CC BY
21
СОВРЕМЕННЫЕ ФАРМАКО- И БИОПРЕПАРАТЫ
Для цитирования: Санин, А.В. Антивирусная активность Гамапрена в отношении вируса диареи крупного рогатого скота в УДК 619: 615
экспериментах in vitro / А.В. Санин, С.В. Ожерелков, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, А.В. Деева, И.К. Зубашев, Т.Н. Кожевникова,
А.В. Изместьева, А.Д. Агафонова, Р.В. Белоусова // Российский ветеринарный журнал. — 2018. — № 1. — С. 12-16.
For citation: Sanin A.V., Ozherelkov S.V., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Deeva A.V., Kozhevnikova T.N., Zubashev I.K., Agafonova A.D.,
Izmest'eva A.V., Belousova R.V., Antiviral Activity of Gamapren against the Bovine Diarrhea Virus in the in vitro Experiments, Rossijskij vet-
erinarnyj zhurnal (Russian veterinary journal), 2018, No. 1, pp. 12-16.
Антивирусная активность Гамапрена в отношении вируса диареи крупного рогатого скота в экспериментах in vitro
А.В. Санин1, доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. клеточного иммунитета ([email protected]), С.В. Ожерелков2, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаб. противовирусных лекарственных средств([email protected]), А.Н. Наровлянский1, доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. цитокинов ([email protected]), А.В. Пронин1, доктор биологических наук, профессор, зам. директора по научной работе ([email protected]), А.В Деева1, кандидат медицинских наук наук, старший научный сотрудник лаб.естественного иммунитета ([email protected]), И.К. Зубашев1, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаб. цитокинов ([email protected]), Т.Н. Кожевникова1, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета ([email protected]), А.В. Изместьева1, научный сотрудник лаб. цитокинов ([email protected]), А.Д. Агафонова1, ветеринарный врач, младший научный сотрудник лаб. клеточного иммунитета ([email protected]), Р.В Белоусова3, доктор ветеринарных наук, профессор, каф. вирусологии.
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18).
2 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова» РАН (108819, Москва, пос. Московский, пос. Института полиомиелита, дом. 8, корп. 1).
3 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА имени К.И. Скрябина» (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23).
К числу флавивирусных инфекций, наиболее значимых в ветеринарной практике, относят вирусную диарею крупного рогатого скота (ВД КРС), возбудителем которой является РНК-содержащий вирус из рода Pestivirus, семейства Flaviviridae. Актуальной задачей для лечения и профилактики данного заболевания остается поиск надежных, эффективных и безопасных препаратов с противовирусной активностью.
Одним из перспективных иммуномодулирующих препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении различных флавивирусов, является Гамапрен (ГП) — полипренилфосфат натрия, полученный из листьев шелковицы. Целью настоящей работы было изучить влияние ГП на репродукцию ВД КРС и динамику накопления вирусных белков в культуре клеток коронарных сосудов теленка (КСТ).
Для выявления противовирусной активности ГП в опытах in vitro ВД КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозе 200 мкг/мл, оценивая результаты титрования в Lg ЦПД50. Влияние ГП на динамику накопления вирусных белков оценивали в реакции преципитации.
Установлено, что ГП подавляет размножение ВД КРС в культуре клеток на 1,8 lg. При этом наблюдали замедление проявления ЦПД вируса на 24...48 ч по сравнению с контролем. Данные, полученные с помощью реакции преципитации, свидетельствуют о значительном подавлении накопления белков ВД КРС в культуре клеток КСТ в присутствии ГП на ранних сроках (2.6 ч после инфицирования).
Таким образом, под действием ГП изменяются сроки созревания белков ВД КРС в клетках, что может объяснять наблюдаемое снижение инфекционности вируса при воздействии ГП.
Ключевые слова: вирус диареи крупного рогатого скота, флавивирусы, гамапрен, полипренилфосфат, противовирусная активность, иммуномо-дулятор
Сокращения: БОЕ — бляшкообразующие единицы, ВД КРС — вирус диареи крупного рогатого скота, ГП — Гамапрен, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, КСТ — культура клеток коронарных сосудов теленка, РИП — метод радиоиммунопреципи-тации, РНК — рибонуклеиновая кислота, ЦПД — цитопатическое действие
Введение
К числу флавивирусных инфекций, наиболее значимых в ветеринарной практике, относят ВД КРС, возбудителем которой является РНК-содержащий ви-
рус из рода РезЬтгиз, семейства Flaviviridae. Актуальной задачей для лечения и профилактики данного заболевания остается поиск надежных, эффективных и безопасных препаратов с противовирусной активностью [2, 3].
