Апоптоз лимфоцитов как возможный механизм нарушения антигенспецифического ответа при туберкулезе легких Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская иммунология 2001, Т. 3, N9 1, стр 51-59 © 2001, СПб РО РААКИ

Оригинальные статьи

АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ КАК ВОЗМОЖНЫЙ МЕХАНИЗМ НАРУШЕНИЯ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО ОТВЕТА ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЛЕГКИХ

Хонина H.A., Сахно Л.В., Норкин М.H., Норкина О.В., Мостовая Г.В.*, Никонов С.Д.*, Огиренко А.П.*, Останин A.A., Черных Е.Р.

Научно-исследователъсикй иститут клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

* Легочно-хирургическая специализированная больница №1, г. Новосибирск

Резюме. Возникновение и характер течения туберкулезной инфекции во многом зависит от эффективности функционирования иммунной системы, в том числе формирования антигенспецифического ответа. Больные туберкулезом (ТБ) легких характеризуются нарушением антигенспецифического ответа, что проявляется дефектом пролиферативного ответа периферических лимфоцитов и продукции интерлейкина-2 и интерферона-гамма при стимуляции PPD (туберкулиновый очищенный белковый дериват) и формированием кожной туберкулиновой анергией. Настоящая работа посвящена характеристике проявления туберкулиновой ареактивности у больных с различными клиническими формами туберкулеза легких и исследованию PPD-индуцированного апоптоза как одного из возможных механизмов нарушения антигенспецифического ответа. Оценка PPD-стимулированного пролиферативного ответа в культурах мононуклеарных клеток (МНК) больных ТБ выявила наличие двух оппозитных типов реагирования. В 52,3% случаев больные характеризовались повышенным ответом на PPD по сравнению со здоровыми донорами. Напротив, у 46,7% больных регистрировалось глубокое угнетение ответа. Нарушение антигенспецифического ответа ассоциировалась с наличием неспецифической иммуносупрессии, которая проявлялась подавлением пролиферативной активности МНК при стимуляции конканавалином А или анти-СОЗ-антителами. Снижение пролиферации при поликлональной стимуляции отмечалось также в группе PPD-реактивных больных, что ставит под сомнение роль неспецифической иммуносупрессии в качестве ведущей причины нарушения антигенспецифического ответа. С другой стороны, исследование апоптоза выявило существенное усиление спонтанной и PPD-индуцированной гибели лимфоцитов в группе PPD-ареактивных больных и наличие достоверной обратной корреляционной зависимости между уровнем апоптоза и PPD-стимулированным ответом. Повышенный апоптоз был сопряжен с увеличением относительного содержания Fas*-лимфоцитов, причем содержание Fas+-KneTOK обратно коррелировало с уровнем PPD-стимулированной пролиферации. Наличие PPD-ареактивности ассоциировалось с более тяжелым клиническим течением туберкулеза легких (преобладание фиброзно-кавернозной формы, наличие синдрома эндогенной интоксикации, большая давность заболевания). Оценка кожной туберкулиновой пробы выявила угнетение реакции ГЗТ у 28% больных, в том числе ее полное отсутствие в 8% случаев. Сопоставление уровня PPD-стимулированного пролиферативного ответа с выраженностью кожной туберкулиновой реакции не выявило прямой достоверной корреляционной зависимости. Тем не менее, у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом более выраженное угнетение кожной туберкулиновой пробы ассоциировалось с большим угнетением пролиферативного ответа на PPD. Характерно, что, в отличие от PPD-ареактивпости периферических лимфоцитов, снижение кожной туберкулиновой реакции не коррелировало с уровнем апоптоза. Полученные данные позволяют предположить, что угнетение анти-

Адрес для переписки:

6300091, г. Новосибирск, Ядрипцевская ул., д. 14, Институт клинической иммунологии СО РАМН, Черных Е.Р.

Тел.: 3832-282101, факс: 3832-227028 E-mail: ctlab @ drbit.ru

генспецифического ответа периферических лимфоцитов связано с усилением апоптоза РРО-реактивных лимфоцитов, в то время как нарушение ГЗТ реализуется с участием иных, апоптоз-пезависимых механизмов.

Ключевые слова: апоптоз, лимфоциты, PPD, туберкули новая анергия, туберкулез.

Khonina N.A., Sahno L. V., Norkin M.N., Norkina О. V, Mostovaya G. К* Nikonov S.D. *, Ogirenko A.P. *,

Ostanin A.A., Chernykh H.R.

