CC BY
86
Антиоксидантные и антирадикальные свойства полифенолов в механизме гепатопротективного действия препаратов маакии амурской
Ратькин Е.В., Иванов В.В., Ратькин А.В., Чучалин B.C.
Antioxidant and antiradical properties of polyphenols in the mechanism hepatoprotective actions of preparations Maackia amurensis
Ratkin Ye.V, Ivanov V.V., Ratkin A.V., Chuchalin V.S.
Для выяснения роли антиоксидантных и антирадикальных свойств полифенолов в механизмах гепатопротективного действия препаратов из маакии амурской исследована активность препаратов из ядровой древесины (максар), экстракта клеточной культуры маакии амурской, мономерных и димерных стильбенов. Антирадикальные свойства препаратов измеряли по способности взаимодействовать со стабильным радикалом дифенилпикрилгидразилом (ДФПГ). Установлено, что для максара, поли-фенольного комплекса маакии амурской (ПКМА), мономерных и димерных стильбенов отсутствуют корреляции между антирадикальной активностью данных препаратов из ПКМА в модельной системе с ДФПГ и их гепатопротективным эффектом in vivo. Мономерные и димерные стильбены, обладающие наиболее высокой антирадикальной активностью, оцененной по их способности восстанавливать стабильный радикал ДФПГ, не проявили выраженной гепатопротективной активности при гепатите.
Ключевые слова: маакия амурская, максар, стильбены, гепатопротекторы, антиоксидантная и антирадикальная активность.
For finding-out of a role antioxidant and antiradical properties of poly-phenols in mechanisms hepatoprotective actions of preparations from Maackia amurensis activity of preparations from ядровой wood (Macsar), an extract of cellular culture Maackia amurensis, stilbens. Antiradical properties of preparations measured on ability to cooperate with difenilpikrilgidrazilom (DPPH). It is established, that for Macsar, PKMA, monomeasured and dimeric Stilbenes is absent correlations between antiradical activity of the given preparations from a polyphenolic complex Mauck Amur in modelling system with DPPH and them hepatoprotective effect in vivo. Monomeasured and dimeric stilbenes, possessing the highest antiradical activity appreciated on their ability to restore stable radical DPPH, have not shown expressed hepatoprotective activity at a hepatites.
Key words: Maakia amurensis, Macsar, stilbens, hepatoprotectors, аntioxidant and antiradical activity.
Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
© Ратькин Е.В., Иванов В.В., Ратькин А.В., Чучалин B.C.
УДК 615.322:582.736:615.244.014.425
Введение
стильбены: сцирпусин А, сцирпусин В, маакин, маа-кин А и стильбенолигнан мааколин. Большинство данных фенольных соединений из маакии амурской показали высокую антирадикальную и антиоксидантную активность, сопоставимую с эффектом синтетического антиоксиданта ионола [1, 6—8].
В Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН (г. Владивосток) совместно с кафедрами фармацевтической технологии и фармакологии Сибирского государственного медицинского университета (г. Томск) разработан гепатопротективный препарат на основе полифенольного комплекса маа-кии амурской (ПКМА). В состав препарата входят изофлавоны: генистеин, даидзеин, ретузин, афромо-зин, формононетин, оробол, текторигенин, 3-гидрок-сивеститон, птерокарпаны (маакиаин, медикарпин); мономерные стильбены: резвератрол и пицеатаннол, изофлавоностильбен маакиазин, а также олигомерные
В связи с этим несомненный интерес представляет оценка вклада антиоксидантных и антирадикальных свойств данных полифенолов в механизмы гепатопротективного действия препаратов из маакии амурской. С этой целью была исследована активность препаратов из ядровой древесины (максар), экстракта клеточной культуры маакии амурской (ПКМА), мономерных и ди-мерных стильбенов.
Ратькин Е.В., Иванов B.B. и др.
Антиоксидантные и антирадикальные свойства полифенолов в механизме.
Материал и методы
Максар — полифенольная фракция ядровой древесины маакии амурской. В исследованиях использовали субстанцию сухого экстракта маакии амурской, содержащую по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии 21,6% полифенолов, из которых 8,9% — стильбены и 12,7% — изофлавоноиды [6—8, 11].