Несмотря на интенсивный скрининг, проводимый во всем мире, число противовирусных препаратов при ряде инфекций ограничено, вплоть до полного их отсутствия при некоторых инфекционных заболеваниях. В значительной степени это объясняется особенностью паразитизма вирусов, поражающих геном клетки. С этим связано важное требование к поиску противовирусных препаратов, которые должны либо непосредственно воздействовать на сам вирус, не повреждая клетки, в которых он паразитирует, либо обладать способностью активировать выработку
эндогенного интерферона. Важнейшим свойством таких препаратов должна быть также способность повышать естественную резистентность организма и стимулировать противовирусный иммунный ответ. Одним из перспективных иммуномодулирующих препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении различных флавивирусов, является Гамапрен — полипренилфосфат натрия, полученный из листьев шелковицы. Ранее было показано, что препараты на основе фосфорилированных полипренолов обладают противовирусной активностью по отношению к другим флавивирусам: вирусу клещевого энцефалита, вирусу желтой лихорадки и вирусу гепатита С [1, 4, 7, 9].
Цель исследования
Изучить влияние ГП на репродукцию ВД КРС и динамику накопления вирусных белков в культуре КСТ.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали ВД КРС (штамм ТЛ), полученный на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.
Культура клеток. В качестве субстрата для размножения ВД КРС использовали перевиваемую культуру КСТ, полученную на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГАВ-МиБ им. К.И.Скрябина.
Препараты. В работе использовали коммерческий препарат ГП производства ООО «Гамаветфарм» (Москва, РФ).
Сыворотка. В опытах использовали поликлональ-ную сыворотку кролика против ВД КРС, полученную на кафедре ветеринарной вирусологии биологического факультета ФГБОУ ВО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.
Выявление противовирусной активности ГП в опытах in vitro. ВД КРС титровали в присутствии ГП, который добавляли в каждое разведение вируса в дозе 200 мкг/мл, препарат до нужной концентрации разводили поддерживающей средой Игла МЕМ.
В качестве контроля использовали раствор плацебо (не содержащий полипренилфосфатов комплексный водный растворитель), разведенный поддерживающей средой 1 : 20).
В каждом опыте проводили контроль на токсичность ГП: с этой целью в культуру клеток вносили препарат в дозах 100...200 мкг/мл.
После заражения контрольные и экспериментальные пробирки с клетками помещали в термостат и содержали при 37 °С в течение 5-и суток, проводя ежедневные визуальные наблюдения за состоянием культур клеток.
Результаты титрования оценивали в Lg ЦПД50. Опыты повторяли троекратно.
Реакция радиоиммунопреципитации. Четырехдневную культуру клеток КСТ вносили в стандартные куль-туральные флаконы (8=25см2) и после образования полного монослоя заражали ВД КРС с множественностью заражения 5.10 БОЕ/кл. Схема заражения представлена в таблице 1.