APOPTOSIS AS A POSSIBLE MECHANISM OF IMPAIRED ANTIGEN-SPECIFIC RESPONSE IN PULMONARY TUBERCULOSIS

Abstract. Infection with Micobacterium tuberculosis and clinical outcome of tuberculosis is known to depend on protective immunity involving interactions between antigen-specific CD4 and CD8 T lymphocytes and cells of mono-cyte-macrophage lineage. Antigen-specific T cell response is often impaired in active pulmonary tuberculosis as evidenced by both in vitro depressed proliferative response and production of interferon-y and interleukin-2 to tuberculine purified protein derivative (PPD) and decreases tuberculin skin test reactivity in vivo. To investigate the phenomenon of tuberculin unresponsiveness and its possible mechanisms we studied PPD-stimulated proliferative response and lymphocyte apoptosis in patients with different forms of pulmonary tuberculosis. Patients with pulmonary tuberculosis displayed two opposite kinds of response to PPD. In 52,3% of cases the response to PPD was increased as compared to healthy tuberculin-reactive individuals. In 46,7% of cases the proliferative response was depressed. Antigen-specific unresponsiveness was accompanied by the signs of non-specific immune depression indicated by the increased response to ConA or to anti-CD3-mAb. PPD-reactive patients also exhibited depressed proliferative response to polyclonal stimulation. That is why we believe that alteration of PPD-reactivity reflects intrinsic T-cell defect rather than non-specific immunosuppression. Actually, in PPD-unresponsive patients fresh isolated and PPD-stimulated lymphocytes displayed a significantly enhanced apoptosis. Moreover, a reverse correlation between apoptosis and PPD-stimulated was revealed. Increased apoptosis could be linked to the Fas system. Increased apoptosis levels correlated with the enhanced level of Fas+-lymphocytes. At the same time increased FasMymphocyte levels negatively correlated with reduced proliferative response to PPD. In vitro PPD-unresponsiveness was associated with more severe disease course. Decreased dermal reactivity to intradermal injection with PPD (tuberculin skin test < 10 mm) or its absence occurred in 28% and 8% of patients correspondently. There was no direct correlation between tuberculin skin test and PPD-proliferative response. Nevertheless, in patients with more advanced pulmonary tuberculosis decreased delayed-type hypersensitivity reaction was associated with decreased proliferation in response to PPD. In contrast to PPD-unresponsiveness of peripheral blood mononuclear cells, tuberculin skin anergy did not correlate with spontaneous or PPD-stimulated apoptosis. These findings suggest that in vitro PPD-unresponsiveness may be associated with the increased apoptosis whereas tuberculin skin anergy underlying mechanism(s) are apoptosis independent. (Med.Immunol2001, vol.3, N1, pp 51-59)

го типа (ГЗТ) на специфический антиген-туберкули-новый очищенный белковый дериват (purified protein derivative, PPD). Кожная ареактивность на введение туберкулина часто выявляется у больных ТБ па фоне тяжелых сопутствующих заболеваний, таких как дифтерия, корь, ВИЧ-инфекция, онкологические заболевания [4,25], а также может развиваться у больных с активной формой ТБ, не осложненной тяжелыми соматическими заболеваниями [1J. Нарушение антигенспецифического ответа in vitro проявляется угнетением пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови и уровня продукции интерлейкина-2 (IL-2) и интерферона-гамма (IFN-y) при стимуляции PPD [14, 21].

Причины дефекта антигенспецифического ответа остаются во многом невыясненными. Нарушение PPD-стнмулированиого ответа при туберкулезе, по мнению ряда авторов, связано с наличием неспецифической иммуносупрессии, опосредованной Т-клетками и моноцитами [9, 22]. Подавление in vitro PPD-стимулированного пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови может быть также обусловлено перераспределением антигенреак-тивных клеток и сосредоточением (компартмента-лизациеп) их в очаге инфекции [18, 22]. Кроме того, в последние годы высказывается мысль о возможной делеции антигенреактивных клеток вследствие активационно-индуцированного апоптоза[6, 13].

В настоящее время туберкулез занимает ведущее место в структуре смертности от инфекционных заболеваний. Согласно мировой статистике ежегодно от туберкулеза погибают 3 млн. человек [2,25]. Стремительный рост заболеваемости туберкулезом (ТБ) обусловлен несколькими причинами, включая отсутствие эффективных вакцин и множественную лекарственную резистентность возбудителей ТБ. Кроме того, до сих пор отсутствуют четкие представления об иммунопатогенезе туберкулезной инфекции и, в частности, понимание того, каким образом микобактериям туберкулеза удается преодолеть иммунный надзор. Многочисленными исследованиями показано, что наряду с признаками активации течение ТБ легких сопряжено с развитием Т-клеточ-ной иммуносупрессии, выраженность которой во многом определяет риск неблагоприятного исхода заболевания [15, 21, 22, 25]. В этой связи изучение механизмов формирования иммунной недостаточности, в том числе нарушений антигенспецифического ответа, представляется важным аспектом, являясь основой для разработки новых методов прогноза течения и лечения ТБ.

Одним из проявлений дефекта клеточного иммунитета у больных туберкулезом легких является кожная туберкулиновая анергия, обусловленная угнетением реакции гиперчувствительности замедленно-

Является ли кожная анергия и ареактивность циркулирующих лимфоцитов строго сопряженными процессами и обусловленными едиными механизмами, - до сих пор не ясно. Разноречивой остается также трактовка значимости туберкулиновой анергии в развитии туберкулезной инфекции. Учитывая вышесказанное, целью нашей работы явилось исследование феномена туберкулиновой анергии у больных с различными клиническими формами туберкулеза легких и изучение роли апоптоза как возможной причины дефекта PPD-стимулированного пролиферативного ответа Т-лимфоцитов.

