CC BY
81
УДК 581.198
A.A. торопова я.г. Газуваева C.M. Николаев 2, A.B. Федоров З.Г. Самбуева 1
АНТИОКСИДАНТНАЯ И МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ ЭКСТРАКТОВ LoMAToGoNIUM CARINTHIACUM (WULF.) REICHENB. И HYpECoUM ERECTUM L. В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ
1ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (Улан-Удэ) 2 ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (Улан-Удэ)
В представленной работе проведено исследование антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности, сухих экстрактов Lomatogonium. carinthiacum (Wulf.) Reichenb. и. Hypecoum erectum L. Установлено, что исследуемые экстракты, оказывают, антиоксидантное и. мембраностабилизирующее действие, обусловленное способностью к инактивации, активных форм, кислорода и. ингибированию перекисного окисления, липидов.
Ключевые слова: Lomatogonium carinthiacum, Hypecoum erectum, экстракт, антиоксидантная активность, ДФПГ, супероксид-радикалы, оксид азота
IN vITRo ANTIOXIDANT AND MEMBRANE STABILITY ACTIVITIES OF EXTRACTS FROM LoMAToGoNIUM CARINTHIACUM (WULF.) REICHENB. AND HYpECoUM ERECTUM L.
A.A. Toropova Ya.G. Razuvayeva S.M. Nikolayev 2, A.V. Fiodorov 2, Z.G. Sambuyeva 1
11nstitute of General and Experimental Biology SB RAS, Ulan-Ude
2 Buryat State University, Ulan-Ude
In the present study the antioxidant and membrane stability activities of Lomatogonium. carinthiacum. (Wulf.) Reichenb. and Hypecoum. erectum. L. extracts was determined, using in vitro methods. It was found, that the remedies shown expressed, antioxidant and. membrane stability activities as a result of inactivation, of the reactive oxygen forms and. inhibition, of lipids peroxidation, process.
Key words: Lomatogonium carinthiacum, Hypecoum erectum, extract, antioxidant activity, DPPH, superoxide-radicals, nitrogen oxide
В последнее время исследования патогенеза заболеваний печени, а также ряда других органов обогатились раскрытием молекулярных механизмов повреждения клеточных структур. Как известно, основным фактором их повреждения являются активные формы кислорода (АФК). При этом развивающийся окислительный стресс играет важную, если не ключевую, роль в патогенезе заболеваний печени. Содержание свободных радикалов и метаболитов свободных радикалов возрастает в условиях алкогольной интоксикации, при повреждении печени и воспалении (независимо от этиологии), дефиците антиоксидантов, гипоксии, воздействии некоторых лекарств. Поэтому вполне оправдан поиск новых подходов и средств подавления свободнорадикальных процессов и активации реакций антиоксидации [14, 15].
В связи с этим актуальным представляется применение фитопрепаратов в комплексной фармакотерапии заболеваний печени и желчевыводящих путей. Известно, что фитосредства обладают такими важными преимуществами, как малая токсичность, высокая эффективность, возможность длительного применения без побочных эффектов, а также их взаимозаменяемость [6]. В этом аспекте особый интерес представляют растения, применяемые в народной и традиционной медицине. В частности, в многовековой практике тибетской и монгольской медицины при лечении заболеваний
гепатобилиарной системы применяются ломатого-ниум каринтийский и гипекоум прямой.
Lomatogonium carinthiacum (Wulf.) Reichenb. содержит иридоиды, алкалоиды, флавоноиды, ксантоны [8, 17]. В тибетской и монгольской медицине L. carinthiacum применяется при остром и хроническом гепатите, болезнях желчного пузыря и желчевыводящих путей. Кроме того, готовые формы из данного сырья используются при дерматитах и различных инфекционных заболеваниях. В народной медицине готовые формы из L. carinthiacum применяются как возбуждающие аппетит и улучшающие пищеварение. Настой L. сarinthiacum в экспериментах на животных оказывает диуретическое действие [5].
Hypecoum erectum L. содержит алкалоид гипе-корин, гипекоринин, протопин, фумаритин, санг-винарин, синактин; каротиноиды [9]. Препараты H. erectum оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и выраженное гипотензивное действие; обладают вирусостатическим, антибактериальным свойствами. В тибетской медицине, а также в Монголии и Сибири настой H. erectum применяется при инфекционных и онкологических заболеваниях, а также при заболеваниях зубов и слизистой полости рта [1].