После двухчасовой адсорбции при 37°С во флаконы вносили по 2 мл среды для мечения. Состав среды для мечения на 6 проб: Раствор Эрла — 25,2 мл (+ ГП, 400 мкг/мл); [14С]-меченный белковый гид-ролизат — 210 мкл; форсколин 10 мМ — 20 мкл. Через два часа после начала мечения во флаконы 1.4, 9 добавили по 0,5 мл РИП-буфера (Трис-НС1 10 мМ рН 8.0, МаС1 0.15 М, ЭДТА 1 мМ, №-40 1 %, апроти-нин 1:1000) и поместили в холодильную камеру (при -70 °С). После начала мечения пробы обрабатывали РИП-буфером и полученные образцы вносили во флаконы через 2 ч (см. табл.1, пробы № 3, 8); через 4 ч (см. табл.1, пробы № 4, 9); через 6 ч (см. табл. 1, пробы № 5, 10); через 8 ч (см. табл. 1, пробы № 6, 11; через 24 ч (см. табл. 1, пробы № 7, 12). При постановке реакции все флаконы с пробами были трижды подвергнуты замораживанию и оттаиванию. Полученный экстракт вносили в микроцентрифужные пробирки и центрифугировали в течение 20 мин при 14 тыс. мин-1. Из супернатанта в пробирки отобрали алик-воты по 180 мкл и добавляли к ним по 10 мкл полик-лональной сыворотки к ВД КРС. Реакционную смесь помещали на 12 ч в холодильник (4 °С). ПротеинА-сефарозу смешивали в РИП-буфере в соотношении 1:1 и через 24 ч трехкратно промывали равным объемом РИП-буфера. Осадок ресуспендировали в равном объеме РИП-буфера и добавляли по 50 мкл суспензии во все пробы. Образцы инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре, встряхивая каждые 20 минут. По окончании инкубации пробы центрифугировали в течение 10 мин при 6 тыс. мин-1, затем промывали пятикратно в 1 мл W-буфе-ра (Трис-НС1 10 мМ рН 8.0, МаС1 0.15 М, ЭДТА 1 мМ, МР-40 0.01 %). К пробам после обработки буфером добавляли по 50 мкл 8-буфера для нанесения на гель (Трис-НС1 0.0625 М рН 6.8, глицерин 20 %, р-меркап-тоэтанол 10 %, додецилсульфат натрия (Дс-Ма) 2 %, бромфеноловый синий на кончике шпателя) и выдер-
1. Схема заражения клеток КСТ вирусом ВД КРС в присутствии ГП (400 мкг/мл) 1. Protocol of infection of the calf coronary vessels cell culture with BDV in the presence of GP (400 нд/ml)
Проба ВД КРС Состав проб: поддерживающая среда и/или ГП
1 - МЕМ двойная
2 - МЕМ двойная + ГП
3 + МЕМ двойная
4 + МЕМ двойная
5 + МЕМ двойная
6 + МЕМ двойная
7 + МЕМ двойная
8 + МЕМ двойная + ГП
9 + МЕМ двойная + ГП
10 + МЕМ двойная + ГП
11 + МЕМ двойная + ГП
12 + МЕМ двойная + ГП
2. Влияние ГП на репродукцию ВД КРС 2. Influence of GP on BDV reproduction
Вариант Титры ВД КРС, lg ЦПД50/мл Токсичность
1. Клетки+ВД КРС 5,6±0,6 Отсутствует (-)
2. Клетки+ВД КРС+плацебо 5,8±0,7 -
3. Клетки+ВД КРС+ГП 3,8±0,4* -
4. Контроль токсичности ГП - -
Примечание: * разница между соответствующими показателями для проб 1 и 3; 2 и 3 статистически достоверна при Р< 0,05.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Рис. Динамика накопления вирусных белков в присутствии ГП Dynamics of viral proteins accumulation in the presence of GP
Номер дорожки Образец
1 КСТ, начальная точка
2 КСТ + МП, начальная точка
3 КСТ + ВД, 2 ч
4 КСТ + ВД, 4 ч
5 КСТ + ВД, 6 ч
6 КСТ + ВД, 8 ч
7 КСТ + ВД, 24 ч
8 КСТ + ВД + ГП, 2 ч
9 КСТ + ВД + ГП, 4 ч
10 КСТ + ВД + ГП, 6 ч
11 КСТ + ВД + ГП, 8 ч
12 КСТ + ВД + ГП, 24 ч
живали при 4 °С в течение 24 ч. Через 24 ч проводили гель-электрофорез в денатурирующих условиях (1 % Дс-Na) по Лэммли в 10%-м полиакриламидном геле. Разделение заканчивали в момент выхода из геля краски (бромфенолового синего). Гели фиксировали в течение 1 ч в водном растворе, содержащем 10 % этанола 96 %, 20 % ледяной уксусной кислоты. Фиксированные гели отмывали водой до исчезновения запаха уксусной кислоты (1 ч), трехкратно обрабатывали безводным диметилсульфоксидом по 20 мин и инкубировали в течение 1 ч при 20 °С в 20%-м растворе сцинтиллятора (PPO) в диметилсульфокси-де. По окончании обработки гели сушили в вакуумной сушке при температуре 80 °С в течение 30 мин. Далее сухие пластины помещали в рентгенографическую кассету с пленкой Kodak на 30 суток в холодильную камеру (при -70 °С).
