Антиоксидантная, антимикробная активности и содержание фенольных соединений в различных органах Carica papaya L Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 581.1:577.334

Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2005, вып. 4

М. Ю. Еропкин, Л.-П. Колье, Ж. Бангура

АНТИОКСИДАНТНАЯ, АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТИ И СОДЕРЖАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ CARICA PAPAYA L.

Введение. Папайя (Carica papaya L.) - культурное растение, повсеместно распространенное в тропической зоне, широко представлено и в Республике Гвинея. Ее фармакологические свойства, такие как антимикробная и антигельминтная активности, широко используются в традиционной африканской медицине [5-7]. Целый ряд исследований подтверждают фитотерапевтический потенциал различных органов папайи, что является предпосылкой углубленного изучения ее фармакологических свойств [8, 9]. Более того, некоторые данные литературы показывают наличие явной корреляции между антимикробным действием и антиоксидантными свойствами семян и плодов папайи, причем максимальная антимикробная активность отмечена в семенах незрелого плода ("91.

Значительная часть антиоксидантов (АО) представлена в растениях многочисленными соединениями фенольной и полифенольной природы [12].

Целью настоящей работы было изучение соотношения антиоксидантной, антимикробной активностей и содержания фенольных соединений в различных органах местной разновидности папайи, выращенной в окрестностях г. Конакри.

Материал и методы исследования. Материал для исследования собирали с нескольких растений в окрестностях г. Конакри, очищали, измельчали и сушили при температуре окружающего воздуха (около 30 °С) в течение 72 ч. Затем образцы измельчали в фарфоровой ступке до состояния гомогенного порошка. Латекс собирали путем надреза перикарпа незрелых плодов.

Собранные листья принадлежали 5 последовательным генерациям, которые можно примерно классифицировать по возрасту следующим образом:

1-я генерация - 35-39 дней;

2-я - 27-33 дня;

3-я - 25-27 дней;

4-я - 20-24 дня;

5-я- 17-20 дней.

Возраст был установлен путем наблюдения за конкретными растениями.

Из измельченного материала готовили 1%-ный экстракт (масса/объем) 95°-ным этанолом или 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,4. Экстракцию проводили 24 ч при 30 °С.

Определение антиоксидантной активности. Принцип метода. 2,2'-дифенилпикрилгидразил (ДФПГ) - стабильный свободный радикал с максимумом поглощения при 517 нм в ходе реакции с АО превращается в нерадикальную форму — 2, 2'-дифенилпикрилгидразин с потерей характерного максимума поглощения [3].

Ход определения. Рабочий раствор ДФПГ (ICN, США) готовили на 95°-ным этаноле и подбирали концентрацию таким образом, чтобы оптическая плотность при 517 нм была в пределах 0,4-0,5 (зона максимальной чувствительности теста). К образцу в объеме 0,1 мл добавляли 2 мл рабочего раствора ДФПГ и инкубировали 15 мин. Оптическую плотность регистрировали на спектрофотометре SECOMAM S500 против оптического контроля. Образцы получали путем 5 последовательных двоичных разведений исходного материала.

Определение содержания фенольных соединений. Принцип метода. Фенольные соединения реагируют с реактивом Фолина в щелочной среде. В качестве эталонного соединения использовали галловую кислоту [13].

© М. Ю. Еропкин, Л.-П. Колье, Ж. Бангура, 2005

Ход определения', к образцу (0,1 мл) добавляли 2 мл 2% Na2C03. Через 2 мин добавляли 0,1 мл 50% реактива Фолина (Sigma, США) и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Измеряли оптическую плотность при 750 нм. Результаты выражали в миллиграммах галловой кислоты на 1 г сухой массы образца.

Тонкослойная хроматография этанольного экстракта. Использовали несколько вариантов хроматографии в тонком слое силикагеля с различными соотношениями следующих компонентов растворителя: гексан (НХ), этилацетат (ЕА) и уксусная кислота (АсОН). Предварительную проявку хро-матограмм проводили парами йода. Далее хроматограммы проявляли одним из следующих способов [2]:

• фосфорно-молибденовой кислотой;

• реактивом Драгендорфа;

• смесью ванилин-серная кислота;

• хлорным железом.

В качестве эталонного соединения использовали ß-амирин (соединение тритерпеновой природы).

