мужчин и 61 женщина в возрас-
БИОМАРКЕРЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ФОРМАХ ПАТОЛОГИИ
те от 16 до 64 лет. Контрольную группу составили 93 практически здоровых людей соответствующего пола и возраста.
Геномная ДНК была выделена из 5 мл лейкоцитарной фракции крови при помощи набора Wizard Genomic DNA Purification Kit ("Promega", США) в соответствии с инструкцией производителя.
Аллели полиморфизмов выявили в ходе реакции мини-секвенирования с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов реакции на время-пролетном масс-спектрометре (MALDl-TOF ми-нисеквенирование) Autoflex III ("Bruker Daltonics").
Перед анализом область ДНК, несущая полиморфизмы, была амплифицирована в ходе ПЦР Амплификацию проводили в реакционной смеси, содержащей 66 мМ Трис-HCl, рН 9,0, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgCl2, по 100 мкМ каждого дНТФ, 1 Ед Taq-полимеразы ("Promega", США) и по 2 пмоля каждого праймера в объеме 10 мкл. Реакцию проводили в амплификаторе DNA Engine Tetrad 2 ("MJ Research Inc.", Канада), она включала 35 циклов амплификации в температурном режиме: 94°С - 15 с, 58°С - 15 с, 72°С - 16 с.
Перед мини-секвенированием проводили дефосфо-рилирование концевых фосфатных групп дНТФ в по-стамплификационной смеси посредством инкубации при 37°С в течение 30 мин с добавленной в смесь 1 Ед фосфатазы из антарктической креветки ("New England BioLabs", Великобритания), после чего проводили инактивацию фермента прогреванием при 85°С в течение 10 мин.
Статистическую обработку данных генотипирования производили в программе RStudio [17] с использованием пакета SNPAssoc для R [7].
Результаты и обсуждение. Проанализировали 6 нуклеотидных полиморфизмов (табл. 1), 5 из которых локализованы в генах, участвующих в росте и формировании костной ткани: rs7921(GH1), rs7956547(IGF1), rs3761243(GNRH2), rs11737764(FGF2), rs6599400(FGFR3) и один полиморфизм в области гена контроля клеточного цикла rs1690916(MDM2). Распределение частот генотипов в контрольной группе не отклоняется от распределения, предсказываемого законом Харди-Вайнберга.
Проведенный анализ сравнения частот генотипов пациентов со злокачественными и пограничными новообразованиями костей и контрольной группы выявил достоверные ассоциации (p<0,05) с рядом полиморфизмов при использовании указанных ниже генетических моделей.
Первое достоверное (p=0,003) различие в распределении частот аллелей между больными с новообразованиями костей и контрольной группой выявили для полиморфизма IGF1.rs7956547, расположенного в гене, ко-
Таблица 1
Исследованные полиморфизмы
Функциональная группа гена Ген (символ гена) Идентификатор полиморфизма в базе данных dbSNP NCBI
Гены, уча- Гормон роста 1-го типа ^Н1) rs7921
ствующие в росте и формировании кости Инсулиноподобный фактор роста 1-го типа (ЮР1) Гонадотропин-рилизинг-гормон 2-го типа (GNRH2) rs7956547 rs3761243
Фактор роста фибробластов 2 типа (FGF2) rs11737764
Рецептор фактора роста фибробластов 3-го типа (FGFR3) rs6599400
Контроль клеточного цикла Гомолог мышиного MDM2 р53 связывающего белка ^М2) rs1690916
дирующем инсулиноподобный фактор роста 1 (ИФР-1). Согласно рецессивной модели наследования, аллелем риска является аллель С, соотношение шансов 3,28.
Следующее достоверное различие (р=0,04) в распределении частот аллелей между больными с новообразованиями костей и контрольной группой выявлено для полиморфизма GNRH2.rs3761243, расположенного в гене, кодирующем изоформу гонадотропин-рилизинг-фактора 2 (GNRH-2). Исходя из доминантной модели наследования, аллель С является протективным аллелем с соотношением шансов 0,54.
Третье достоверное различие (р=0,03) выявлено в распределении частот аллелей между группой больных с опухолями костей и контрольной группой, характерно для полиморфизма FGFR3.rs6599400, локализованного в гене, кодирующем рецептор фактора роста фибробластов-3 (FGFR3). Согласно доминантной модели наследования, аллель А является аллелем риска с соотношением шансов 2,15. Выявленные нами ассоциации представлены в табл. 2.