Материалы и методы

В исследование были включены 57 больных туберкулезом легких и 47 здоровых доноров. Контрольная (доноры) и основная (больные ТБ) группы были однородны по возрасту и полу. Группа обследованных больных включала пациентов с иифильт-ративная формой ТБ (28), очаговой формой (2), туберкулемой (2) и фиброзно-кавернозным ТБ (23). На момент обследования у 26 больных имелись выраженные признаки интоксикации (слабость, потливость, лихорадка, снижение веса, бактериовыделе-ние). Частью клинического обследования больных явилось проведение туберкулинового кожного теста (пробы Манту) по стандартной методике с внут-рикожным введением 2ТЕ очищенного туберкулина (ППД, РАО Биопрепарат, Санкт-Петербург) в область внутренней поверхности средней трети предплечья. Интерпретацию полученных результатов проводили через 72 ч, при этом кожный тест считался положительным, если диаметр папулы превышал 10 мм. Полное отсутствие ипдурацпи или величина папулы от 1 до 10 мм свидетельствовали о наличии у больного состояния туберкулиновой анергии или гипореактивности, соответственно.

Мононуклеариые клетки выделяли из периферической крови стандартно в градиенте плотности фиколла-верографина. Клетки в концентрации 1,0 х 105/лунку культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований в среде RPM1-1640 (Sigma), дополненной 0,3 мг/мл глютамина, 5мМ Hepes-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% инактивированной сыворотки доноров AB(IY) группы. Для стимуляции клеток использовали очищенный туберкулин (purified protein derívate, PPD; РАО Биопрепарат, г. С.-Петербург) в дозах 100, 50 и 5 мкг/мл, копканавалин А (Кон A, Sigma) в дозе 15 мкг/мл и моноклональные анти-СБЗ-антитела (CD3-MAT, Медбиоспектр, г. Москва) в дозе 1мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина (1 мкКю/лунку), вносимого за 18 часов до окончания культивирования. Процентное содержание апопто-тических клеток определяли на проточном цитоф-

люориметре (FACS, Becton Dickinson). Клетки инкубировали в течение 1 часа с флюоресцеин диацетатом (FDA, 0,2 мкг/мл), после чего добавляли про-пидиум иодид (PI, 4 мкг/мл). Живые клетки, за счет превращения внутриклеточными эстеразами FDA во флюоресцирующий зеленым флюоресцеин, хара-теризовались как FDA\PI. Мертвые клетки, за счет внутриклеточного проникновения Р1 с последующим связыванием с ДНК или РНК и формированием комплекса с красным флюоресцентным окрашиванием, характеризовались как FDA ,Р1+. Клетки в состоянии апоптоза, сохраняющие структурность мембраны, но не гидролизующие FDA, оставались соответственно FDA,PI\

Относительное содержание лимфоцитов, экспрессирующих Fas антиген, определяли также на проточном цитофлюориметре, используя моноклональные антитела LT95 (Сорбент, Москва).

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы Statistica 5.0.

Результаты

Оценка пролиферативной активности в группе 14 PPD-реактивных доноров (с положительной кожной пробой на туберкулин) показали (рис. 1), что к 6 суткам культивирования значимый пролиферативный ответ МНК выявлялся при стимуляции PPD в дозе 50 мкг/мл (р<0,05). Увеличение дозы PPD до 100 мкг/мл приводило дополнительно к 2-кратному возрастанию ответа (р<0,05). При этом индекс, стимуляции варьировал от 2,8 до 7,0, составляя в среднем 5,0 ± 0,36. В целом по группе показатели пролиферативного ответа МНК больных ТБ па все используемые дозы PPD достоверно не отличались от таковых у здоровых доноров. Тем не менее, анализ индивидуальных значений пролифе-

□ Доноры ■ Больные ТБ

5 50

РРР (мкг/мл)

Рис. 1. РРО-стимулированный пролиферативный ответ в группах здоровых доноров и больных туберкулезом легких.

МНК здоровых доноров (п=14) и больных ТБ (п=16) культивировали с различными дозами РРО. Интенсивность пролиферации оценивали радиометрически на 6 сутки.

* - достоверность различий (р<0,05) по сравнению с уровнем спонтанной пролиферации

ративной активности выявил наличие двух оппозит-ных типов реагирования. Так, у части больных МНК характеризовались высоким уровнем ответа па РРО, в то время как у другой - глубоким угнетением РРО-стимулированной пролиферации. Это позволило разделить всех больных на 2 категории - группу РРО-ареактивных и РРО-реактивных больных. В первую группу вошли пациенты с уровнем ответа, не превышающим нижней границы нормативного диапазона (уровень РРО-стимулированной пролиферации <5300 имп/мин, индекс стимуляции <2,7). Вторую группу составили больные с уровнем ответа выше нижней границы нормативных значений. Из 44 обследованных больных РРО-ареактивность была выявлена у 21 пациента (47,7%). Соответственно, 23 пациента (52,3%) составили группу РРО отвечающих больных. Данные, характеризующие пролиферативный ответа МНК на различные дозы РРО в указанных группах, представлены на рис.2. Индекс стимуляции РРО у пациентов первой группы составил в среднем 1,1 ± 0,1, тогда как у пациентов 2-й группы - 10,0 ± 2,0, что в 2 раза превышало аналогичный показатель у здоровых доноров (р<0,01).

Чтобы выяснить, является ли снижение пролиферативного ответа на РРО свидетельством неспецифической иммуносупрессии или отражает исключительно дефект антигенспецифического ответа, наряду с РРО-стимулированной пролиферацией было проведено исследование пролиферативной

5 50

РРО мкг/мл

100

Рис. 2. Антигенспецифический пролиферативный ответ в группах РРО-ареактивных и РРО-реактивных больных туберкулезом легких.

ТБ1 - группа РРО-ареактивных больных; ТБ2 - группа РРО-реактивных больных.

