CC BY
79
Шакиров Д.Ф., Ханов Т.В., Гайсин С.Ж., Камилов Р.Ф.
АНТИОКИСЛИТЕЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ СЛ'ЗНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ПЛАЗМЫ КРОВИ И СЛЮННОЙ ЖИДКОСТИ
ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа
Свободно-радикальное окисление (СРО) -нормальный метаболический процесс, происходящий практически во всех органах и тканях организма человека, необходимый для осуществления и регулирования ряда физиологических показателей, таких как пролиферация, клеточная дифференцировка, фагоцитоз, синтез и распад биорегуляторов, контроль рецепции, микровязкости биомембран и т.д. В норме процессы свободнорадикального окисления строго сбалансированы и зависят от состояния систем, генерирующих свободные радикалы и утилизирующих их на различных стадиях цепных реак-ций (система антиоксидантной защиты).
Согласно современным представлениям, в развитии воспалительных и дистрофических заболеваний органа зрения важную роль играет нарушения свободнорадикального и перекисного окисления. Поэтому для целенаправленной патогенетически обоснованной терапии необходимо учитывать состояние генерации и утилизации свободных радикалов в тканях глаза, ибо исследование крови не всегда точно отражает локально протекающие процессы в глазу. Значительно информативнее анализ слезы - единственной биологической жидкости, получаемой неинвазивным способом и в наибольшей степени отражающей состояние метаболизма в тканях глаза. Применяемые в настоящее время способы оценки процессов оксидации в слезной жидкости основаны на определении первичных, промежуточных и конечных продуктов окислительных реакций (конъюгаты диеновые и триеновые, гидроперекиси, малоновый диальдегид, Шиффовы основания) и антиоксидантов. Известно, что в слезной жидкости содержится ряд веществ с антиоксидантной активностью, как ферментной, так и неферментной природы, такие как каталаза, пероксидаза, супероксиддисмутаза, глутатионредуктаза, целуроплазмин, глутатион, а-токоферол, аскорбиновая кислота, урат и др. Определение количественного состава отдельных антиоксидантов в слезной жидкости не даёт более точных сведений об общей антиокислительной активности, ибо не позволяет реально оценить вклад каждого компонента и их комбинаций в генерацию свободных радикалов, суммирование и взаимное потенцирование действия, наличие в слезной жидкости различных активаторов и ингибиторов и других факторов.
Интегральным показателем, характеризующим состояние СРО в тканях глаза, может служить суммарная антиокислительная активность слезной жидкости (СААСЖ), а, именно, способность слезной
жидкости угнетать образование свободных радикалов в каком-либо субстрате. Для определения суммарной антиокислительной активности слезной жидкости используют модельные системы, в которых генерируются свободные радикалы. Торможение процессов СРО в слезной жидкости оценивается либо спектро-фотометрически, либо хемилюминесценцией (ХЛ). Наиболее информативны хемилю-минесцентные методы, позволяющие непосредственно контролировать за кинетикой окисления.
В литературе имеются сведения об использовании для исследования процессов СРО в слезной жидкости модельных систем, генерирующих активные формы кислорода - модели ксантин-ксантиноксидаза и гемоглобин-перекись водорода-люминол. Недостатком первой модельной системы является рН реакционной среды, равной 8,1, в то время, как рН слезной жидкости составляет 7,0-7,5. В модельной системе гемоглобин-перекись водорода-люминол применяются коммерчески дорогостоящие нестабильные реактивы, которые необходимо готовить непосредственно перед каждым исследованием. Это снижает достоверность полученных результатов и увеличивает время выполнения анализа. Поэтому целью настоящего исследования стала применение способа определения и оценки суммарной антиокислительной активности слёзной жидкости (СААСЖ) методом регистрации люминол-зависимой ХЛ, а также в плазме крови и слюне у рабо-чих ОАО «Каучук» Республики Башкортостан.
Материал и методы исследования. У 180 работников ОАО «Каучук» (г. Стерлитамак), из числа которых 75 женщин и 23 мужчин, подвергшиеся в процессе производства комбинированному действию (смесь бензина-растворителя марки БР-1 с хлорированными углеводородами - хлористый метилен, дихлорэтан-1,2), 53 женщин и 29 мужчин -изолированному действию бензина-растворителя той же марки, явилась кровь, слюнная и слёзная жидкость. Обследовано также 93 человека, работников того же производства в возрасте от 18 до 55 лет, находящихся в стационарных условиях, как клинически здоровых (контрольная группа, n=40), так и больных с различной офтальмо-патологией (n=93): катарактой (n=39), глаукомой III стадией (n=18), увеитом (n=36).