Ранее в экспериментах была показана выраженная желчегонная активность указанных экстрактов [10, 11].
Целью настоящей работы явилось определение антиоксидантной и мембраностабилизирующей активности экстрактов сухих Lomatogonium carin-thiacum (Wulf.) Reichenb. и Hypecoum erectum L. в модельных системах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экстракты получены из сырья, собранного в Тункинском районе Бурятии в 2010 г. Антиради-кальную активность экстрактов определяли с применением DPPH-метода [16]. Влияние исследуемых средств на связывание супероксидных анион-радикалов (О2 -) определяли в неэнзиматической системе феназин метосульфат / НАДН [15]; Fe2+ — хелатирующую активность определяли фенантро-линовым методом [7]; связывание молекул оксида азота (NO) — по методу [13]. Для оценки влияния экстрактов на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали модельную систему, состоящую из суспензии желточных липопротеи-дов (ЖЛП) [3].
Мембраностабилизирующую активность экстрактов определяли in vitro по степени торможения перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов донорской крови [4]. Действие исследуемых фитосредств на гемолиз оценивали по сравнению с контролем (без их добавления в инкубационную среду). Полученные результаты подвергали логарифмированию по концентрационной шкале с последующим регрессионным анализом и определением величины 50 % ингибирования гемолиза эритроцитов на фоне введения указанных экстрактов (мг/мл) в инкубационную среду.
В качестве препаратов сравнения использовали кверцетин (Fluka) и аскорбиновую кислоту (Sigma). Спектрофотометрические исследования проб проводили на спектрофотометре CECIL 2011 (England) в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности.
Корреляционный анализ данных проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), а статистическую обработку — согласно рекомендациям [2].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В модельных системах in vitro, в которых происходит генерация свободных радикалов, сухой
экстракт L. carinthiacum проявляет умеренную антиоксидантную активность, а экстракт H. erectum оказывает выраженную антиоксидантную активность сопоставимую с таковой препарата сравнения — аскорбиновой кислотой (табл. 1).
В эксперименте показано, что исследуемые экстракты обладают антирадикальной активностью в отношении DPPH-радикала (ДФПГ-метод). Так, концентрация, при которой происходит 50 % ингибирование радикала (1С50) составляет: L. carin-thiacum — 65,01 мкг/мл, H. erectum — 97,12 мкг/мл, а для препаратов сравнения аскорбиновой кислоты и кверцетина данный показатель составил 4,81 и 9,90 мкг/мл, соответственно.
При изучении влияния указанных экстрактов на активные формы кислорода (О2‘- и N0) и ионы Бе2+ установлено, что они обладают способностью к их инактивации (табл. 1). В эксперименте по определению хелатирования ионов Бе2 + 1С50 для экстракта L. carinthiacum составляет 1100 мкг/мл. Для препарата сравнения — кверцетина данный показатель — > 5000 мкг/мл. Экстракт сухой H. erectum проявляет выраженную активность по связыванию ионов Бе2+ (1С50 = 180,00 мкг/мл), сопоставимую с таковой препарата сравнения — аскорбиновой кислотой (1С50 = 150,00 мкг/мл). По-видимому, Бе-хелатирующая активность H. erectum обусловлена наличием преимущественно в его химическом составе флавоноидов (производных рутина, изорамнетина) [9].
В отношении связывания супероксид-анион радикалов (О2‘-) характерна умеренная активность для сухого экстракта L. carinthiacum (1С50 = 422,50 мкг/мл), а сухой экстракт H. erectum характеризуется выраженной инактивирующей способностью в отношении О2'--радикала (1С50 = 81,31 мкг/мл), превышающей активность аскорбиновой кислоты (1С50 = 101,00 мкг/мл).
