CC BY
56
Биохимия, биотехнология и диагностика
УДК 619:616-097:576.895.1
АНТИГЕННЫЙ СПЕКТР СОМАТИЧЕСКИХ ЭКСТРАКТОВ ИЗ ПОЛОВОЗРЕЛЫХ СЕТАРИЙ И ДИРОФИЛЯРИЙ
К.А. ХАЙДАРОВ
аспирант В.К. БЕРЕЖКО Научный руководитель - доктор биологических наук
Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии
имени К.И. Скрябина
Представлены результаты исследования антигенного спектра белковых соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий реакцией иммуно-диффузии в агаровом геле (РИД) с использованием гипериммунных сывороток в гомологичном и гетероло-гичном варианте реакции. Установлено в белковом экстракте из дирофилярий 7 и 5, из сетарий - 6 и 5 потенциальных антигенных компонентов соответственно. Оба экстракта реагировали с сывороткой инвазирован-ной Б. собаки, проявляя в РИД один комплекс
антиген-антитело. Таким образом, в белковом экстракте из сетарий содержится антигенный компонент, идентичный функциональному диагностическому при ди-рофиляриозе.
Ключевые слова: антиген, сетарии, дирофилярии, реакция иммунодиффузии.
Эффективность иммунологических тестов при гельминтозах в значительной степени зависит от источника получения антигенного материала, его качественного состава и активности. Между тем экспериментальными исследованиями доказано, что метаболические и особенно соматические антигены из гельминтов не являются гомогенными, содержат большое количество различных компонентов, многие из которых не отличаются специфичностью, а являются общими для представителей различных видов и даже классов. Многоклеточный состав антигенов вызывает необходимость проведения дополнительных исследований по выявлению и выделению функциональных диагностически активных компонентов для разработки эффективных иммунологических тест-систем.
К числу достаточно информативных и простых в исполнении методов анализа антигенов относится реакция иммунодиффузии в агаровом геле (РИД), позволяющая индивидуально исследовать каждую систему антиген-
68
антитело, проявляющуюся независимыми линиями преципитации в соответствии с количеством антигенных компонентов в биоматериале.
Этот метод широко использовали для характеристики антигенов из различных видов гельминтов с целью установления в них идентичных и видос-пецифичных антигенных компонентов: Ascaris suum и A. lumbricoides [11, 16, 21], Toxocara canis и A. suum [9], Dictyocaulus filaria и D. viviparus [4, 5], Mo-niezia expansa, D. filaria [24], Himenolepis nana, H. fraterna [10], D. filaria, Aphelenchus avenae, Neoaplectana glaseri [1, 3], Echinococcus granulosus и E.multilocularis [12].
Иммунохимическим исследованием определенное родство было установлено между представителями нематод, трематод и цестод (A. lumbricoides, P. equorum, F. hepatica, T. solium, T. hydatigena и T. saginatus), однако авторы отметили значительно большее число антигенных компонентов в гомологичных системах реакции [15].
Целью нашей работы была характеристика антигенного спектра соматического экстракта из половозрелых сетарий и дирофилярий.
Материалы и методы
Объектами исследования служили половозрелые Setaria labiato-papillosa, выделенные от инвазированного крупного рогатого скота и половозрелые Dirofilaria immitis, полученные от зараженных собак.
Свежезамороженных гельминтов измельчали и готовили из них белковые экстракты методом гомогенизации, попеременного замораживания и оттаивания до получения однородной массы. Экстрагирование белков проводили при температуре + 4 оС в 0,9%-ном растворе хлористого натрия в соотношении 1 : 10 на магнитной мешалке в течение 48 ч. Полученный биоматериал центрифугировали при 14000 об/мин в течение 15-20 мин и надосадочную жидкость использовали в качестве экстрактов для проведения дальнейших исследований. В полученных экстрактах определяли содержание белка спек-трофотометрически при 280 нм по методу Layne (1957) по калибровочной кривой на основании 5-й фракции бычьего сывороточного альбумина.
Антигенный спектр полученных экстрактов из сетарий и дирофилярий изучали реакцией РИД в агаровом геле с использованием гипериммунных сывороток от кроликов, иммунизированных этими экстрактами.
В опыте использовали 4-х кроликов массой 2,0-2,5 кг, по два кролика на каждый исследуемый экстракт. Схема иммунизации включала три 3-дневных периода подкожного и внутримышечного введения соответствующего экстракта с интервалом между ними 3 сут и последующей отдаленной реимму-низацией, проводимой на 28-30-е сутки после окончания цикла иммунизации. На весь цикл иммунизации, включая и реиммунизацию, каждый кролик получил 10,5 мг соответствующего белка-экстракта. Объем вводимого экстракта и количество белка в нем отражено в таблице 1. Кровь для получения сыворотки у иммунизированных кроликов брали на 7-9-е сутки после окончания цикла иммунизации и после реиммунизации. Сыворотки отделяли стандартным методом и хранили при - 18 оС.