Определение антимикробной активности. Для определения использовали штаммы Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Bacillus subtilis из коллекции кафедры микробиологии Конакрийского университета. Для антибиограмм на твердой питательной среде использовали разведение культур, соответствующее по стандарту мутности Макфарланда 0,5 ед. (около 106 клеток/мл). Бактериальную суспензию вносили в чашки Петри, заполненные агаром (среда Мюллера-Хинтона), помещали на поверхность абсорбирующие диски, импрегнированные соответствующими экстрактами, и инкубировали культуры 24 ч при 37 °С, после чего определяли диаметр зоны лизиса в миллиметрах. Контролем служили диски, импрегнированные фосфатным буфером. Каждый образец наносили минимум на 4 диска, и опыт повторяли дважды в разные дни.

Статистическая обработка результатов. Статистический анализ выполняли с помощью программы «Statistica for Windows 6.0» [1]. Кроме элементарной статистики проводили регрессионный и корреляционный анализ. Среднеингибиторные концентрации (CI50) АО в образцах, уменьшающие на 50% содержание радикальной формы ДФПГ, рассчитывали из уравнений линейной регрессии, полученных при титровании ДФПГ последовательными разбавлениями экстрактов. По всем данным (ан-тиоксидантная активность, содержание фенольных соединений и антимикробное действие) для всех изученных органов растения строили корреляционную матрицу. Достоверные коэффициенты корреляции служили указанием на наличие связи между различными показателями.

Результаты исследований. Содержание фенольных соединений, выраженное в миллиграммах галловой кислоты на 1 г сухой массы образца, а также основные показатели ан-тиоксидантной активности - коэффициент линейной регрессии и CI50 в тесте с ДФПГ -представлены в табл. 1. В этой таблице образцы различных органов папайи ранжированы по убыванию содержания в них фенольных компонентов. По всем трем показателям первое место с большим отрывом занимают незрелые семена, далее следуют листья различных генераций, причем наиболее высокое содержание фенольных соединений и антиоксидант-ная активность отмечены в молодых листьях 2-й и 3-й генераций (возраст 27-33 дня и 25-27 дней соответственно). Свежий латекс, хотя и является источником целого ряда биологически активных компонентов, в частности папаина, по исследуемым показателям занимает среднее положение. Зрелые семена, а также мезокарп как зрелых, так и незрелых плодов отличаются малым содержанием фенольных соединений, а также низкой антиоксидант-ной активностью. Показано существование существенной корреляции между содержанием в экстрактах фенольных соединений и обоими показателями, характеризующими антиокси-дантную активность: г - 0,79 (р < 0,05) при сравнении показателей I и II (табл. 1); г = -0,78 (/?<0,05) (I и III); г — ~0,60 (р < 0,05) (II и III). Наличие значимой корреляции свидетельствует в пользу того, что антиоксидантная активность экстрактов различных органов папайи определяется в значительной степени содержанием в них фенольных соединений.

Исходя из представленных выше данных, для анализа методом тонкослойной хроматографии были выбраны экстракты незрелых и зрелых семян, а также цветков папайи. Результаты представлены на рисунке. Как видно из рисунка, хроматографический профиль

этанольного экстракта незрелых семян отличается при всех вариантах хроматографии от профиля зрелых семян и цветков. Фракция, специфичная для незрелых семян и отсутствующая в остальных экстрактах, показана на рисунке стрелкой.

Таблица 1. Содержание фенольных соединений и показатели антиоксидантной активности в тесте с ДФПГ экстрактов различных органов Carica papaya L.

Орган Содержание фенольных соединений (мг/г сухой массы образца) Коэффициент линейной регрессии в тесте с ДФПГ С150 (мг/мл) в тесте с ДФПГ