* - достоверность различий (р<0,05) по сравнению со здоровыми донорами.

активности МНК в культурах, стимулированных Кон А или СОЗ-мАТ (табл. 1). Снижение пролиферативного ответа на КонА и СОЗ-мАТ отмечалось в обеих исследуемых группах и было более выраженным в группе РРО-ареактивных больных, однако достоверных различий в уровне КонА- или анги-СОЗ-стимулированного ответа между пациентами оппозитных групп не выявлялось. Кроме того, важно подчеркнуть, что угнетение пролиферативного ответа при поликлональной стимуляции Т-клеток в группе РРО-реактивных больных сочеталось с повышенным ответом на РРО. Таким образом, мож-

Табл. 1. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ ОТВЕТ НА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫЕ АКТИВАТОРЫ В ГРУППАХ БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ, ОППОЗИТНЫХ ПО РЕАКТИВНОСТИ К ТУБЕРКУЛИНУ

Стимул Доноры (п=14) РРО-ареактивные больные (п=12) РРО-реактивные больные (п=13)

РРО 9046 ± 933 2350 ± 220* 14510 ± 32068*#

Кон А 59900 ± 3900 18215 ± 3085* 25740 ± 3722*

Анти-СРЗ-мАТ 28350 ± 1800 14934 ± 2654* 19613 ± 2237

Примечание: интенсивность пролиферации (имп/мин) оценивали радиометрически на 6 сутки при стимуляции РРО (100 мкг/мл) и на 3 сутки при стимуляции КонА (15 мкг/мл) или анти-СОЗ-антителами (1 мкг/мл). Данные представлены в виде М ± Б.Е.

* - достоверность различий (р<0,05) по сравнению со здоровыми донорами;

# - достоверность различий между группами больных.

Табл. 2. АП0ПТ03 ЛИМФОЦИТОВ В ГРУППАХ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

МНК Доноры (п=11) Общая группа больных (п=24) РРО-ареактивные больные (п=12) РРО-реактивные больные (п=12)

Свежевыделенные 2,2 ± 0,4 5,7 ± 1,2* 9,0 ± 3,4* 3,9 ± 0,9

Нестимулированные 5,3±1,0 8,3 + 0,9* 9,9 ± 1,9* 5,5 ± 1,2#

РРО-стимулированные 5,1 ±1,2 11,9 ± 1,6* 22,0 ± 5,3* 8,5 ± 1,3#

Примечание: процентное содержание апоптотических лимфоцитов определяли методом проточной цитометрии среди свежевыделенных МНК, в 24-часовых культурах нестимулированных и РРй-стимулированных МНК. Данные представлены в виде М ± Б.Е. *, # - достоверность различий значений (р<0,05) по сравнению с донорами и между группами РРО-реактивных и РРО-ареактивных больных, соответственно.

по предположить, что снижение PPD-стимулиро-ванной пролиферации МНК больных туберкулезом легких не является следствием неспецифической иммуносупрессии и, скорее, отражает “внутренний” дефект антигенспецифического ответа.

Согласно данным литературы нарушение антигенспецифического ответа при инфекции может быть обусловлено апоптозом антиген^эеактивных клеток. Чтобы выяснить возможную причастность апоптоза к нарушению PPD-стимулированного ответа в следующей серии экспериментов было проведено сравнительное исследование спонтанного и PPD-индуцированного апоптоза лимфоцитов в группе туберкулин-рсактивных здоровых доноров и больных туберкулезом легких, отвечающих и не отвечающих in vitro на стимуляцию PPD (табл. 2). У здоровых доноров относительное содержание апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов было минимальным. Культивирование МНК в течение 24 часов сопровождалось 2-кратным возрастанием апоптоза (р<0,05). При этом стимуляция PPD не приводила к дальнейшему усилению апоптоза (5,1 ± 1,2 vs 5,3 ± 1,0; р>0,05). В группе PPD-ареактивных больных (п = 12) содержание апоптотических клеток среди свежевыделенных лимфоцитов но сравнению с донорами было повышено в 4 раза (р<0,01). Культивирование МНК в течение 24 часов не сопровождалось нарастанием апоптоза, тогда как стимуляция PPD приводила дополнительно к 2-кратному увеличению процентного содержания апоптотических клеток (Р<0,05). Важно подчеркнуть, что повышенный уровень спонтанного и PPD-индуцированного апоптоза был характерен именно для больных, не отвечающих на стимуляцию PPD. В то же время в группе PPD-pe-активных больных (п=12) содержание апоптотических лимфоцитов среди свежевыделенных, спонтанно-культивированных и PPD-стимулированных МНК достоверно не отличалось от соответствующих показателей апоптоза здоровых доноров. Сопряженность PPD-ареактивности с повышенным апоптозом подтверждалась также данными корреляционного анализа. В целом по группе больных между уровнем PPD-стпмулированного пролиферативного ответа и показателями спонтанного и PPD-индуцированного апоптоза выявлялась достоверная обратная корреляционная зависимость (г = -0,47; р<0,05 и г = -0,54; р<0,05, соответственно). Кроме того, было показано, что у больных ТБ относительное содержание Fas'-лимфоцитов в популяции свежевыделенных МНК составляло в среднем 8,8 ± 2,0 (п=12), что существенно превышало средний уровень этого показателя у здоровых доноров (2,4 ±

0,9; п=11; р<0,05). Причем содержание Fas'-клеток обратно коррелировало с уровнем PPD-стимулированной пролиферации (г = -0,56; р<0,05; п=15). Следовательно, можно полагать, что повышенный

апоптоз PPD-реактивных лимфоцитов является важным причинным фактором снижения антигенспецифического пролиферативного ответа лимфоцитов периферической крови у больных ТБ легких.