Установлено, что исследуемые экстракты препятствуют накоплению ТБК-активных продуктов в модельной системе, защищая биологический субстрат от перекисного окисления липидов. 1С50 для сухого экстракта L. carinthiacum составляет
346,00 мкг/мл (1С50 = 346,00 мкг/мл), для H. erectum — 85,00 мкг/мл (1С50 = 85,00 мкг/мл). В отношении связывания молекул N0, исследуемые экстракты проявляли умеренную активность. Так, для указанных экстрактов концентрация, при которой
Таблица 1
Антиоксидантная активность экстрактов сухих lomatogonium carinthiacum и Hypecoum erectum
Объект DPPH-метод, IC50, мкг/мл Fe2+ IC50, мкг/мл ОГ IC50, мкг/мл ЖЛП-метод IC50, мкг/мл NO IC50, мкг/мл
L. carinthiacum 65,01 ± 1,97 1100,0 ± 12,01 422,50 ± 17,37 346,00 ± 11,21 > 5000
H. erectum 97,12 ± 2,34 180,00 ± 8,27 81,31 ± 3,19 85,00 ± 2,07 > 5000
Аскорбиновая кислота б 4,81 ± 0,15 150,00 ± 0,01 101,00 ± 3,21 7,01 ± 0,25 1140,0 ± 34,21
Кверцетин б 9,90 ± 0,21 > 5000 32,00 ± 1,12 12,07 ± 0,92 150,00 ± 4,15
Примечание: DPPH - антирадикальная активность в отношении ДФПГ-радикала, Fe2+ - Fe2+-хелатирующая активность,
О./- - связывание супероксид-анион радикала, ЖЛП-метод - антиоксидантная активность в отношении накопления ТБК-активных продуктов, N0 - связывание молекул оксида азота (II); б - вещество сравнения.
Таблица 2
Мембраностабилизирующая активность сухих экстрактов Lomatogonium carinthiacum и Hypecoum erectum
Условия опыта Дозы, мг/мл Перекисный гемолиз, % Осмотический гемолиз, %
Контроль (гемолиз) - 100 100
Опыт 1 (гемолиз + L.cаrinthiаcum) 0,04 91,03 ± 4,27 59,14 ± 2,15
0,40 61,18 ± 2,51 50,25 ± 2,02
4,00 49,92 ± 1,17 26,61 ± 1,14
Опыт 2 (гемолиз + Н. егеЫит) 0,04 72,17 ± 0,14 50,34 ± 1,15
0,40 31,70 ± 0,15 38,35 ± 0,89
4,00 27,36 ± 0,28 17,16 ± 0,14
происходит 50 % ингибирование NO, составила > 5000 мкг/мл.
In vitro на моделях перекисного и осмотического гемолиза изучали мембраностабилизирующую активность сухих экстрактов L. carinthiacum и H. erectum в широком диапазоне концентраций.
Как следует из данных, приведенных в таблице
2, внесение испытуемых экстрактов в инкубационную среду сопровождается снижением выраженности перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов.
Установлено, что сухой экстракт L. carinthiacum оказывает умеренное мембраностабилизирующее действие. Так, в концентрации 4,0 мг/мл степень перекисного и осмотического гемолиза снижается на 50,08 и 73,39 % соответственно. Сухой экстракт H. erectum обладает более выраженной мембраностабилизирующей активностью, и в концентрации
4,0 мг/мл степень перекисного и осмотического гемолиза снижается на 72,64 и 82,84 %, соответственно, по сравнению с контролем. Выраженное мембраностабилизирующее действие экстракта сухого H. erectum обусловлено, по-видимому, наличием в основном флавоноидов (производных рутина, изорамнетина) и других представителей классов фенольных соединений [9].
Учитывая, что свободные радикалы, образующиеся в реакции Фентона, индуцируют перекис-ное окисление липидов клеточных мембран и как следствие этого приводят к гемолизу эритроцитов, можно полагать, что в основе механизма мембраностабилизирующего действия исследуемых фитосредств лежит ингибирование процессов свободнорадикального окисления биологических мембран.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, полученные данные свидетельствуют об умеренной антиоксидантной, анти-радикальной и мембраностабилизирующей активности экстракта сухого L. carinthiacum в модельных системах in vitro. Экстракт сухой H. erectum проявляет более выраженную антиоксидантную, антирадикальную и мембраностабилизирующую активность. Кроме того, исследуемый экстракт
H. erectum эффективно защищает биологический субстрат от перекисного окисления липидов в
условиях in vitro. Данный эффект обусловлен, по-видимому наличием в его составе флавоноидов (производных рутина, изорамнетина), алкалоидов и других представителей фенольных соединений и полисахаридов.
