CC BY
25
УДК 661. 185.1: 599.323.4:612.35: 57.015.2
Боднар Ю.В., Кузьмша Н.В., Сачко Р.Г., Осташв Д.Д.
E-mail: [email protected] Incmumym бюлогптваринНААН, мЛъвгв
АНТИОКСИДАНТНИЙ ЗАХИСТ ТА 1НТЕНСИВН1СТЬ СИНТЕЗУ СТАТЕВИХ ГОРМОН1В ЗА КУЛЬТИВУВАННЯ КЛ1ТИН ГРАНУЛЬОЗНОГО ШАРУ ФОЛ1КУЛ1В KOPIB
Досл1джували актиетстъ ензиматичног ланки антиоксидантного захисту та ттенсивтстъ утворення стерогдних гормотв клтинами гранулъозного шару фолгкулгв яечнитв xopie за кулътивування. Для проведения дослгдженъ вгдбирали яечники Kopie eidnoeidno до ф1зюлог1чного стану: «св1жог овуляцп», «раннъого» i «тзнъого жовтого тыа» та «фолЫулярного зростання». Для дослгдженъ використат cmameei залози Kopie з фол1кулами розм1ром до 4 мм (мал1), 4 - 7 мм (середт) i понад 7 мм (велит). Встановлено, що клтини гранулъози за кулътивування проявляютъ актиетстъ ernuMie антиоксидантного захисту: супероксиддисмутази - 6,8 - 19,8 MO/ мг бтка, глутатюнпероксидази i каталази, eidnoeidno, 0,08 - 1,14 та 0,28 - 0,57 мкмолъ/хвх-мг быка. При цъому, для кулътури клтин характернии синтез i нагромадження стерогдних гормоте в cepeдoвuщi кулътивування (нмолъ/л): тестостерону - 0,04 - 1,75, естрадюлу - 4,2 - 11,3 i прогестерону - 17,7 - 77,0. 1нтенсивтстъ утворення гормоте клтинами гранулъози за кулътивування in vitro залежитъ eidpo3Mipy фoлiкyлiв i фiзioлoгiчнoгo стануяечниюв кopiвзякux вони вилучет. Наивищою ттенсивтстю синтезу статевих гормотв за кулътивування in vitro характеризуется гранулъоза з великих фoлiкyлiв яечника «тзнъого жовтого тыа» (нмолъ/л): тестостерону - 5,8±1,81, естрадюлу -11,3±2,00 i прогестерону - 77,0±12,70. Виявлено, що актиетстъ ензиматичног ланки антиоксидантного захисту клтин характеризуе ттенсивтстъ синтезу стерогдних гормотв культурою гранулъози.
Ключое1 слова: ензими антиоксидантного захисту, концентращя гормотв, гранулъоза, кулътивування, фол^л, яечник, корови
УДК 661. 185.1: 599.323.4:612.35: 57.015.2
Боднар Ю.В., Кузьмина Н.В., Сачко Р.Г., Остапив Д.Д.
Институт биологии животных НААН, г. Львов
АНТНОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА И ИНТЕНСИВНОСТЬ СИНТЕЗА
ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ КЛЕТОК ГРАНУЛЕЗНОГО ШАРА ФОЛЛИКУЛОВ КОРОВ
Исследовали активность энзиматического звена антиоксидантнои защиты и интенсивность образования стероидных гормонов клетками гранулезного шара фолликулов яичников коров при культивировании. Для проведения исследовании отбирали яичники коров соответственно
17
физиологическому состоянию: «свежей овуляции», «раннего» и «позднего желтого тела» и «фолликулярного роста». Для исследовании использовали половые железы коров с фолликулами размером до 4 мм (малые), 4 - 7 мм (средние) и больше 7 мм (большие). Установлено, что клетки гранулезы при культивировании проявляют активность энзимов антиоксидантной защиты: супероксиддисмутазы - 6,8 -19,8 МО/ мг белка, глутатионпероксидазы и каталазы, соответственно, 0,08 -
I,14 та 0,28 - 0,57 мкмолъ/мин^мг белка. При этом, для культуры клеток характерный синтез и накопление стероидных гормонов в среде культивирования (нмоль/л): тестостерона - 0,04 - 1,75, эстрадиола - 4,2 - 11,3 и прогестерона - 17,7 - 77,0. Интенсивность образования гормонов клетками гранулезы при культивировании in vitro зависит от размера фолликулов и физиологического состояния яичников коров с которых они получены. Наивысшей интенсивностью синтеза половых гормонов при культивировании in vitro характеризируется гранулеза с больших фолликулов яичника «позднего желтого тела» (нмоль/л): тестостерона - 5,8±1,81, эстрадиола - 11,3±2,00 и прогестерона - 77,0±12,70. Выявлено, что активность энзиматического звена антиоксидантной защиты клеток характеризирует интенсивность синтеза стероидных гормонов культурой гранулезы.