Учитывая наличие оппозитпых вариантов реагирования периферических лимфоцитов на стимуляцию PPD, представлялось важным исследовать особенности клинического течения туберкулеза легких в группах больных, различающихся по характеру ответа на PPD. Сравнительный анализ клинических форм туберкулеза легких показал, что в группе 33 PPD-реактивных больных преобладали пациенты с впервые выявленным туберкулезом, давностью заболевания не более 1 года и отсутствием выраженных признаков интоксикации. Данная группа включала 20 больных с инфильтративной формой ТБ, 4 - с очаговой формой туберкулеза, 2 - с туберкуло-мой и 7 пациентов с фиброзно-кавернозной формой ТБ. В группе 24 PPD-ареактивных пациентов преобладали больные с прогрессирующим течением, длительными сроками заболевания и наличием симптомов интоксикации па момент обследования. Удельный вес пациентов с фиброзно-кавернозной формой в данной группе был достоверно выше, чем в группе PPD-реактивных пациентов (66,7% vs 21%; рТмф=0,007). Инфильтративная форма ТБ регистрировалась только у 8 пациентов (33%), причем у 3 больных отмечалось прогрессирующее течение заболевания. Следовательно, снижение PPD-стиму-лированного ответа в большей степени характерно для больных с тяжелыми формами ТБ, прогрессирующим течением и длительными сроками заболевания, что позволяет расценивать дефект антигенспецифического ответа в качестве неблагоприятного прогностического признака.

На завершающем этапе работы была исследована взаимосвязь между нарушением PPD-стимули-рованного пролиферативного ответа периферических лимфоцитов и кожной туберкулиновой анергией, отражающей дефект F3T. Оценка кожной туберкулиновой реакции в группе 50 больных с активными формами туберкулеза показала, что угнетение ГЗТ-реакции, диагностируемое при размере папулы менее 10 мм [18), выявлялась у 14 из 50 пациентов (28%), причем у 4-х пациентов (8%) случаев кожная реакция полностью отсутствовала (0 мм). Сопоставление уровня PPD-сгимулированного пролиферативного ответа с выраженностью кожной туберкулиновой пробы, проведенное в группе 27 больных, не выявило прямой достоверной корреляционной зависимости между указанными параметрами (г = 0,16; р>0,05). Тем не менее, у пациентов с диаметром папулы менее 10 мм ареактивность на PPD in vitro выявлялась в 1,5 раза чаще, чем у пациентов с кожным тестом более 10 мм (71,4% vs 46,6%). Выраженность кожного туберкулинового теста различалась также в зависимости от тяжести туберку-

лезной инфекции (табл. 3). Так, в группе больных с более тяжелым течением ТБ (10 пациентов с фиб-розно-кавернозной формой туберкулеза) диаметр папулы был в среднем в 2,5 раза меньше по сравнению с аналогичным показателем у больных с меньшей тяжестью туберкулезной инфекции (17 пациентов с инфильтративной и очаговой формами заболевания). При этом у трех из 10 пациентов с фиброзно-кавернозной формой туберкулеза проба Манту была отрицательной. Уровень пролиферативного ответа на PPD и индекс стимуляции PPD в этой группе больных были соответственно в 3 и 5 раз ниже, чем у пациентов с инфильтративной и очаговой формами ТБ. Таким образом, снижение выраженности ГЗТ на внутрикожное введение туберкулина сопряжено с более тяжелым вариантом течения туберкулезной инфекции и в определенной степени ассоциировано с угнетением пролиферативного ответа на PPD in vitro.

Обсуждение

Полученные нами результаты свидетельствуют об изменении ответа лимфоцитов на PPD у больных туберкулезом легких. В половине случаев больные ТБ характеризуются повышенным пролиферативным ответом периферических лимфоцитов на стимуляцию PPD, в то время как у другой половины - ответ на PPD полностью угнетен. Феномен угнетения антигенспецифического ответа in vitro документирован и другими авторами [5, 10, 17] и активно обсуждается в контексте механизмов ускользания Mycobacterium tuberculosis от иммунного ответа. Показано, что снижение пролиферативной активности МНК при стимуляции PPD ассоциировано с угнетением продукции IFN-YIL-2, играющих важную роль в противоинфекционном иммунитете при туберкулезной инфекции [19, 21, 22].

В настоящее время обсуждается несколько возможных причин нарушения антигенспецифическо-

го ответа. В качестве одной из них - неспецифическая иммуносупрессия, обусловленная супрессорной активностью моноцитов и повышенной продукцией интерлейкина-10 (IL-10) и трансформирующего рост фактора-ß (TRF-ß) Т-клетками вследствие смещения баланса в сторону Т-хелперов 2-го типа [1, 14]. Действительно, наряду с угнетением ответа на антигены Mycobacterium tuberculosis, у больных ТБ отмечается также снижение пролиферативного ответа лимфоцитов на неспецифические антигены (Tetanus toxoid, Candida Albicans) и поликлональные активаторы [8, 18]. Однако удаление супрессорных клеток, нейтрализация IL-10 и/или TGF-ß или добавление IL-2 не приводит к полному восстановлению антигенспецифического ответа [8,9]. Проведенными нами исследованиями установлено, что наличие неспецифической иммуносупрессии, проявляющейся снижением анти-СБЗ- и КонА-индуциро-ванного пролиферативного ответа МНК, имеет место как у больных со сниженным уровнем PPD-сти-мулированной пролиферации, так и у PPD-реактиь-ных пациентов. Следовательно, логично предположить, что подавление антигенспецифического ответа связано не столько с наличием неспецифической иммуносупрессии, сколько с иными механизмами, возможно? обусловленными “внутренним” дефектом Т-клеток. В этом плане значительный интерес представляет феномен гибели антигенреактивных клеток вследствие апоптоза.