Результаты
Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что ГП подавляет размножение ВД КРС в культуре клеток КСТ. При этом во всех пробирках с клетками, в которые вносили вирус и ГП, наблюдали замедление проявления ЦПД вируса на 24...48 ч по сравнению с клетками, зараженными ВД без препарата. Обработка вируса и клеток раствором плацебо не приводила к каким-либо достоверным изменениям в титре вируса (пробы 1-я и 2-я) и не отражалась на сроках проявления ЦПД в зараженной культуре клеток. Соответствующие контроли показали полное отсутствие токсичности исследованной дозы ГП для клеток КСТ.
На радиоавтографе (рис.) приведены результаты анализа проб лизированных клеток, исследованных через 2, 4, 6, 8 и 24 ч после начала инфекции с полик-лональной сывороткой кролика против ВД КРС.
Дорожка 3, соответствующая 2 ч инкубации культуры с вирусом без добавления препаратов, показывает максимальное накопление вирусных белков; через 4 и 6 ч вирусные белки выявляются слабее, а через 8 и 24 ч практически не выявляются. Дорожка
8 соответствует 2 ч инкубации культуры с вирусом в присутствии ГП. Интенсивность этих полос значительно отличается от контрольной 3 дорожки. Дорожки 9, 10, соответствующие 4 и 6 ч инкубации культуры с вирусом в присутствии ГП, также отражают значительное подавление накопления вирусных белков.
Таким образом, представленные на рисунке данные свидетельствуют о значительном подавлении накопления белков ВД КРС в культуре клеток КСТ в присутствии ГП на ранних сроках (2...6 ч после инфицирования).
Ежедневное визуальное наблюдение в световом инвертированном микроскопе за клетками, зараженными ВД КРС в присутствии ГП и контрольной культурой, инфицированной вирусом без ГП, показало, что ГП задерживает развитие ЦПД, характерного для ВД КРС, на 24.48 ч по сравнению с контролем.
Обсуждение
Препараты, действующим веществом которых служат фосфорилированные полипренолы — Фоспре-нил (содержит полипренолы, выделенные из хвои сибирской пихты) и ГП (содержит полипренолы, выделенные из листьев шелковицы), — исключительно активные в фармакологическом плане соединения. Они обладают не только иммуномодулирующими [1, 7, 12] и противовирусными [1], но также противовоспалительными [14], адъювантными [5, 10] и иными важными свойствами. Противовирусную активность данные препараты проявляют по отношению к ДНК-и РНК-геномным вирусам, как имеющим оболочку, так и лишенным ее [6, 8, 11, 13].
В представленной работе установлено, что ГП в дозе 200 мкг/мл обладает способностью значительно (на 1,8 подавлять размножение ВД КРС в культуре КСТ. В то же время механизмы противовирусного действия ГП на этапах взаимодействия вирус-клетка остаются недостаточно изученными. Результаты, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о способности ГП изменять сроки созревания вирусных белков высокоактуального для ветеринарной медицины ВД КРС в клетках, что может объяснять наблюдаемое снижение ин-фекционности вируса под воздействием препарата. Не исключено, что одним из механизмов влияния ГП на накопление вирусных частиц является стимуляция продукции клеточного интерферона, что показано в отношении Фоспренила [1, 4]. Кроме того, препараты на основе полипренилфосфатов влияют на адсорбцию и проникновение определенных вирусов путем блокирования гликопротеиновых рецепторов, а также, возможно, модификации клеточных мембран. Взаимодействуя с вирионами вне клетки, они препятствуют заражению клеток-мишеней. Вдобавок, с помощью электронной микроскопии установлено, что после воздействия данных препаратов среди выходящих из клетки вирусных частиц попадается много дефектных и интерферирующих (препятствующих репликации других вирусов) вирионов, утративших способность заражать другие клетки-мишени [1, 6, 12]. Вполне возможно также, что фос-форилированные полипренолы препятствуют прени-
лированию и гликозилированию вирусных белков
в клетках, что служит предметом дальнейших исследований.
Выводы
1. Препарат Гамапрен в дозе 200 мкг/мл подавляет размножение ВД КРС в культуре КСТ на 1,8 lg.