Необходимо отметить, что данные полиморфизмы находятся в промотерных областях генов, не вызывают аминокислотных замен в белках, но могут влиять на уровень экспрессии, изменяя участки связывания регу-ляторных элементов генома и таким образом косвенно влиять на экспрессию того или иного фактора.
Выявленные ассоциации полиморфизмов генов IGF1, FGFR3 и GNRH2 с развитием опухолевого процесса позволяют предположить о влиянии полиморфизмов в промотерных зонах данных генов на их экспрессию, которая сдвигает равновесие в сторону образования и про-
Таблица 2
Выявленные ассоциации с развитием злокачественных и пограничных опухолей костей
Полиморфизм Модель Генотипы Контроль, % Злокачественные, % Отношение шансов [доверительный интервал] P-value
IGF1.rs7956547 Rec t/t-c/t 87,5 68,1 3,28[1,42-7,54] 0,003
c/c 12,5 31,9
GNRH2.rs3761243 Dom a/a 35,7 50,5 0,54[0,3-0,99] 0,04
a/c-c/c 64,3 49,5
FGFR3.rs6599400 Dom c/c 45,3 27,9 2,15[1,06-4,34] 0,03
a/c-a/a 54,7 72,1
грессирования опухоли. Продукты этих генов, так или иначе, вовлечены в процессы онкогенеза.
ИФР-1, кодируемый геном IGF1, является пусковым фактором целой ИФР-системы, которая играет важную роль в туморогенезе различных типов и субтипов сарком [13].
Сигнализация ИФР-1 увеличивает экспрессию генов циклина D1 и циклинзависимой киназы-4 (CDK4), а также приводит к активации циклина Е [5]. Кроме того, ИФР-1 обладает антиапоптотическими свойствами [21]. ИФР-1 и инсулин играют важную роль в процессе неоангиогенеза, усиливая влияние VEGF, посредством запуска гипоксически-индуцируемого фактора-1а (НШ-1а) [6].
Система ИФР посредством целой сети нижележащих факторов может активировать процессы инвазии и метастазирования, стимулируя при этом продукцию матриксных металлопротеиназ: ММР-2 [20], МмР-7 [8], ММР-9 [15] и их активацию. Так, например, в тканях остеосаркомы и ее клеточных линиях выявлена повышенная экспрессия ИФР-1 [4], а клетки саркомы Юинга зависят от сигналов рецептора ИФР-1Р [12].
Таким образом, можно предполагать, что изменение в экспрессии гена IGF1, связанное с наличием одиночного нуклеотидного полиморфизма, может быть одним из факторов развития остеосаркомы.
Ген GNRH2 кодирует изоформу гонадотропин-рилизинг-гормона (GNRH-II), который вовлечен в развитие некоторых злокачественных новообразований [9, 10]. Дальнейшие исследования могут выявить значение полиморфизма в гене GNRH2 у больных с опухолями костей.
FGFR3 кодирует рецептор фактора роста фибробла-стов 3. В литературе представлены данные об участии этого рецептора в развитии пограничной гигантоклеточ-ной опухоли кости [14], а также при ряде других злокачественных новообразованиях [3, 18].
Выявленные в нашем исследовании ассоциации полиморфизмов в генах FGFR3, IGF1, GNRH2 подтверждают данные L. МтаЬеПо и соавт. [11] относительно рассмотренных генов, но уже в российской популяции пациентов, а также показывают наличие ассоциаций не только в группе больных с остеосаркомой, но и указывают на наличие ассоциаций в группе, включающей различные злокачественные и пограничные новообразования костей.
Таким образом, в ходе настоящего исследования выявлены ассоциации ряда нуклеотидных полиморфизмов (IGF1.rs7956547, GNRH2.rs3761243, FGFR3.rs6599400) у больных со злокачественными и пограничными опухолями костей. Обнаружены аллели риска и протектив-ный аллель. Изученные полиморфизмы расположены в генах, продукты которых отвечают за рост и формирование кости, а также способствуют прогрессированию опухолевого процесса в кости. Это позволяет предположить об их вовлеченности в формирование предрасположенности к данной группе заболеваний. Последующие исследования в этой области в перспективе могут прояснить механизмы влияния полиморфизмов на работу этих генов, а также служить основой для разработки методов выявления предрасположенности к развитию новообразований костей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Naumov V.A., Generozov E.V., Solovyov Y.N., Aliev M.D., Kushlinsky N.E. Association of FGFR3 and MDM2 gene nucleotide polymorphisms with bone tumors. Bull. Exp. Biol. Med. 2012; 153 (6): 869-73.