Кровь из вены и слюну в количестве 10 мл отбирали утром натощак. Плазму готовили, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия (5 мг/мл). Полученную плазму хранили при температуре +4 0С не более 8 часов. Форменные элементы осаждали центрифугированием. Перед измерением антиокислительной активности 0,5 мл пробы раз-водили в 18,5 мл солевого раствора следующего содержания: 20 мМ КН2РО4, 105 мМ КС1, рН-7,45, индуцировали добавлением 1 мл FeSO4*7Н2О, оптимальная концентрация, которого составила 2,5 мМ в среде инкубации.
Слюну собирали путём сплёвывания в чистый
стакан в течение 10 минут, предварительно прополоскав рот тёплой, кипяченой водой. Для удаления клеток центрифугировали. Слюна содержит липиды, антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза), витамины (А,С,Е), биологически активные вещества (адреналин, серотонин, гистамин, стероиды и др.).
Слезную жидкость (СЖ), стимулированную вдыханием паров 10% нашатырного спирта в объёме 0,15 мл забирали канюлей из слезного озера и нижнего конъюнктивального свода, не касаясь конъюнктивы и роговицы, утром после пробуждения больного, чтобы исключить влияние на состав СЖ гигиенических процедур, а также различных физических и психоэмоциональных факторов. Полученную СЖ помещали в центрифужную пробирку и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин. Слезная жидкость разделялась на две видимые фракции
- надосадочную жидкость (супернатант) и осадок.
Исследования свободно-радикальных реакций в плазме крови, слюнной и слёзной жидкости проводили методом регистрации ХЛ. Метод основан на детекции сверхслабого свечения, возникающего при генерации свободных радикалов - активных форм кислорода в модельной системе цитрат-фосфатлюминол при добавлении инициатора (Fe+2) для слёзной жидкости, для плазмы крови и слюнной жидкости добавлением соли FeS04•7Н20. Подавление ХЛ, характеризует суммарную антиокислительную активность как слёзной жидкости, так плазмы крови и слюны. ХЛ изучали на приборе ХЛМ-003. Стабильность работы установки проверяли перед каждым измерением по изуче-нию вторичного этанола СФХМ-1 (ГОСТ 941181). Интенсивность свечения контроля составляет 5,1105 квантов/секунду. Для удобства эта величина принималась за одну условную единицу.
Готовили модельную систему, состоящую из фосфатного буфера (20 мМ КН2РО4, 105 мМ КС1) с добавлением цитрата натрия (50 мМ) и люминола (105 М). Величину рН доводили до 7,5 титрованием насыщенным раствором КОН. Данная модельная система состоит из стабильных компонентов, поэтому нет необходимости готовить её перед каждым анализом заново, что существенно сокращает время исследования и повышает его достоверность. В термостатируемую кювету хемилюминометра ХЛМ-003 помещали 5,0 мл модельной системы с 0,1 мл физиологического раствора (контроль) или супернатант слёзной жидкости, плазмы крови и слюны в том же объёме (опыт). При постоянном перемешивании реакционной смеси вводили активатор окисления - 1,0 мл 10 мМ сернокислого железа. Определяли величину спонтанного свечения, интенсивность быстрой вспышки в момент добавления инициатора, длительность латентного периода, крутизну нарастания медленной вспышки, амплитуду медленной вспышки. В дальнейшем учитывали светосумму излучения, как наиболее информативный
интегральный показатель, отражающий квантовый выход произошедших в модельной системе свободнорадикальных реакций. Её значения регистрировали за 5 мин измерения, учитывая, что:
- спонтанное свечение определяет скорость СРО без внешнего вмешательства;
- быстрая вспышка возникает в момент добавления инициатора окисления. Амплитуда вспышки прямо пропорциональна содержанию перекисных продуктов;
- период индукции или латентный период характеризует антиокислительные свойства;
- крутизна нарастания медленной вспышки определяется скоростью инициирования свободнорадикальным окислением;
- максимальная амплитуда медленной вспышки и светосумма свечения характеризуют способность биологического материала подвергаться окислению. Начало медленной вспышки совпадает с моментом, когда в среде инкубации начинают накапливаться гидроперекиси липидов. Образуются перекисные радикалы, рекомбинация которых сопровождается свечением. Выравнивание скорости образования и распада гидроперекисей становится причиной перехода медленной вспышки в стационарное свечение. Основ-ной характеристикой изучаемого процесса служила светосумма свечения, которая является интегральным показателем. Она увеличивается при ускорении СРО, снижения уровня антиоксидантов и уменьшается при нарушении проницаемости клеточных мембран. Полученные цифровые показатели светосуммы ХЛ выражали в процентах от контроля, что характеризует суммарную антиокислительную активность супернатанта слёзной жидкости, плазмы крови и слюны. Весь процесс измерения ХЛ проводилась автоматически, полученные данные обрабатывались специальной компьютерной программой, фиксировалась в цифрах
и графически на экране монитора.