Результаты проведенных исследований дают основание рассматривать исследуемые экстракты в качестве потенциальных антиоксидантных средств и аргументируют возможности их применения в комплексной терапии заболеваний печени и желчевыводящих путей.
ЛИТЕРАТУРА
1. Асеева Т.А., Базарон Э.Г., Рязанова О.И. Расшифровка тибетского названия растения «Бар-ба-да» и его применение в индо-тибетской медицине // Растительные ресурсы. — 1979. — Т. 15, Вып. 2. - С. 293-296.
2. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. — М.: Мир, 1994. — 265 с.
3. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Тесел-кин Ю.О. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопро-теидов // Лабораторное дело. — 1988. — № 5. — С. 59 — 62.
4. Ковалев И.Е. и др. Влияние эномеланина на гемолиз эритоцитов, вызываемый свободнорадикальными реакциями и другими факторами // Фар-макол. и токсикол. — 1986. — № 4. — С. 89 — 91.
5. Мягмар Л. Исследование желчегонного действия ломатогониума каринтийского (Lomatogonium carinthiacum (Wulf.) Reichenb.) произрастающего в МНР: автореф. дис. ... канд. мед. наук. — Рязань, 1974. — 24 с.
6. Николаев С.М. Растительные лекарственные препараты при повреждении гепатобилиарной системы. — Новосибирск, 1992. — 155 с.
7. Оленников Д.Н. и др. Химический состав сока каллизии душистой (Callisia fragrans Wood.) и его антиоксидантная активность (in vitro) // Химия растит. сырья. — 2008. — № 4. — С. 95—100.
8. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейства Caprifoliaceae — Plantaginaceae. — Л., 1990. — 328 с.
9. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав, использование;
Семейства Magnoliaceae — Limoniaceae. — Л., 1985. - З15 с.
10. Самбуева З.Г., Бальжиров Б.Г., Федоров А.В. Желчегонное действие экстракта ломатогониума каринтийского // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. — 2011. — Т. 77, № 1. - С. 174 - 176.
11. Федоров А.В., Самбуева З.Г., Лубсандоржи-ева П.Б. Влияние экстрактов Lomatogonium carinthiacum (Wulf.) Reichenb. и Hypecoum erectum L. на холерез у белых крыс при экспериментальном гепатите // Актуальные проблемы управления здоровьем населения : сб. науч. тр. — Н. Новгород, 2012. - Вып. V. - С. 137-141.
12. Chen A.-S., Taguchi T., Sakai K., Kikuchi K. Antioxidant activities of chitibiose and chititriose // Biol. Pharm. Bull. - 2003. - Vol. 26, N 9 -P. 1326-1330.
13. Govindarajan R., Rastogi S., Vijayakumar M. Studies on the antioxidant activities of Desmodium gagenticum // Biol. Pharm. Bull. — 2003. — Vol. 26, N 10. - P. 1424-1427.
14. Rosidah Yam M., Sadikun A., Asmawi M. Antioxidant potential of Gynura procumbens // Pharm. Biol. - 2008. - Vol. 46. - P. 616-625.
15. Schlesier K. et al. Assessment of antioxidant activity by using different in vitro methods // Free Radic. Res. - 2002. - Vol. 36. - P. 177-187.
16. Seyoum A., Asres K., El-Fiky F.K. Structure-radical scavenging relationships of flavonoids // Phytochemistry. — 2006. — Vol. 67, N 18. — P 2058-2070.
17. Sorig T. Isolierung von Flavonverbindungen aus Lomatogonium carinthiacum (Wulf.) Reichenb // Farmazie. — 1978. — Vol. 33, N 1. — P. 84.
Сведения об авторах
Торопова Анюта Алексеевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670042, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13; е-mail: [email protected])
Разуваева Янина Геннадьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13; e-mail: [email protected])
Николаев Сергей Матвеевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий Отделом биологически активных веществ ФГбУн «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670047, г Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13)
Федоров Андрей Витальевич - аспирант кафедры фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Бурятский государственный университет» (670000, г. Улан-Удэ, ул. Смолина, 24а) Самбуева Зинаида Гомбожаповна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории безопасности биологически активных веществ ФГБУН «Институт общей и экспериментальной биологии» СО РАН (670047, г. Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6; тел.: (3012) 43-37-13)