2. На ранних сроках (2.6 ч после инфицирования) заражения культуры клеток КСТ вирусом ВД КРС в присутствии ГП наблюдается значительное подавление накопления вирусных белков в, что свидетельствует о прямом противовирусном действии ГП.
Библиография
1. Васильев, А.Н. Противовирусная и иммуномодулирующая активность полипренилфосфатов при вирусных инфекциях / А.Н. Васильев, С.В. Оже-релков, В.В. Козлов, А.В. Пронин, А.В. Санин, Т.М. Парфенова, А.В. Из-местьева, А.М. Амченкова, Т.Н. Кожевникова, Т.Н. Степанова, А.Н. Наров-лянский // Антибиотики и химиотерапия. — 2008. — Т. 53. — №3-4. — С. 3-8.
2. Глотова. Т.И. Противовирусная активность нового химического соединения / Т.И. Глотова, В.Н. Сильников, Л.С. Королева, О.В. Кунгурцева,
B.Л. Тихонов, А.Г. Глотов // Российский ветеринарный журнал. СХЖ. — 2012 — №1 — с. 22-24.
3. Глотова, Т.И. Инфекционный ринотрахеит и вирусная диарея крупного рогатого скота: диагностика, молекулярно-биологические свойства возбудителей, эффективность противовирусных препаратов / Т.Н. Глотова: автореф. дис. ... докт. биол. наук (защищена 17.11.2006) — Новосибирск, 2006. — С. 48.
4. Годунов, Р.С. Иммуномодулирующая и противовирусная активность по-липренолов природного происхождения / Р.С. Годунов: автореф. дис. ... канд. мед. наук (защищена 19.05.2006) — Москва, 2006 — С. 24.
5. Кожевникова, Т.Н. Использование фоспренила в качестве адъюванта для вакцин и стимулятора продукции специфических антител при изготовлении гипериммунных сывороток / Т.Н. Кожевникова, М.Ф. Во-рович, В.Г. Козлов, С.В. Ожерелков, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, А.В. Санин // Российский ветеринарный журнал. МДЖ — 2006. — №2. —
C. 8-10.
6. Кожевникова, Т.Н. Морапренилфосфаты подавляют размножение вируса энцефаломиелита Тейлера и накопление вирусного белка VP3 в чувствительных культурах клеток BHK-21 и P388D1 / Т.Н. Кожевникова, Е.Г. Викторова, В.Г. Козлов, А.Н. Наровлянский, А.В. Санин, А.В. Пронин, С.В. Ожерелков // (Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии) — 2007.? №3. — С. 26-30.
7. Наровлянский, А.Н. Противовирусная активность полипренилфосфатов при экспериментальной инфекции, вызванной вирусом гепатита С in vitro./ А.Н. Наровлянский, П.Г. Дерябин, А.М. Седов, А.В. Санин, А.В. Пронин // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. — 2012. — №5. — С. 80-84.
8. Ожерелков, С.В. Защитное действие нового противовирусного препарата Фоспренил при экспериментальном клещевом энцефалите / С.В. Ожерелков, А.В. Тимофеев, Г.П. Новикова, А.В. Деева, А.Н. Наровлянский, А.В. Санин, А.В. Пронин // Вопр. Вирусол. — 2000. — Т. 45. — №1. — С. 33-37.
9. Ожерелков, С.В. Противовирусное действие препаратов Фоспренил и Га-мапрен в отношении флавивирусов / С.В. Ожерелков, Т.Н. Кожевникова, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, А.В. Санин // Ветеринария и кормление. — 2017. — №3. — С. 78-80.
10. Пронин, А.В. Полипренилфосфаты как адъюванты, поляризующие иммунный ответ в сторону Th1 / А.В. Пронин, С.В. Ожерелков, А.В. Деева, А.В. Санин, А.Н. Наровлянский // Инфекция и иммунитет. — 2012. — Т. 2 — №3. — С. 645-650.
11. Русских, В.В. Ринотрахеит кошек : клинико-эпизоотологические аспекты, противовирусная активность препаратов / В.В. Русских: дис. ... канд. вет. наук (защищена 11.04.2009) — Новосибирск [Место защиты: Ин-т эксперим. ветеринар. Сибири и Дал. Востока], 2009. — С. 131.