Повышенная готовность к апоптозу как причина подавления Т-клеточного ответа описана при различных формах инфекционной патологии, включая вирусную и бактериальную инфекцию [11, 20]. У больных туберкулезом легких неспецифическая иммуносупрессия во многом обусловлена смещением баланса в сторону Th2. Поскольку среди Т-хел-перных клеток наибольшей чувствительностью к активационному апоптозу обладают Thl [23, 24], запуск программированной гибели Т-лимфоцитов может выполнять роль механизма, способствующе-

Табл. 3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА ВЫРАЖЕННОСТИ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО ОТВЕТА У БОЛЬНЫХ С РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ ТУБЕРКУЛЕЗА ЛЕГКИХ

Формы туберкулеза Уровень PPD-ответа in vitro Реакция Манту (мм)

имп/мин ИС

Фиброзно-кавернозная форма ТБ 4098 ± 1170 2,6 ± 0,6 5,8 ± 3,2

Очаговая и инфильтративная формы ТБ 13314 ± 3511* 17,0 ± 1,5* 14,8 ± 5,1*

Примечание: интенсивность пролиферации (имп/мин) оценивали радиометрически на 6 сутки при стимуляции РРО (100 мкг/мл). Индекс стимуляции (ИС) подсчитывали как соотношение интенсивности пролиферации в стимулированных и нестимулированных культурах. Реакцию Манту (мм) оценивали на 3 сутки по диаметру папулы. Данные представлены в виде М ± Б.Е. * - р<0,05

го накоплению Th2. Кроме того, апоптоз PPD-реак-тивных Т-клеток может приводить к стойкому нарушению антигенспецифического ответа. Оценка апоптоза лимфоцитов у обследованных нами больных выявила существенное усиление спонтанного (свежевыделенные лимфоциты) и PPD-индуциро-ванного апоптоза в группе PPD-ареактивных пациентов. Важно отметить, что усиление апоптоза регистрировалось только у больных, не отвечающих на PPD, тогда как у PPD-реактивных пациентов показатели спонтанного и PPD-индуцированного апоптоза не отличались от таковых у здоровых доноров. Следовательно, дефект антигенспецифического ответа в значительной степени ассоциирован с повышенным апоптозом. Полученные нами данные согласуются с исследованиями Р. Daurte [6] и С.Н. Hirsch и соавт. [13], которые выявили усиление апоптоза, индуцированного антигенами Micoba-cterium tuberculosis (MTB), и наличие обратной корреляционной связи между МТВ-индуцированным апоптозом и продукцией IFN-y и IL-2. Важно отметить, что, согласно полученным нами данным, содержание апопготических клеток в PPD-симулиро-ванных культурах больных достигало у PPD-ape-активных пациентов в среднем 20%, что может свидетельствовать о вовлечении в апоптоз как PPD-pe-активных, так и антигеннеспецифических клонов за счет Fas/FasL взаимодействий. Как известно, течение туберкулезной инфекции сопровождается признаками активации Т-клеток, в частности усилением HLA-DR экспрессии на Т-клетках [22]. Согласно данным литературы, активация Т-клеток сопряжена также с усилением экспрессии Fas антигена и появлением FasL, связывание которых при контактных взаимодействиях клеток индуцирует запуск паракринных механизмов программированной клеточной гибели [16, 241. Действительно, у обследованных нами больных повышенный апоптоз лимфоцитов был сопряжен с достоверным увеличением относительного содержания Fas-позитивных лимфоцитов, а между уровнем PPD-стимулирован-ного пролиферативного ответа и относительным содержанием Fas'"-лимфоцитов выявлялась значимая обратная корреляционная зависимость.

Проведенный клинико-иммунологический анализ показал, что выявленная in vitro PPD-ареактивность сопряжена с более тяжелым вариантом течения туберкулезной инфекции. Так, если среди PPD-реактивных больных преобладали пациенты с очаговыми и инфильтративными формами туберкулеза, то в группе ареактивных больных - с фибрознокавернозным туберкулезом. Клиническая значимость дефекта антигенспецифического ответа обсуждается и другими авторами. В частности, отмечена сопряженность между выраженностью PPD-индуцированного апоптоза и распространенностью туберкулезного процесса, а также существенное уве-

личение уровня PPD-стимулированной продукции IL-2 и IFN-y после успешного проведения химиотерапии [13].