Результаты и обсуждение. Интенсивность спонтанного свечения плазмы крови у лиц, подвергшихся воздействию паров бензина в 1-й подгруппе выше на 19%, чем исходное значение, во 2й подгруппе она составляет 155%, а в 3-й -соответственно 241%. Светосумма свечения в этих подгруппах возрастает в 1,3-3,1 раза. Быстрая вспышка во 2-й подгруппе составляет 127%, а в 3-й - 163% по сравнению с контрольной, в то время как в 1-й подгруппе амплитуда быстрой вспышки не меняется. Увеличение уровня максимальной амплитуды медленной вспышки отмечается во 2-й подгруппе и достигает до 149% по отношению контролю в 3-й подгруппе. У лиц, подвергшихся комбинированному действию смеси бензина с хлорированными углеводородами, интенсивность спонтанного свечения плазмы крови во 2-й и 3-й подгруппах статистически значимо превышает исходное значение, а светосумма излучения усиливается соответственно в 2,0-3,8 раза. Амплитуда быстрой вспышки и максимальная амплитуда медленной вспышки в этих подгруппах возрастает в 1,4-2,9 раза по сравнению с конт-рольной группой. Усиление интенсивности спонтанного свечения слюны выявляется уже в 1-й подгруппе у лиц, контактирующих с парами бензина, а во 2-й подгруппе она увеличивается на 45%, в 3-й - на 125% по сравнению с нормой. Светосумма излучения возрастает в этих подгруппах на 26-166%, амплитуда быстрой вспышки и максималь-ная амплитуда медленной вспышки превышает исходный уровень соответственно в 1,2-1,5 раза, а латентный период снижается до 85% и 78%. В то же время у лиц, подверг-шихся комбинированному действию загрязнителей, интенсивность спонтанного свече-ния и светосумма излучения слюны статистически значимо увеличивается, а амплитуда быстрой вспышки и максимальная амплитуда медленной вспышки резко возрастает (рис. 1).
■ 1 -я группа
■ 2 -я группа (подгруппа А)
■ 2 -я группа (подгруппа Б)
Н 3 -я группа (подгруппа А)
■ 3 -я группа (подгруппа Б)
Рис. 1. Изменение характера ХЛ слюны у обследованных лиц.
Данные СААСЖ при различных заболеваниях органа зрения показывают, что светосумма ХЛ при глаукоме составила 67,2% от контроля, при катаракте -58,5%. Угнетение ХЛ было минимально при увеитах. В процессе лечения 19 больных с увеитом способность СЖ подавлять ХЛ модельной системы возрастала и к моменту клинического выздоровления и выписки из стационара её показатели приближались к значениям СААСЖ здоровых. Исследование СААСЖ как интегрального показателя состояния процессов СРО в тканях глаза может иметь диагностическое и прогностическое значение в оценке патологических процессов, развивающихся в органе зрения. Применение предложенного способа оценки СААСЖ в корреляции с клиническими данными позволяет обосновано и дифференцированно применять антиоксиданты в лечении пациентов с различными заболеваниями органа зрения, осуществлять контроль его эффективности. Исследование неинвазивно, не требует больших материальных затрат, просто в выполнении, что даёт основания рекомендовать широко использовать в клинической практике определение САОАСЖ в качестве экспресс-теста, позволяющего судить об уровне СРО в тканях глаза.
Основным достоинством предложенной модельной системы является стабильность приготовления реактивов, что повышает точность и достоверность исследования, сокращает время его выполнения.