Полифенольный комплекс клеточной культуры маакии амурской получен в 2002 г. в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН из клеточной культуры растения с помощью экстракции 95%-м этанолом. Экстрактивный комплекс клеточной культуры Мааекла ашитет{$ (штамм А-18) состоит из изофлаво-ноидов, включая изофлавоны и птерокарпаны, а также их моно-, ди- и малонилглюкозиды. В отличие от натив-ного экстракта из ядровой древесины маакии амурской ПКМА не содержит мономерных и димерных стильбе-нов. Наработка препарата осуществлена в рамках исследований по созданию новой технологии для получения воспроизводимого источника изофлавоноидов, а также для исследования путей их биосинтеза [9, 10].
Мономерные стильбены — извлечение из полифе-нольного комплекса древесины маакии амурской, полученное методом колоночной хроматографии на силикаге-ле, содержащее сумму идентифицированных мономерных стильбенов и минорное количество изофлавоноидов. Содержание мономерных стильбенов 33,56% [12, 13].
Димерные стильбены — извлечение из полифеноль-ного комплекса древесины маакии амурской, полученное методом колоночной хроматографии на силикагеле и содержащее сумму идентифицированных димерных стиль-бенов. Содержание димерных стильбенов 50% [12, 13].
Эксперименты проведены в осенне-зимний период на 80 беспородных белых крысах-самцах массой 180—210 г. Содержание животных соответствовало Правилам лабораторной практики (приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.) Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, декапитацию) осуществляли с 09.00 до 12.00, опыты выполняли, соблюдая Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных, утвержденные МЗ РФ. В качестве экспериментальной модели для моделирования токсических поражений печени использовали масляный раствор те-трахлорметана. Схема введения препаратов исключала прямое взаимодействие на уровне желудочно-кишечного тракта. Тетрахлорметан вводили внутрижелудочно
из расчета 1,25 мл/кг массы тела животного (в 50%-м масляном растворе). Исследуемые препараты вводили в желудок с помощью зонда в наиболее эффективных терапевтических дозах, отобранных на этапе скрининга соответствующих препаратов: ПКМА и максар — в виде суспензии на 1%-м растворе крахмальной слизи в дозе 200 мг/кг массы тела (по 100 мг/кг массы тела за 2 ч до введения тетрахлорметана и спустя 2 ч после введения гепатотоксина), мономерные стильбены — в виде суспензии на 1%-м растворе крахмальной слизи в дозе 50 мг/кг массы тела (по 25 мг/кг массы тела за 2 ч до введения тетрахлорметана и спустя 2 ч после введения гепатоток-сина), димерные стильбены — в виде суспензии на 1%-м растворе крахмальной слизи в дозе 35 мг/кг массы тела (по 17,5 мг/кг массы тела за 2 ч до введения тетрахлор-метана и спустя 2 ч после введения гепатотоксина). Дозировки фракций стильбенов были рассчитаны исходя из содержания соответствующих групп веществ в максаре.
Антиоксидантную активность различных групп полифенолов из маакии амурской оценивали по гепа-топротекторному эффекту соответствующих фракций (влиянию на активность ферментативных систем).
Антирадикальные свойства комплекса полифенолов каждой фракции измеряли по их способности взаимодействовать со стабильным радикалом ДФПГ. Активность характеризовали показателем IC50, означающим эффективную концентрацию вещества, при которой восстанавливается 50% свободных радикалов ДФПГ.
Экспериментальные данные представлены в виде среднего арифметического М и стандартной ошибки среднего т. Сравнение средних между группами проводили по непараметрическому Д-критерию Краскала— Уоллиса, различия в группах считали значимыми при p < 0,05. Расчеты проводили с использованием программы Statistica 6.0 for Windows [5].
Результаты и обсуждение
В результате оценки гепатопротективной активности различных комплексов полифенолов из маакии амурской установлено, что терапия максаром и ПКМА приводила к снижению или нормализации повышенной тетрахлорметаном активности ферментативных систем печени: аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланин-аминотрансферазы (АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), кислой фосфатазы (КФ), щелочной фосфатазы (ЩФ), гамма-глутамилтранспептидазы (ГГТП) (табл. 1).