Одним из важных этапов настоящей работы стало сопоставление дефекта антигенспецифического ответа in vitro с кожной туберкулиновой анергией. Полное отсутствие папулы при внутрикожном введении туберкулина было выявлено нами у 4 из 50 (8%) обследованных пациентов. Величина кожной пробы менее 10 мм, как проявление снижения ГЗТ у больных туберкулезом,регистрировалась у 14 из 50 больных (28 %). Таким образом, наличие кожной анергии у больных ТБ выявлялось реже, чем наличие PPD-ареактивности периферических лимфоцитов. Нам ие удалось выявить прямой корреляционной взаимосвязи между уровнем PPD-стимулированного пролиферативного ответа и выраженностью ГЗТ. Тем не менее, все пациенты с отрицательной пробой Манту характеризовались отсутствием пролиферативного ответа на PPD in vitro. Кроме того, у больных фиброзно-кавернозным туберкулезом более выраженное угнетение кожной туберкулиновой пробы ассоциировалось с большим угнетением пролиферативного ответа на PPD. Однако в отличие от подавления PPD ответа периферических лимфоцитов, снижение кожной туберкулиновой реакции не коррелировало с уровнем апоптоза. Имеющиеся на сегодняшний день данные о соотношении кожной анергии и PPD-ареактивности in vitro достаточно противоречивы. Так, V.A. Boussiotis, обследовавший 206 пациентов с туберкулезом легких, показал, что кожная анергия у ВИЧ-неинфицированных пациентов выявляется в 15% случаев и сопряжена с подавлением пролиферативного ответа на PPD [3]. В то же время по данным других авторов снижение PPD-стимулированного ответа in vitro может наблюдаться у больных с положительным кожным тестом [3, 18]. Проведенные нами исследования показали, что туберкулиновая анергия у больных туберкулезом легких может проявляться как в виде изолированных нарушений ГЗТ и пролиферативного ответа МНК периферической крови, так и в виде их сочетания. При этом угнетение ГЗТ обусловлено, по-видимому, механизмами, не связанными с индукцией апоптоза. В этом аспекте представляют интерес данные о способности IL-10 индуцировать стойкое состояние анергии антигенснецифических CD4+T-клеток [12]. Действительно, исследованиями V.A. Boussiotis показано, что продолжительное подавление кожной туберкулиновой реакции у больных ТБ сопряжено со снижением продукции IFN-y, усилением продукции IL-10 и наличием биохимических признаков анергии, проявляющихся дефектом активации ZAP-70 и RAS в Т-клетках, активированных PPD. Авторами также отмечается, что указанные клетки обладают выраженной неспецифической супрессорной активностью и способны подавлять

пролиферативный ответ, стимулированный аллоап-тигенами или митогенами [3].

Наряду с данными о стойком характере туберкулиновой анергии, в литературе имеются сообщения об обратимости дефекта PPD-стимулированно-го ответа in vitro. Так, F.Deily с соавт. показали, что спустя 4 месяца после проведения химиотерапии у больных с впервые выявленным туберкулезом легких сниженный ответ периферических лимфоцитов на PPD повышался, в то время как повышенный ответ на PPD среди лимфоцитов плеврального экссудата, напротив, снижался [7]. Следовательно, наряду с делецией или анергией антигенреактивных клонов, существуют, по-видимому, и другие механизмы нарушения PPD-ответа, одним из которых может быть компартментализация PPD-реактивных клеток в очаге инфекции [18].

Имеющиеся в литературе разноречивые данные о механизмах нарушения антигенспецифического ответа у больных туберкулезом легких обусловлены, видимо, несколькими обстоятельствами, в том числе различным контингентом обследованных больных и неоднозначностью определения состояния PPD-анергии. Так, PPD-ареактивность периферических Т-клеток вследствие их анергии или повышенной супрессорной активности моноцитов была выявлена в группе больных, характеризуемых наличием стойкой кожной анергии [3, 9]. В то же время снижение антигенспецифического ответа вследствие повышенного апоптоза Т-клеток [13] и их компартментализация [18] описаны у больных с положительным кожным туберкулиновым тестом.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что у половины больных активными формами туберкулеза легких выявляется угнетение антигенспецифического ответа периферических лимфоцитов. Отсутствие четкой корреляционной связи между PPD-анергией in vivo и in vitro, а также возможность изолированного проявления кожной туберкулиновой анергии и PPD-ареактивности лимфоцитов периферической крови свидетельствует, по-видимому, о вовлечении различных механизмов индукции туберкулиновой неотвечаемо-сти. Одним из них является активационно-индуцированный апоитоз PPD-реактивных лимфоцитов. Можно полагать, что программированная клеточная гибель имеет непосредственное отношение к дефекту антигенспецифического ответа МНК периферической крови, в то время как нарушение ГЗТ реализуется с участием иных, аноптоз-неза-висимых механизмов.

Список литературы

1. Baliko Z., Szereday L„ Szekeres-Bartho. Th2 biased immune response in cases with active Mycobacterium tuberculosis infection and tuberculin anergy //

FEMS Immunology and Medical Microbiology.- 1998.-Vol.22.- P.199-204.

2. Bloom B.R., Small P.M. The evolving relation between humans and Mycobacterium tuberculosis // N. Engl. J. Med..-1998.- Vol. 326.-P.231-235.

3. Boussiotis V.A., Tsai E.Y., Yunis E.J., Thim S., Delgado J.C., Dascher C.C., Berezovskaya A., Rousset D., ReynesJ-M., Goldfeld A.E. IL-10-producingT cells suppress immune response in anergic tuberculosis patients //J.Clin.Invest..- 2000.- Vol.105.- P.1317-1325.