1 11 111

1. Незрелые семена 33,83 ±0,79 176,7 ±34,43 0,22

2. Листья 3-й генерации 26,83 ± 1,18 73,17 ±2,83 0,66

3. Листья 5-й генерации 26,71 ± 1,03 42,45 ±4,04 1,12

4. Листья 2-й генерации 26,31 ± 1,40 75,85 ±4,40 0,63

5. Листья 4-й генерации 26,04 ± 0,40 32,39 ±3,57 1,46

6. Листья 1 -й генерации 19,99 ±0,73 37,58 ±0,73 1,27

7. Перикарп зрелых плодов 19,96 ±0,68 11,24 ±0,64 4,41

8. Цветки 17,37 ±0,99 15,35 ±0,41 3,24

9. Сырой латекс 17,03 ±0,78 7,94 ±0,21 5,94

10. Корни 8,74 ± 0,66 15,96 ±0,70 3,06

11. Зрелые семена 8,70 ±0,57 14,06 ±0,33 3,68

12. Мезокарп зрелого плода 8,47 ±0,45 7,95 ± 0,44 6,25

13. Мезокарп незрелого плода 6,57 ±0,57 4,31 ±0,15 11,88

14. Кора 6,55 ±0,55 9,22 ±0,17 5,47

Обработка хроматограмм фосфорно-молибденовой кислотой позволяет обнаружить липиды, стероиды, редуцирующие соединения, в частности антиоксиданты. Реактив Дра-гендорфа выявляет алкалоиды, смесь ванилин-серная кислота используется для обнаружения стероидов и терпенов, а хлорное железо - для фенольных соединений. В экстракте незрелых семян выявлены положительные фракции при всех использованных вариантах проявления хроматограмм, из чего можно заключить, что фракция, специфичная для незрелых семян, вероятно, имеет стероидную или фенольную природу. Этот факт полностью соответствует приведенным выше данным о максимальном содержании фенольных соединений и антиоксидантной активности в незрелых семенах по сравнению с другими органами папайи. Что касается фракционного состава экстракта зрелых семян и особенно цветков, то он представлен меньшим числом фракций, чем экстракт незрелых семян. Результаты тонкослойной хроматографии показали, что отличия фракционного состава экстракта незрелых семян носят не только количественный, но и качественный характер.

Антимикробная активность экстрактов различных органов папайи представлена в табл. 2. Контрольные данные не приводятся, так как зона лизиса при аппликации фосфатного буфера всегда отсутствовала. Как видно из приведенных данных, экстракты всех органов растения обладали определенным антисептическим действием против всех четырех изученных штаммов бактерий. Как и в случае антиоксидантной активности и содержания фенольных соединений, наибольшая активность (в 1,5-2 раза превышающая активность экстрактов других органов) отмечена в случае незрелых семян папайи. На втором месте находится экс-

ё

\

^ * GV FL

#1 *

Т GM1 GM2 1

О

о

О

<л

О-

<i о О

■ / \ GV FL Т GM1 GM2 /

\ 2 /

-1 ■- '-г-

5>- ГО '

О О

о о-

о

р

* ¥

*

GV FL

GM1 GM2 7

С

о

о

О

¿гч

О о

с

Оо

О

С? О

о

Тонкослойная хроматография этанольных экстрактов некоторых органов Carica papaya L.

Использованная система растворителей: гексан (НХ): этилацетат (ЕА): уксусная кислота (АсОН). I - НХ (40): ЕА (10): АсОН (1). Проявление фосфорно-молибденовой кислотой; 2 - НХ (40): ЕА(10): АсОН (1). Три последовательных цикла хроматографии. Проявление реактивом Драгендорфа. 3- НХ (50): ЕА (50): АсОН (1). Проявление ванилином-серной кислотой; 4 - НХ (50): ЕА (10): АсОН(1). Проявление хлорным железом. Нанесен контур фракций, выявленных при предварительном окрашивании парами йода.

GV - незрелые семена; FI - цветки; GM1 и GM2 - зрелые семена (экстракты двух различных образцов, собранных в разное время); Т - эталон ((3-амирин, соединение тритерпеновой природы).

тракт зрелых семян и мезокарпа незрелого плода. Антимикробная активность экстрактов остальных органов существенно ниже. Самая высокая антибактериальная активность незрелых семян наблюдается в отношении Bacillus subtilis.

Таблица 2. Антимикробная активность экстрактов различных органов Carica papaya L. на твердой среде Мюллера-Хинтона