Ключевые слова: энзимы антиоксидантной защиты, концентрация гормонов, гранулеза, культивирование, фолликул, яичник, коровы
UDC 661. 185.1: 599.323.4:612.35: 57.015.2
Bodnar Yu.V., Kuzmina N.V., Sachko R.G., Ostapiv D.D.
Institute of animal biology NAAS, Lviv
ANTIOXIDANT DEFENSE AND INTENSITY OF HORMONE SYNTHESIS AT COW OVARIAN FOLLICLE OF GRANULOSE LATER CULTIVATION
Activity of antioxidant defense enzymatic link and intensity of steroid hormone synthesis at at cow ovarian follicle of granulose layer cultivation were studied. For studies cow ovaries with physiological state: "fresh ovulation", "early" and "late corpora lutea" and "follicular growth" were extirpated. For researches cow gonades with follicle size till 4 mm (small), 4-7 mm (average), over 7 mm (big) were used. It is set that granulose cells when cultivating have such activity of antioxidant defense enzymes: superoxide dismutase - 6,8 - 19,8 Ul/mg of protein, glutathione peroxidase and catalase, correspondingly, 0,08 - 1,14 and 0,28 - 0,57 ¡xmol/ mim^mg of protein. Herewith, granulose culture characterizes by synthesis and accumulation of steroid hormones in cultivation medium (nmol/l): testosterone - 0,04 - 1,75, estradiole - 4,2 - 11,3 and progesterone - 17,7 - 77,0. Intensity of granulose cell hormone synthesis at cultivation in vitro depends on follicle size and cow ovarian physiological state from which they are extirpated. Granulose from big ovarian follicles of "late corpora lutea" is characterized by highest sex hormones synthesis intensity at cultivating in vitro (nmol/l): testosterone - 5,8±1,81, estradiole -
II,3±2,00 and progesterone - 77,0±12,70. Activity of cell antioxidant defense enzymatic link characterizes steroid hormone synthesis intensity by granulose culture.
18
Key words: antioxidant defense enzymes, hormone concentration, granulose, cultivation, follicle, ovary, cows.
Клггини гранульозного шару фол1кул1в яечниюв засвоюють поживш речовини середовищ культивування, проявляють дихальну актившсть i продукують статев1 гормони. В процес1 окисного метабол1зму утворюються активш форми кисню (АФК), для знищення яких у кл1тинах функцюнуе ефективна система антиоксидантного захисту (АОЗ), що складаеться з двох ланок: ензиматично! i неензиматично!. Знешкодження АФК за учасп ензиматично! системи АОЗ здшснюеться супероксиддисмутазою (СОД; EC 1.15.1.1), каталазою (КАТ; EC 1.11.1.6) i селензалежною та незалежною глутатюнпероксидазами (ГПО; GSH-Px; EC 1.11.1.9). СОД перетворюе супероксид - анюн в реакци дисмутаци на перекис водню i молекулярний кисень. Знищення перекису водню здшснюеться КАТ чи ГПО. У пероксидазнш реакци вщновлена форма глутатюну (rSH) окиснюеться до TSSr (окиснено! форми глутатюну). У кл!тиш TSSr вщновлюеться за участ! НАДФН i глутатюнредуктази (ГР; GSSG - Rx; EC 1.6.4.27). Актившсть вказаних ензим1в кл1тин фол1кул1в яечниюв залежить вщ багатьох фактор1в. Зокрема встановлено, що актившсть ензим1в АОЗ у фолжулярнш рщиш i кл1тинах фол1кул1в залежить вщ в1ку [1]. 3 в1ком знижуеться вщношення м1ж актившстю ензим1в: каталаза / СОД, що спричиняе нагромадження АФК i викликае оксидативний стрес. Автори пов'язують нагромадження АФК з наростанням гшоксичних явищ, порушенням мшроциркуляцп i функцш кл1тин гранульозного шару [2]. KpiM цього, важливе значения для функцюнування кл1тин фол1кул1в мають гормони. Встановлено, що ФСГ стимулюе синтез глутатюну (rSH) i пщвищуе антиоксидантний захист культури гранульози [3]. При цьому, бшьш активний синтез i зростання вмюту вщновлено! форми глутатюну проявляеться за присутност! естрадюлу [4]. Под1бну залежшсть вщ р1вня гормошв (штенсивност! стерощогенезу) виявлено при вивченш активност1 СОД в фол1кулах i кл1тинах гранульози [5].