4. Converse P.J., Jones S.L., Astemborski J., Vlahov D., Graham M.N. Comparison of a tuberculin IFN-y assay with the tuberculin skin test in high-risk adults effect of human immunodeficiency virus infection // J.Infect. Dis.-1997.-Vol.176,- P.144-150.

5. Dannenberg A.M. Delayed-type hypersensitivity and cell-mediated immunity in the pathogenesis of tuberculosis //Immunol. Today.-1991.-Vol.12.-P.346-348.

6. Daurte P., Kindlelan J.M., Carrasedo J., Sanchez-Guijo P., Ramirez L. Mycobacterium tuberculosis induces apoptosis in y/8 T lymphocytes from patients with advanced clinical forms of active tuberculosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol.-1997.-Vol.4.-P.14-18.

7. Dieli F., Friscia G., Di Sano C., Ivanyi J., Singh M., Spallek R., Sireci J., Titone L., Salerno A. Sequestration of T lymphocytes to body fluids in tuberculosis: reversal of anergy following chemotherapy // J.Infect. Dis.-1999.-Vol. 180.-P.225-228.

8. Ellner J.J. Review: the immune response in human tuberculosis //J. Infect. Dis.-1997.-Voll76.-P. 1351-1359.

9. Ellner J.J. Immunosuppression in tuberculosis / / Infectr. Agen. Dis.-1996.-Vol.5.-P.62-72.

10. Ellner J.J. Regulation of the human immune response during tuberculosis //J.Lab.Clin.Med.- 1997.-Vol.130, № 5,- P.469-475.

11. Fuse Y., Nishimura H., Maeda K., Yoshikai Y. CD95 (Fas) may control the expansion of activated T Cells after elimination of bacteria in murine listeriosis // Infection and Immunity.- 1997,- Vol.65.- P.1883-1891.

12. Groux H„ Bigler M., de Vries J.E., Roncarolo M.G. Interleukin 10 induces a long-term antigen-specific anergic state in human CD4+ T cells // J. Exp. Med.-1996.-Vol.l84.-P.19-29.

13. Hirsh C.S., Toossi Z. Vanham G., Johnson J.L., Peters P., Okwera A., Mugerwa R., Mygyenyi P., Ellner J.J. Apoptosis and T Cell Hyporesponsiveness in Pulmonary Tuberculosis // J. of Infectious Diseases.-1999,- Vol.179,- P.945-953.

14. Hirsh C.S., Toossi Z. Othieno C., Johnson J.L., Schwander S.K., Robertson S., Wallis R.S., Edmonds K., Okwera A., Mugerwa R., Peters P., Ellner J.J. Depressed T-cell interferon-y responses in pulmonary tuberculosis: analysis of underlying mechanisms and modulation therapy //J.Infect.Dis.-1999.-Vol.l80.-P.2069- 20-73.

15. Kaufman S.H.E. Immunity to intracellular microbial pathogens // Immunology Today.- 1995.-Vol.16, № 7,- P.338-342.

16. Roberts A.D., Orme I.M. CD95 expression in aged mice infected with tuberculosis // infection and immunity.- 1998,- Vol. 66, №10,- P.5036-5040.

17. Sanchez F.O., RodriguezJ.I., Agudelo G.,Garcia L.F. Immune responsiveness and lymphokine production in patients with tuberculosis and healthy controls // Infect. Immun..-1994.- Vol. 62.-P. 5673-5678.

18. Schwander S.K., Torres M., Sada E., Carranza C., Ramos E., Tary-Lehmann M., Wallis R.S., Sterra J., Rich E.A. Enhance response to Mycobacterium tuberculosis antigens by human alveolar lymphocytes during active pulmonary tuberculosis // J. Infect. Dis.-1998,- Vol.178.- P.1434-1445.

19. Surcel H.M., Troye-Blomberg M„ Paulie S. Thl/ Th2 profiles in tuberculosis based on proliferation and cytokine response of blood lymphocytes to Mycobacterium tuberculosis antigens // Immunol.-1994.-Vol.81 .-P. 171 -176.

20. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science.- 1995.- Vol.267,-P.1456-1460.

21. Toossi Z., Kleinhez M.F., Ellner J.J. Defective interleukin 2 production and responsiveness in human pulmonary tuberculosis// J. exp. Med.-1986.-Vol.163.-P. 1162-1172.

22. Vanham G., Toossi Z., Hirsch C.S. Wallis R.S., Schwander S.K., Rich E.A., Ellner J.J. Examining a paradox in the pathogenesis of human pulmonary tuberculosis: immune activation and suppression/anergy //Tubercle and Lung Disease. - 1997,- Vol.78, № 3 & 4.-P. 145-158.

23. Varadhachary A.S., Perdow S.N., Hu C. Differential ability of T cell subsets to undergo activation-induced cell death // Proc.Nath.Acad.Sei. - 1997.-Vol.94.- P. 5578-5783.

24. Zhang X., Brunner Т., Carter L., Dutton R.W., Rogers P., Bradley L., Sato Т., Reed J.C., Green D., Swain S.L. Unequal death in T helper cell (Th)l and Th2 effectors: Thl, but not Th2, effectors undergo rapid Fas/Fasl-mediated apoptosis // J. Exp. Med. -1997,-Vol.185. - P.1837-1849.

25. Zumla F., Grand J. Tuberculosis // BMJ.- 1998.-Vol.316.- P.1962-1964.

поступила в редакцию 10.01.2001 принята к печати 26.01.2001