2. Caronia D., Patino-Garcia A., Perez-Martinez A. et al. Effect of ABCB1 and ABCC3 polymorphisms on osteosarcoma survival after chemotherapy: a pharmacogenetic study. PLoS One. 2011; 6 (10): e26091. Epub 2011 Oct 7.
3. Chesi M., Brents L.A., Ely S.A. et al. Activated fibroblast growth factor receptor 3 is an oncogene that contributes to tumor progression in multiple myeloma. Blood. 2001; 97 (3): 729-36.
4. Conover C.A. Insulin-like growth factor-binding proteins and bone metabolism. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2008; 294: 10-4.
5. Dupont J., Pierre A., Froment P., Moreau C. The insulin-like growth factor axis in cell cycle progression. Horm. Metab. Res. 2003; 35: 740-50.
6. Fukuda R., Hirota K., Fan F. et al. Insulin-like growth factor 1 induces hypoxia-inducible factor1-mediated vascular endothelial growth factor expression, which is dependent on MAP kinase and phosphatidylinositol 3-kinase signaling in colon cancer cells. J. Biol. Chem. 2002; 277: 38205-11.
7. Gonzalez J.R., ArmengolL., SoleX. et al. SNPassoc: an R package to perform whole genome association studies. Bioinformatics. 2007; 23 (5). 644-5.
8. Hemers E., Duval C., McCaig C. et al. Insulin-like growth factor binding protein-5 is a target of matrix metalloproteinase-7: implications for epithelial-mesenchymal signaling. Cancer Res. 2005; 65: 7363-9.
9. Kang S.K., Choi K.C., Yang H.S., Leung P.C. Potential role of gonad-otrophin-releasing hormone (GnRH)-I and GnRH-II in the ovary and ovarian cancer. Endocr. Relat. Cancer. 2003; 10 (2): 169-77.
10. Limonta P., Moretti R.M., Montagnani Marelli M., Motta M. The biology of gonadotropin hormone-releasing hormone: role in the control of tumor growth and progression in humans. Front Neuroendocrinol. 2003; 24 (4): 279-95.
11. MirabelloL., YuK., BerndtS.I. et al. A comprehensive candidate gene approach identifies genetic variation associated with osteosarcoma. BMC Cancer. 2011; 11: 209.
12. RiggiN., CironiL., ProveroP et al. Development of Ewing's sarcoma from primary bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Cancer Res. 2005; 65: 11459-68.
13. Rikhof B., de Jong S., Suurmeijer A.J. et al. The insulin-like growth factor system and sarcomas. J. Pathol. 2009; 217: 469-82.
14. Robinson D., Segal M., Nevo Z. Giant cell tumor of bone. The role of fibroblast growth factor 3 positive mesenchymal stem cells in its pathogenesis. Pathobiology. 2003; 70 (6): 333-42.
15. Samani A.A., Yakar S., Le Roith D., Brodt P. The Role of the IGF System in Cancer Growth and Metastasis: Overview and Recent Insights. Endocrine Reviews. 2007; 28 (1): 20-47.
16. Savage S.A., Woodson K., Walk E. et al. Analysis of Genes Critical for Growth Regulation Identifies Insulin-like Growth Factor 2 Receptor Variations with Possible Functional Significance as Risk Factors for Osteosarcoma. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2007; 16: 1667-74.
17. Team R.D.C.R. A Language and Environment for Statistical Computing. 2008.
18. Van Rhijn B.W., van Tilborg A.A., Lurkin I. et al. Novel fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) mutations in bladder cancer previously identified in non-lethal skeletal disorders. Eur. J. Hum. Genet. 2002; 10 (12): 819-24.
19. Wang J., Zhou Y., Feng D et al. CD86 +1057G/A polymorphism and susceptibility to Ewing's sarcoma: a case-control study. DNA Cell Biol. 2012; 31 (4): 537-40.
20. Zhang D., Brodt P. Type 1 insulin-like growth factor regulates MT1-MMP synthesis and tumor invasion via PI3-kinase/Akt signaling. Oncogene. 2003; 22: 974-82.
21. Zhuang D., Ceacareanu A.C., Lin Y. et al. Nitric oxide attenuates insulin-or IGF-I-stimulated aortics mooth muscle cell motility by decree sing H2O2 levels: Essential role of cGMP. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2004; 286: 2103-12.
Поступила 01.07.13