12. Санин, А.В. Применение иммуномодуляторов при вирусных заболеваниях мелких домашних животных /А.В. Санин // Российский ветеринарный журнал. МДЖ. — 2005. — №1. — С. 38-42.
13. Санин, А.В. Применение Гамапрена при лечении вирусных инфекций у кошек / А.В. Санин, С.Л. Савойская, И.К. Васильев, А.Н. Наровлянский, А.В. Пронин, Е.В. Гордеева // Ветеринария Кубани. — 2009. — №6. — С. 29-30.
14. Санин, А.В. Фосфорилированные полипренолы — новый класс соединений с противовоспалительной и бронхолитической активностью / А.В. Санин, И.В. Ганшина, Г.Ф. Судьина, В.Ю. Санина, Т.Н. Кожевникова, А.В. Пронин, А.Н. Наровлянский, С.А. Суханова, О.В. Проскурина, Н.М. Митрохин // Инфекция и иммунитет. — 2011 — Т. 1. — №4 — С. 355-360.
References
1. Vasil'ev A.N., Ozherelkov S.V., Kozlov V.V., Pronin A.V., Sanin A.V., Par-fjonova T.M., Izmest'eva A.V., Amchenkova A.M., Kozhevnikova T.N., Stepano-va T.N., Narovljanskij A.N. Protivovirusnaja i immunomodulirujushhaja aktivnost' poliprenilfosfatov pri virusnyh infekcijah, Antibiotiki i himioter-apija, 2008, Vol. 53, No. 3-4, pp. 3-8.
2. Glotova T.I., Sil'nikov V.N., Koroleva L.S., Kungurceva O.V., Tihonov V.L., Glotov A.G., Protivovirusnaja aktivnost' novogo himicheskogo soedineni-ja, Rossijskij veterinarnyj zhurnal SHZh, 2012, No. 1, pp. 22-24.
3. Glotova T.I., Infekcionnyj rinotraheit i virusnaja diareja krupnogo rogato-go skota: diagnostika, molekuljarno-biologicheskie svojstva vozbuditelej, jeffektivnost' protivovirusnyh preparatov (Infectious rhinotracheitis and viral diarrhea in cattle: diagnosis, molecular biological properties of pathogens, the effectiveness of antiviral drugs), Extended abstract of Doctor's thesis in boil science, it is protected 17.11.2006, Novosibirsk, 2006, 48 p.
4. Godunov R.S., Immunomodulirujushhaja i protivovirusnaja aktivnost' poliprenolov prirodnogo proishozhdenija (Immunomodulating and antiviral activity of polyprenols of natural origin), Extended abstracts of candidate thesis in vet. science, it is protected 19.05.2006, Moscow, 2006, 24 p.
5. Kozhevnikova T.N., Vorovich M.F., Kozlov V.G., Ozherelkov S.V., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Sanin A.V., Ispol'zovanie fosprenila v kachestve adjuvanta dlja vakcin i stimuljatora produkcii specificheskih antitel pri izgo-tovlenii giperimmunnyh syvorotok, Ross.veterinarnyj zhurnal MDZh, 2006, No. 2, pp. 8-10
6. Kozhevnikova T.N., Viktorova E.G., Kozlov V.G., Narovljanskij A.N., Sanin A.V., Pronin A.V., Ozherelkov S.V. Moraprenilfosfaty podavljajut razmnozhenie virusa jencefalomielita Tejlera i nakoplenie virusnogo belka VP3 v chu-vstvitel'nyh kul'turah kletok BHK-21 i P388D1, Zh. mikrobiologii, jepi-demiologii i immunologii, 2007, No. 3, pp. 26-30.
7. Narovljanskij A.N., Derjabin P.G., Sedov A.M., Sanin A.V., Pronin A.V., Protivovirusnaja aktivnost' poliprenilfosfatov pri jeksperimental'noj infekcii, vyzvannoj virusom gepatita S in vitro, Zh. mikrobiologii, jepidemiologii i immunologii, 2012, No. 5, pp. 80-84.
8. Ozherelkov S.V., Timofeev A.V., Novikova G.P., Deeva A.V., Narovljanskij A.N., Sanin A.V., Pronin A.V., Zashhitnoe dejstvie novogo protivovirusno-go preparata Fosprenil pri jeksperimental'nom kleshhevom jencefalite, Vopr. Virusol., 2000, Vol. 45, No. 1, pp. 33-37.