Оскшьки кл1тини гранульози проявляють актившсть ензим1в ферментативно! ланки антиоксидантного захисту i здатш синтезувати статев! гормони in vitro, вивчали актившсть СОД, ГПО i КАТ та концентрацию естрадюлу, прогестерону i тестостерону в культур! кл1тин за тривалого культивування.
Матер1ал i методи. Для дослщжень пвдбраш клмчно здоров! корови-аналоги украшсько! чорно-рябо! молочно! породи, вжом 6 - 8 роюв. Шсля забою кор1в вщбирали яечники р1зного ф!зюлопчного стану [6]: фолжулярного зростання (без жовтого тша); 3i св1жою овулящею (на тещ фолжула е вщтулина, жовте тшо вщсутне або червоного кольору, д1аметром до 0,5 см); з раншм жовтим тшом (червоного або брунатного кольору, д1аметром 1,0-2,0 см); з шзшм жовтим тшом (жовтого кольору, д1аметром 0,5-1,5 см). Для дослщжень використаш статев! залози кор!в з фол1кулами розм1ром до 4 мм (мал!), 4 - 7 мм (середш) i понад 7 мм (велим). Для отримання кл1тин гранульози асшрували фол1кули, антральну рщину центрифугували 10 хв при 2000 об/хв, супернатант
19
вщдшяли, а осад кл1тин суспендували в середовищах культивування кл1тин: Basal Medium Eagle (ВМЕ) i RPMI-1640 з додаванням (в мас.%): еструсно! сироватки Kopie 8-12 %; фолкулярно! рщини - 10-12 %, гепарин (5 тис. од.) -0,0005-0,0015). У культур! кл1тин визначали: актившсть супероксиддисмутази -за кшьюстю штроформазану, що утворюеться в реакци м1ж феназинметасульфатом та НАДИ (МО/ мг бшка) [7], каталази методом КоролюкМ.А. та ш. (мкмоль/хв*мг бшка) [8], глутатюнпероксидази - з використанням реактиву Елмана (мкмоль/хв*мг бшка) [9] i концентрацию гормошв (естрадюлу, прогестерону i тестостерону; нмоль/л середовища культивування кл1тин) - ¿муноферментним методом з використанням набор1в реактив1в ф1рми «DRG». Статистичний анал1з отриманих результате проведено заМ.О. Плохшським [10].
Результата дослщження. Кл1тини гранульози за культивування проявляють актившсть ензим1в АОЗ: СОД - 12,4±0,74 МО/ мг бшка, ГПО i КАТ, вщповщно, 0,61±0,06 та 0,39±0,02 мкмоль/хв*мг бшка i характеризуються синтезом гормошв: тестостерону - 1,6±0,36, естрадюлу - 7,5±0,70 i прогестерону - 37,9±3,74 нмоль/л (табл. 1, 2). Актившсть ензим1в антиоксидантного захисту i утворення гормошв гранульозою впродовж культивування залежать вщ ф1зюлопчного стану яечниюв.