Таблица 1
Влияние максара, ПКМА, мономерных и димерных стильбенов на активность ферментов в сыворотке крови при остром СС14-гепатите
(М ± т, средние из 6—10 наблюдений)
Экспериментальная группа Показатель
АСТ, мккат/л АЛТ, мккат/л КФ, Е/л ЛДГ, мккат/л ЩФ, мккат/л ГГТП, мккат/л
Контрольная 0,59 ± 0,04 0,45 ± 0,03 16,1 ± 1,1 3,19 ± 0,13 11,55 ± 1,05 0,09 ± 0,02
СС14-гепатит 1,01 ± 0,03* 0,81 ± 0,03* 33,8 ± 4,8* 4,64 ± 0,21* 18,53 ± 0,2* 0,24 ± 0,01*
Максар + СС14 0,68 ± 0,02** 0,63 ± 0,04** 19,6 ± 1,5** 3,21 ± 0,19** 13,80 ± 0,4** 0,13 ± 0,02**
ПКМА + СС14 0,66 ± 0,04** 0,66 ± 0,02** 21,7 ± 1,4** 3,29 ± 0,03** 14,03 ± 27** 0,14 ± 0,02**
Мономерные стильбены + СС14 3,21 ± 0,69** 2,08 ± 0,26** 35,9 ± 5,4 3,40 ± 0,13** 18,75 ± 2,58 0,22 ± 0,03
Димерные стильбены + СС14 0,87 ± 0,08 1,01 ± 0,54 40,2 ± 8,6 3,54 ± 0,15** 17,07 ± 4,91 0,25 ± 0,02
Примечание. * — р < 0,05 по отношению к контрольным животным для СС14-гепатита; ** — р < 0,05 по отношению к СС14-гепатиту для препаратов.
Известно, что в механизме токсического действия СС14 лежит его способность генерировать преимущественно в печени СС13, которые инициируют перекисное окисление липидов (ПОЛ) в мембранах гепатоцитов.
По всей видимости, изофлавоноиды, присутствующие в данных препаратах, обладают лиофильностью, за счет чего встраиваются в мембраны гепатоцитов и ингибируют в них процессы липопероксидации, а также предохраняют мембранные фосфолипиды от деструкции. Наряду с этим полифенольные соединения образуют хелатные комплексы с ионами железа и выключают эти катализаторы из реакций свободно-радикального окисления, что также приводит к стабилизации мембраны и прекращению диффузии в кровь печеночно-специфических ферментов [1]. Фракции, в состав которых входили только мономерные или ди-мерные стильбены, на активность данных ферментов в сыворотке крови практически не влияли, что может быть обусловлено отсутствием изофлавоноидов, которые, вероятно, и отвечают за антиоксидантные свойства препаратов из маакии амурской.
Результаты определения антирадикальной активности показали, что среди ПКМА, максара, мономерных и димерных стильбенов фракция димерных стильбенов наиболее эффективно восстанавливала стабильный радикал ДФПГ в диапазоне концентраций от 0,5 до 10,0 мкг/мл и обладала наиболее выраженной антирадикальной активностью. Показатели у максара и мономерных стильбенов были практически одинаковыми, ПКМА проявил наименьшую антирадикальную активность, по-видимому, из-за отсутствия в своем составе группы стильбенов (табл. 2).
Таблица 2
Антирадикальная активность ПКМА, максара, мономерных и димерных стильбенов на модели ингибирования ДФПГ (IC50)
Исследуемый образец Степень ингибирования 1С50, мкг/мл
Максар 7,5
ПКМА 22,9
Мономерные стильбены 7,0
Димерные стильбены 4,9
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии корреляции между антирадикальной активностью данных препаратов из ПКМА в модельной системе и их гепатопротективным эффектом in vivo. Мономерные и димерные стильбены, обладающие наиболее высокой антирадикальной активностью, оцененной по их способности восстанавливать стабильный радикал ДФПГ, не проявили выраженной гепатопротективной активности при экспериментальном гепатите.
Этот факт позволяет предположить, что в реализации in vivo гепатопротективного эффекта препаратов из маакии амурской основное значение имеет не их способность непосредственно взаимодействовать с активными радикалами, а в первую очередь регулирующее влияние полифенолов на деятельность ряда ферментных комплексов, возможно, через антиоксидант-респонсивный элемент, а также способностью оказывать антиоксидантное и мембрано-стабилизирующее действие.