Органы Диаметр зоны лизиса, мм

Escherichia coli Staphylococcus aureus Klebsiella pneumoniae Bacillus subtilis

Цветки 18,5 ±2,2 18,3 ± 1,3 23,5 ±0,4 26,5 ± 0,9

Листья 1-й генерации 18,6± 1,3 13,1 ±0,7 16,0 ± 0,6 18,7± 1,3

Листья 2-й генерации 22,9 ± 1,6 19,9± 1,8 19,7 ± 1,7 23,5 ±2,5

Листья 3-й генерации 16,6± 1,3 15,9± 1,0 17,5 ± 1,7 21,0 ± 1,5

Листья 4-й генерации 15,1 ± 1,0 15,0 ±0,3 16,0 ±0,7 19,0 ±1,0

Листья 5-й генерации 16,0 ±1,7 14,9 ± 1,1 18,5 ± 1,0 22,5 ± 0,4

Мезокарп незрелого плода 28,4 ±4,1 26,5 ±2,1 32,5 ± 1,3 39,0 ±3,2

Корни 16,3 ±2,4 16,7 ± 1,9 20,5 ±3,4 22,7 ± 2,7

Зрелые семена 27,7 ±3,3 21,8 ± 1,1 26,5 ± 0,6 36,5 ±3,5

Мезокарп зрелого плода 23,0 ±2,9 23,0 ± 0,9 25,7 ±0,6 31,5 ± 2,1

Перикарп зрелого плода - 20,0 ± 2,3 20,3 ± 1,3 21,5 ± 1,7 26,0 ±2,7

Незрелые семена 33,8 ±3,8 27,5 ± 1,1 31,0 ±0,7 43,0 ±4,1

Кора 17,0 ± 2,0 19,4 ± 1,1 21,0 ± 0,9 23,7 ± 2,2

В то же время при сквозном корреляционном анализе всех данных по содержанию фенольных соединений, антиоксидантной активности, с одной стороны, и антимикробному эффекту - с другой, достоверные корреляции отмечены только между антимикробной активностью в отношении Staphylococcus aureus и CI50 в тесте с ДФПГ (г = 0,61, р < 0,05), а также активностью в отношении Klebsiella pneumoniae и тем же показателем антиоксидант-ного действия (г = 0,63, р < 0,05). Таким образом, антимикробный эффект различных органов папайи может лишь частично объясняться присутствием в них повышенных концентраций АО.

Обсуждение результатов исследований. Фенольные соединения являются нормальными компонентами различных тканей растений, в особенности его зеленых частей. Они проявляют эффект антисептиков, которые уменьшают воспалительные процессы при приеме внутрь. Напротив, при нанесении на кожу они оказывают раздражающее действие [12]. Фенольные соединения растительного происхождения делятся на две группы - флаво-ноиды и полифенолы. Флавоноиды - фенольные производные, имеющие несколько заместителей по фенольному кольцу. Они обычно существуют в форме гликозидов. Гликозили-рование делает молекулу флавоноидов более активной в отношении свободных радикалов и более водорастворимой. Последнее облегчает депонирование флавоноидов в вакуолях [12]. Полифенолы обладают идеальной структурой в отношении взаимодействия со свободными радикалами (так называемые «чистильщики» или «скэвенджеры» свободных радикалов). Они более активны в этом отношении, чем витамины Е и С. Например, кверцитин обладает антирадикальной активностью в 4,7 раза выше, чем витамин Е. Кверцитин встречается в кожуре картофеля, в винограде, чае, капусте. Теофлавин из черного чая имеет антиради-

кальную активность, в 2,9-6,2 раза превосходящую витамин Е. Флавоноиды чая образуются в результате ферментирования последнего благодаря ферментативному окислению флаво-ноидов, катехинов, галлокатехинов полифенолоксидазами [4, 12].

Фенольные соединения составляют около 42% сухой массы зеленого чая. Из них на долю эпигаллокатехина приходится 11,16%, галлата эпикатехина - 2,25%, катехина - 0,53%. Полифенолы способны уменьшать окисление липопротеинов низкой плотности, защищать а-токоферол от окисления и уменьшать вероятность заболевания атеросклерозом [4].

Способность фенольных соединений защищать липопротеины низкой плотности от окисления и увеличивать период полужизни а-токоферола находится в следующих соотношениях: эпигаллокатехин = эпикатехин галлат = эпикатехин = катехин > галлокатехин > галловая кислота [12].

Для африканских стран поиск естественных источников АО имеет особенно большое значение в свете данных о том, что хроническое недоедание и/или неполноценное питание приводят к длительному окислительному стрессу, особенно среди детей ранних возрастов [10].

Метаболизм энтеропатогенов приводит к избыточной продукции супероксида, перекиси водорода и (в присутствии Fe2+) гидроксильных радикалов. В результате может развиться ишемия кишечного эндотелия, последствиями которой могут быть разнообразные кишечные патологии, включая рак толстой и прямой кишки [9].

По данным ряда авторов, экстракты папайи имели бактериостатический эффект против многих энтеропатогенов, правда, очень высокая концентрация использованных образцов (до 0,5 г/мл) ставит под сомнение полученные результаты [5, 9]. Одним из антимикробных и фунгицидных соединений семян папайи, возможно, является бензил изотиоцианат, компонент горчичного масла, особенно широко распространенный у крестоцветных. У папайи он может освобождаться из бензил-гликозилатов при гидролизе тиогликозидазой [5]. Бензил изотиоцианат обладает малой токсичностью и служит индуктором ряда ферментов детоксикации и антиокислительной защиты, таких как НАД(Ф)Н: хинон оксидоредуктаза и глутатион-Б-трансфераза [11].