Таблиця 1
Актившсть ензим1в антиоксидантноТ системи за ¡нкубування кл1тин
гранульози, M±m
Стан яечника Фоткуп, мм n Вм1ст б1лка, мг/мл Активн1сть ензим1в
СОД, МО/ мг бшка ГПО, мкмоль/ хв*мг бшка КАТ, мкмоль/ хв*мг бшка
Св1жа овуляцш > 7 3 11,1±3,32 17,8±5,48 0,24±0,05 0,56±0,15
4 - 7 3 11,9±3,64 17,0±4,95 0,25±0,07 0,54±0,16
4 < 3 8,2±1,63 19,8±3,75 0,27±0,04 0,57±0,18
Ранне жовте тшо > 7 5 15,2±3,60 9,3±3,18 1,14±0,02 0,33±0,04
4 - 7 3 21,0±4,15 6,8±1,72 0,09±0,02~" 0,28±0,04
4 < 3 16,1±3,52 8,2±1,96 0,08±0,01~" 0,40±0,05
Шзне жовте тшо > 7 9 10,8±2,96 18,9±3,99 0,80±0,22 0,53±0,09
4 - 7 6 13,3±5,17 17,5±4,99 0,83±0,37 0,55±0,10
4 < 7 12,8±5,03 14,1±3,47 1,01±0,37 0,51±0,08
Фолжуля рний picT > 7 33 15,1±2,15 12,2±1,47 0,72±0,12 0,50±0,06
4 - 7 29 16,3±2,18 11,1±1,38 0,57±0,09 0,30±0,04
4 < 31 14,5±1,53 11,4±1,24 0,61±0,12 0,31±0,04
Примака. Р1зниця статистично в1ропдна пор1вняно з максимальною величиною показника: ***р<0,001
За час культивування висока актившсть СОД проявляеться у кл1тин з фол1кул1в статево! залози «св1жо! овуляци» та «тзнього жовтого тша» (17,0 -18,2 МО/ мг бшка), нижча на 31,8 - 36,3 % «фолжулярного росту» I найменша «раннього жовтого тша» (8,1±1,41 МО/ мг бшка). Р1зниця м1ж максимальною I мш1мальною величинами значень показника - 55,5 % (р < 0,01). Под1бну залежшсть виявлено при дослщженш ензим1в, яю перетворюють Н202. Актившсть ГПО низька за «раннього жовтого тша» (0,09±001 мкмоль/хв*мг бшка), на 64,0 % збшьшуеться при «св1жш овуляци» I ще на 86,0 - 89,7 %
20
(р < 0,001) вища при «фолжулярному росл» та «тзньому жовтому тш». Аналопчно, актившсть КАТ понижена за «раннього жовтого тша» \ «фол1кулярного росту» (0,34 - 0,36 мкмоль/хв*мг бшка) та вища за «св1жо! овуляци» I «тзнього жовтого тша» (0,53 - 0,56 мкмоль/хв*мг бшка).
При цьому, найвища концентрация гормошв встановлена в культур! кл1тин з1 статево! залози «тзнього жовтого тша»: тестостерону - 3,3±1,28, естрадюлу -9,1±1,30 1 прогестерону - 58,0±11,15 нмоль/л (табл. 2). Нижча здатшсть утворювати тестостерон (на 39,4 %) характерна для кл1тини з яечниюв «фол1кулярного росту», ще менша (на 60,4 %) «св1жо! овуляци» I найнижча «раннього жовтого тша» (0,40±0,12 нмоль/л). Р1зниця м1ж максимальною I мш1мальною величинами значень - 87,9 % (р < 0,05). Аналопчно, нижчу на 15,4 - 18,7 % штенсившсть утворення естрадюлу (7,4 - 7,7 нмоль/л), пор1вняно з максимальним значениям, забезпечуе культивування гранульози з яечниюв «раннього жовтого тша» I «фол1кулярного росту» та ще меншу (на 45,1 %) - з1 «св1жо1 овуляци».