Aнmиoксиданmные и анmиpадикальные свойшва полифенолов в механизме...
Ратькин Е.Б., Иванов В.В. и др. Выводы
1. Для максара, ПКМА, мономерных и димерных стильбенов отсутствуют корреляции между антирадикальной активностью данных препаратов из поли-фенольного комплекса маакии амурской в модельной системе с дифенилпикрилгидразином и их гепатопро-тективным эффектом in vivo.
2. Фракции мономерных и димерных стильбенов определяют антирадикальную активность суммарного экстракта полифенольного комплекса маакии амурской.
3. Гепатопротективное действие препаратов из маакии амурской в первую очередь связано с наличием антиоксидантных свойств у полифенолов, входящих в состав комплекса.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 09-04-99130.
Литература
1. Белобородова Э.И., Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Влияние гепатозащитных средств на антитоксическую функцию печени // Сиб. журн. гастроэнтерологии и гепа-тологии. 2000. № 10. С. 75-77.
2. Венгеровский А.И., Седых И.М., Власова Т.В., Сарати-ков А.С. Гепатозащитные свойства полифенолов маакии амурской при экспериментальной токсической патологии печени // Растит. ресурсы. 1993. № 3. С. 95—99.
3. Венгеровский А.И., Седых И.М., Саратиков A.C. Влияние полифенолов маакии амурской на антитоксическую функ-
цию печени // Эксперим. и клинич. фармакология, 1993. Т. 56, № 5. С. 47-49.
4. Власова Т.В., Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Полифенолы маакии амурской — эффективное гепатозащитное и желчегонное средство // Хим.-фарм. журн. 1994. Т. 28, № 3. С. 56—59.
5. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998, 459 с.
6. Кулеш НИ., Максимов О.Б., Глебко ЛИ. и др. «Максар» — гепатозащитный препарат из дальневосточного растительного сырья // Тез. докл. на регион. ассамблее: здоровье населения Дальнего Востока. Владивосток, 1996. 263 с.
7. Федореев С.А., Кулеш Н.И., Глебко Л.И. и др. Препарат максар из дальневосточного растения маакии амурской // Хим.-фарм. журн. 2004. Т. 38, № 11. С. 22—26.
8. Федореев С.А., Кулеш Н.И., Веселова М.В. и др. Препарат максар из маакии амурской — эффективное гепатозащитное средство // Материалы региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии»: сб. тез. докл. Владивосток, 2004. С. 98—99.
9. Fedoreyev S., Bulgakov V. Isoflavonoid composition of the Maackia amurensis callus culture // Journal of Biotechnology. 2008. V. 136. P. 140—143.
10. Fedoreyev S.A., Pokushalova T.V., Veselova M.V. et al. Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis // Fitoterapia. 2000. V. 71. P. 365—372.
11. Fedoreyev S.A., Kulesh N.I., Glebko L.I. et al. Maksar: a preparation based on Amur Maackia / // Pharm. Chem. J. 2004. V. 38. P. 605—610.
12. Kulesh N.I., Denisenko V.A., Maksimov O.B. Stilbenolig-nan from Maackia amurensis // Phytochemistry. 1995. V. 40, № 3. P. 1001—1003.
13. Kulesh N.I., Maksimov O.B., Denisenko V.A. et al. Isoflavo-noids from heartwood of Maackia amurensis Rupr. et Maxim // Chem. of Natural Compounds. 2001. V. 37, № 1. P. 29—31.
Поступила в редакцию 01.04.2011 г.
Утверждена к печати 01.06.2011 г.
Сведения об авторах
Е.В. Ратькин — ассистент кафедры фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск). В.В. Иванов — канд. биол. наук, доцент кафедры биохимии СибГМУ (г. Томск).
A.В. Ратькин — канд. фарм. наук, доцент кафедры фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск).
B.C. Чучалин — д-р фарм. наук, зав. кафедрой фармацевтической технологии СибГМУ (г. Томск).
Для корреспонденции
Чучалин Владимир Сергеевич, тел.: 8-913-116-4343, 8 (3822) 42-09-58; е-mail: [email protected]