9. Ozherelkov S.V., Kozhevnikova T.N., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Sanin A.V., Protivovirusnoe dejstvie preparatov Fosprenil i Gamapren v otnoshenii flavivirusov, Veterinarija i kormlenie, 2017, No. 3, pp. 78-80.
10. Pronin A.V., Ozherelkov S.V., Deeva A.V., Sanin A.V., Narovljanskij A.N., Poliprenilfosfaty kak adjuvanty, poljarizujushhie immunnyj otvet v storonu Th1, Infekcija i immunitet, 2012, Vol. 2, No. 3, pp. 645-650.
11. Russkih V.V., Rinotraheit koshek: kliniko-jepizootologicheskie aspekty, protivovirusnaja aktivnost' preparatov (Rhinotracheitis of cats : clinical and epidemiological aspects, the antiviral activity of the preparations), Candidate thesis in vet science, it is protected 11.04.2009, Novosibirsk, Mesto zashhity: In-t jeksperim. veterinar. Sibiri i Dal. Vostoka, 2009, 131 p.
12. Sanin A.V., Primenenie immunomoduljatorov pri virusnyh zabolevani-jah melkih domashnih zhivotnyh, Rossijskij veterinarnyj zhurnal. MDZh, 2005, No. 1, pp. 38-42.
13. Sanin A.V., Savojskaja S.L., Vasil'ev I.K., Narovljanskij A.N., Pronin A.V., Gordeeva E.V., Primenenie Gamaprena pri lechenii virusnyh infekcij u koshek, Veterinarija Kubani, 2009, No. 6, pp. 29-30.
14. Sanin A.V., Ganshina I.V., Sud'ina G.F., Sanina V.Ju., Kozhevnikova T.N., Pronin A.V., Narovljanskij A.N., Suhanova S.A., Proskurina O.V., Mitro-hin N.M., Fosforilirovannye poliprenoly - novyj klass soedinenij s pro-tivovospalitel'noj i bronholiticheskoj aktivnost'ju, Infekcija i immunitet, 2011, Vol. 1, No. 4, pp. 355-360.
ABSTRACT
A.V. Sanin1, S.V. Ozherelkov2, A.N. Narovljanskij1, A.V. Pronin1, A.V. Deeva1, T.N. Kozhevnikova1, I.K. Zubashev1, A.D. Agafonova1, A.V. Izmest'eva1, R.V. Belousova3.
1 Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology (18, Gamaleya str., Moscow, 123098).
2 Chumakov Federal Scientific Center for Research and Development of Immune-and Biological products of RAS F (8/1, village of Institute of poliomyelitis, Moscow settlement, Moscow, 108819).
3 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology named after K.I. Skryabin (23a, Ac. Skryabin str., Moscow, 109472).
Antiviral Activity of Gamapren against the Bovine Diarrhea Virus in the in vitro Experiments. Bovine diarrhea virus (BDV), belonging to Flaviviridae family, is the causative agent of highly infectious disease of the cattle. That is why search for reliable, effective and safe antiviral drugs able to treat and prevent this disease is very important.
One of the promising immunomodulatory drugs with antiviral activity is Gamapren (GP) — phosphorylated polyprenol obtained from mulberry leaves.
The aim of this work was to study the effect of GP on reproduction of BDV and the dynamics of viral proteins accumulation in cell culture of the calf coronary vessels.
To assess the antiviral activity of GP in the in vitro experiments BDV was titrated in the presence of GP, which was added to each dilution of the virus at a dose of 200 ig/ml, evaluating the results of the titration by lg CPA50. The influence of GP on the dynamics of the viral proteins accumulation was evaluated in the precipitation reaction. GP was found to inhibit the BDV reproduction by 1.8 lg. Also observed was the delay in the manifestation of the BDV cytopathic action for 24...48 hours compared to control. The data obtained in the precipitation assay indicate a significant suppression of the accumulation of BDV proteins in the cell culture in the presence of GP at the early stages (2-6 hours after infection).
Thus, GP influences the time of BDV proteins maturation in the cel culture, which may explain the observed loss of BDV infectivity following exposure to GP.
Key words: bovine virus diarrhea, flavivirus, gamapren, polyprenylphosphatis, antiviral activity, immunomodulator.