Таблиця 2
Концентращя гормошв в середовищ1 за культивування гранульози, М±т
Стан яечника Фолвуп, мм п Концентращя гормошв, нмоль/л
Тестостерон Естрадюл Прогестерон
Св1жа овуляцш > 7 3 1,75±0,25 4,2±2,20 54,0±10,61
4 - 7 3 1,22±0,37 4,7±0,40 68,0±8,16
4 < 3 1,00±0,57 5,7±0,60 37,0±9,18*
Ранне жовте тшо > 7 5 0,50±0,21 7,8±2,50 59,1±11,13
4 - 7 3 0,58±0,15 6,8±2,30 17,7±3,07**
4 < 3 0,04±0,01** 8,6±3,0 18,9±3,76**
Шзне жовте тшо > 7 9 5,8±1,81 11,3±2,0 77,0±12,70
4 - 7 6 0,61±0,41* 10,3±1,90 49,2±18,41
4 < 7 1,01±0,69 5,3±1,30* 44,0±20,14
Фолжуля-рний р1ст > 7 33 2,40±1,23 7,9±1,60 50,5±14,36
4 - 7 29 2,50±1,07 7,6±2,40 34,3±12,96
4 < 31 0,91±0,56 6,5±3,0 24,0±11,78
Примака. Р1зниця статистично в1ропдна пор1вняно з максимальною величиною показника: * р<0,05; **р<0,01
На вщмшу, за культивування кл1тин майже однакова концентращя прогестерону, пор1вняно з максимальним значениям, виявлена у культур! кл1тин з яечника «св1жо! овуляци» (52,9±7,13 нмоль/л) I нижча на 37,6 - 45,0 % з «раннього жовтого тша» та «фолжулярного росту». Отже, понижена актившсть ензиматично! системи АОЗ у культур! кл1тин проявляеться низьким синтезом тестостерону, а активування ензим1в - характеризуе високу естрогенсинтезуючу здатшсть гранульози.
Актившсть ензим1в АОЗ та штенсившсть синтезу гормошв гранульози впродовж культивування залежать вщ розм1ру фол1кул1в, з яких вилучеш кл1тини. У кл1тин з фол1кул1в менше 4 мм понижена актившсть СОД - 12,0±1,14 МО/ мг бшка, ГПО - 0,62±0,11 мкмоль/хвхмг бшка I КАТ - 0,35±0,04 мкмоль/хвхмг бшка, а за розм1ру бшьше 7 мм величини значень вищ1,
21
вщповщно, на 11,2, 8,9 i 30,0 %. При цьому, найнижча концентрация гормошв виявлена за культивування кл1тин з малих фол1кул1в (менше 4 мм): тестостерону - 0,7±033, естрадюлу - 6,9±1,60 i прогестерону - 27,0±6,05 нмоль/л. Збшьшення розм1ру фол1кул1в до 7 мм характеризуе штенсившший синтез гормошв кл1тинами: на 58,9 % - тестостерону, на 8,0 % - естрадюлу i на 22,0 % - прогестерону i при бшьше 7 мм величини значень ще вищ1, вщповщно, на 75,0, 16,9 1 54,4 %.
Под1бну залежшсть встановлено м1ж актившстю ензим1в АОЗ за культивування гранульози, залежно вщ розм1ру фол1кула та ф1зюлопчного стану яечника, i синтезом гормошв кл1тинами. Так, найвищ1 величини активное^ ензим1в встановлеш при культивуванш кл1тин з великого фолжула яечника «шзнього жовтого тша»: СОД - 18,9±3,99 МО/ мг бшка, ГПО i КАТ, вщповщно, 0,80±0,22 i 0,53±0,09 мкмоль/хв*мг бшка. Найнижч1 величини значень ензим1в АОЗ характерш для культури гранульози з фол1кул1в яечника «раннього жовтого тша»: СОД (6,8±1,72 МО/ мг бшка) i КАТ (0,28±0,04 мкмоль/хвхмг бшка) - з середнього та ГПО (0,08±0,01 мкмоль/хв*мг бшка) - з малого. При цьому, висока концентращя гормошв виявлена у культур! кл1тин з фол1кул1в бшьше 7 мм яечника «шзнього жовтого тша» (тестостерон - 5,8±1,81, естрадюл - 11,3±2,00 i прогестерон - 77,0±12,70 нмоль/л). Низью величини дослщжуваних показник1в за культивування гранульози: тестостерону (0,04±0,01 нмоль/л) i прогестерону (17,7±3,07нмоль/л) встановлеш з фол1кул1в яечниюв, вщповщно, з малих i середшх «раннього жовтого тша», а естрадюлу (4,2±2,20 нмоль/л) - з великих «св1жо! овуляцп».