Выводы. 1. Наиболее высокое содержание фенольных соединений и максимальная антиоксидантная активность обнаружены в экстрактах незрелых семян местной разновидности Carica papaya L. из окрестностей г. Конакри, Республика Гвинея. 2. Существует значимая корреляция (г = 0,79, р < 0,05) между данными двумя показателями в исследованных экстрактах различных органов папайи. 3. Максимальная антимикробная активность в отношении четырех исследованных штаммов (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae и Bacillus subtilis) обнаружена также в незрелых семенах, однако этот показатель не во всех случаях коррелирует с антиоксидантным эффектом и содержанием фенольных соединений в различных органах растения. 4. Полученные результаты показывают, что биологическая активность незрелых семян и плодов папайи, включая антисептический эффект, может хотя бы частично объясняться высоким содержанием в них фенольных соединений.

Статья рекомендована проф. С. С. Медведевым. Summary

EropkinM. Yu., Kolié L.-P., Bangoura J. Antioxidant, antimicrobial activities and phenolic compounds content in the different organs of Carica papaya L.

Seeds and pulp of Carica papaya L. are widely used in the traditional medicine in tropics for their antiseptic properties. We have studied different parts of papaya for their concentration of phenolic compounds in parallel with the antioxidant scavenging activity on diphenyl-picrylhydra2yl and antimicrobial activity

towards Escherichia colt, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae and Bacillus subtilis on the solid medium. Extracts of the seeds of unripe papaya proved to be in our experiments the most powerful in all respects under study. Moreover, a considerable correlation (r = 0,79, p <0,05) is found between the concentration of phenolic compounds in different papaya organs and their antioxidant capacity while only partial correlation is observed between the former indices and antimicrobial activity. Our results confirm that the biological activity (including the antiseptic effect) of the seeds of unripe papaya can be at least partially attributed to the high concentration of phenolic compounds.

Литература

1. Боровиков В. П., Боровиков И. П. STATIST1CA. Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. M., 1997. С. 33^44. 2. Киршнер Й. Г. Тонкослойная хроматография. Т. 1. М., 1981.

3. Починок Т. В., Тароховский М. Л., Портнягина В. А. Быстрый метод определения антиоксидантной активности фармацевтических препаратов// Химико-фармацевт. журн. 1985. №5. С. 565-569.

4. Chang К.-Т., WongT.-Y., Wei С.-Т_ Tannins and human health: a review// Critical Rev. in Food Sci. and Nutrit. 1998. Vol. 38, N 6. P. 421-464. 5. El Taleb O., Kucera M., Marquis V. O., Kucerova M. Contribution to the knowledge of Nigerian medical plants. III. Study on Carica papaya seeds as a source of reliable antibiotics, the BITC // Planta Medica. 1974. Vol.26, N 1. P. 79-89. 6. Grenand P., MorettiC., Jacquemin H. Pharmacopées traditionnelles en Guyane Paris. 1987. P. 180-182. 7. KerharoJ. La pharmacopée Sénégalaise traditionnelle. Plantes médicinales et toxiques / Ed. by Vigot Frères. Paris, 1974. P. 323-324. 8. Le Grand A. Les phytothérapies anti-infectieuses de la forêt-savane, Sénégal: un résumé des substances phytochimiques et l'activité anti-microbienne de 43 espèces // J. Ethnopharmacol. 1989. Vol. 25, N3. P. 315-338. 9. Osato J. A., Santiago L. A., Remo G. M. et al. Antimicrobial and antioxidant activities of unripe papaya // Life Sci. 1993. Vol.53, N 17. P. 1383-1389. 10. Antioxidant status, diet, nutrition and health/Ed. by A. M. Papas. London, 1999. 11. Patten E. J., DeLongM. J. Temporal effects of the detoxification enzyme inducer benzyl isothiocyanate // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. Vol.257. P. 149-155. i2. Rice-Evans C. A., Miller N. J., Paganga G. Antioxidant properties of phenolic compounds // Trends in Plant Sci. 1997. Vol. 2, N 4. P. 152-159. 13. Taga M. S., Miller E. E, Pratt D. E. Chia seeds as a source of natural lipid antioxidants//! Am. Oil Soc. 1984. Vol. 61. P. 928-931.

Статья поступила в редакцию 29 сентября 2005 г.