Таким чином, актившсть ензим1в АОЗ кл1тин гранульози впродовж культивування залежить вщ розм1ру фол1кула та ф1зюлопчного стану яечника. Висока актившсть СОД, ГПО i КАТ характеризуе штенсивний синтез естрогешв та ix нагромадження в середовищ1 культивування, а понижений антиоксидантний захист кл1тин гранульози проявляеться однозначним зниженням утворення гормошв.
Висновки:
1.Кл1тини гранульози за культивування проявляють актившсть ензим1в антиоксидантного захисту: СОД - 12,4±0,74 МО/ мг бшка, ГПО i КАТ, вщповщно, 0,61±0,06 та 0,39±0,02 мкмоль/хв*мг бшка.
2.Для культури гранульози характерний синтез i нагромадження стерощних гормошв в середовищ1 культивування: тестостерону - 1,6±0,36, естрадюлу - 7,5±0,70 i прогестерону - 37,9±3,74 нмоль/л.
3.1нтенсившсть утворення гормошв кл1тинами гранульози за культивування in vitro залежить вщ po3Mipy фол1кул1в i ф1зюлопчного стану яечниюв кор1в, з яких вони вилучеш.
4. Актившсть ензиматично! ланки АОЗ характеризуе здатшсть та штенсившсть синтезу стерощних гормошв кл1тинами гранульози.
Л1тература
1.Carbone М. C. Antioxidant enzymatic defences in human follicular fluid: characterization and age-dependent changes. / M. C. Carbone, C. Tatone, S. Delle
22
Monache, R. Marci, D. Caserta, R. Colonna // Molecular Human Reproduction. — 2003. — V. 9. — № 11. — P. 639 - 643.
2.Friedman C. Follicular fluid vascular endothelial growth factor concentrations are elevated in women of advanced reproductive age undergoing ovulation induction. / C. Friedman, D. R Danforth, C. Herbosa-Encarnacion, L. Arbogast, B. M. Alak, D. B. Seifer // Fertil. Steril. — 1997. — V. 68. — P. 607 - 612.
3.Tsai-Turton M. Opposing effects of glutathione depletion and FSH on reactive oxygen species and apoptosis in cultured preovulatory rat follicles. / M. Tsai-Turton, U. Luderer // Endocrinology. — 2006. — V. 147. — P. 1224 - 1236.
4.Yvonne D. Ulrike Luderer Follicle-stimulating hormone and estradiol interact to stimulate glutathione synthesis in rat ovarian follicles and granulosa cells. / D. Yvonne, N. Brooke, Nakamura // Biol. Reprod. — 2009. — V. 81. — P. 636 - 646.
5.Catherine M. H. Profiling of superoxide dismutase isoenzymes in compartments of the developing bovine antral follicles Reproduction. / M. H. Catherine, A. Emily, Holick, J. Louis Paolella, C. David // Qiaqia Wu Walker. — 2010. —V. 139. — P. 871 - 881.
6.Гузеватий О. £. Оцшка функционального стану ооцит-кумулюсних комплекЫв кор1в залежно вщ типу яечника / О. £. Гузеватий, В. В. Ясшський, Л. В. Смулка та ш. // Вкник аграрно! науки. — 1995. — № 11. — С. 94 - 98.
7. Чевари С. H. Определение антиоксидантних параметров крови и их диагностическое значение в пожилом возрасте / С. Н. Чевари, Т. А. Андян, Я. И. Штренгер // Лаб. дело. — 1991. — № 10. — С. 9 - 13.
8.Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М. А Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова, В. Е. Токарев // Лаб. дело. — 1991. — №12. — С. 16 - 19.
9.Моим В.М. Простой и специфический метод определения глутатионпер оксид азы в еритроцитах. / В. М. Моим / Лаб. дело. — 1986. — №12. — С. 724 - 727.
10. Плохинский Н. А. Биометрия. / Н. А. Плохинский // М.: МГУ. — 1970. — С. 53 - 60.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Шаловило С.Г.
23