Таблица 1
Объем экстракта и количество белка-антигена, _использованного для иммунизации_
Дни Количество вве- Количество Количество Количество
иммунизации денного экстрак- белка-антигена введенного белка-
та дирофилярий, в экстракте экстракта антигена в
мл дирофилярий, сетарий, мл экстракте
мг сетарий, мг
1 0,2 0,3 0,25 0,31
2 0,2 0,3 0,25 0,31
3 0,2 0,3 0,25 0,31
Перерыв 3 сут
4 0,6 0,9 0,75 0,93
5 0,6 0,9 0,75 0,93
6 0,6 0,9 0,75 0,93
Перерыв 3 сут
7 1,2 1,8 1,5 1,86
8 1,2 1,8 1,5 1,86
9 1,2 1,8 1,5 1,86
Перерыв 28-30 сут
Реиммунизация 1,0 1,5 1,0 1,24
Всего: 7,0 10,5 8,5 10,54
РИД проводили по методу Ouchterlony (17) в модификации Гусева и Цветкова [7] в 1,2%-ном агаровом геле на 0,9%-ном растворе хлори-
стого натрия. Для установления количества и идентичности антигенных компонентов в составе исследуемых белковых экстрактов использовали специальные штампы, состоящие из разного количества трубок («тройка», «семерка»), диаметр которых составлял 3-5 мм.
Результаты и обсуждение Иммунные сыворотки к антигенам исследуемых соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий, полученные от кроликов на 79-е сутки после окончания цикла иммунизации, показали в РИД недостаточную активность. Причем отмечена также зависимость преципитирующей активности иммунных сывороток от реактивности кроликов, поскольку при одинаковом способе и количестве введенного антигена-экстракта наблюдали различия в проявлении иммунного ответа и соответственно числа выявленных в реакции комплексов антиген-антитело (АГ-АТ). Эти различия четко обозначились в РИД не только количеством, но и степенью выраженности проявленных полос преципитации. Более активная иммунная сыворотка к антигенам соматического экстракта из дирофилярий проявляла в гомологичной системе реакции не менее 3-х комплексов АГ-АТ, менее активная - не более одного-двух (табл. 2).
В обоих случаях представляющие эти иммунные комплексы полосы преципитации были недостаточно четко выражены, отдельные из них имели несколько диффузный характер. Исследование этих сывороток в гетерологичной системе реакции с антигеном-экстрактом из сетарий показало не более 1-2 комплексов АГ-АТ, проявившихся также в виде диффузных полос преципитации.
Аналогичный анализ, проведенный с иммунными сыворотками к антигенам соматического экстракта из сетарий, также подтвердил эту закономерность в РИД. В гомологичной системе реакции в зависимости от активности иммунной сыворотки регистрировали 2-3 или 1 комплекс АГ-АТ в виде полос преципитации в агаровом геле разной четкости и интенсивности. В гете-рологичной системе эти антисыворотки с экстрактом из дирофилярий проявляли 1-2 комплекса АГ-АТ (табл. 2). Проведенная на 28-е сутки после окончания иммунизирующего цикла реиммунизация повысила преципитирую-щую активность сывороток, что отразилось на качественном и количественном показателе проявленных в РИД комплексов АГ-АТ.
В белковом спектре соматического экстракта из дирофилярий этими антисыворотками регистрировали не менее 4-5 и 6-7 преципитирующих комплексов, большинство из которых проявлялось в агаровом геле четкими полосами.
Такую же закономерность отметили при исследовании соматического экстракта из сетарий, а именно увеличение как числа, так и четкости проявления полос преципитации, представляющих эти комплексы в агаровом геле. Обеими антисыворотками в гомологичной системе регистрировали в РИД не менее 4-6 комплексов АГ-АТ, а в гетерологичной - не менее 4-5.
Таким образом, проведенный иммунохимический анализ соматических экстрактов из дирофилярий и сетарий в РИД с гипериммунными сыворотками, позволил определить в них соответственно 7 и 6 потенциальных антигенных компонентов, вызывающих синтез антител у кроликов. Однако, учитывая невысокую разрешающую способность иммунодиффузионного теста, можно предположить, что количество потенциальных антигенов в белковом спектре исследуемых экстрактов значительно больше.
Антигены-экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий были подвергнуты аналогичному анализу с сывороткой зараженных В. собак. В обоих случаях, как в гомологичной, так и в гетерологичной системе реакции регистрировали одну полосу преципитации диффузного характера. Причиной проявления диффузных полос может быть, с одной стороны, наличие в сыворотке антител различной специфичности, а, с другой, негомогенностью антигенов.
Неочищенные соматические экстракты из половозрелых дирофилярий и сетарий, безусловно, не отличаются гомогенностью и содержат антигенные компоненты различной молекулярной массы, активности и специфичности. Тем не менее, многочисленными исследованиями также установлено, что потенциальная антигенная активность гельминтов значительно выше, в то же время в инвазированном организме число антигенов гельминтов, способных вызывать синтез антител, меньше.
Так, экспериментально установлено, что при заражении гемонхами у овец сывороточные антитела вырабатываются на 1-3 антигенных компонента паразита, тогда как с гипериммунными сыворотками в соматическом экстракте из гемонхов выявляли не менее 12-15 потенциальных антигенов [13, 20]. Аналогичную закономерность отмечена при трихинеллезе [8, 14], аскаридозе и токсокарозе [9], остертагиозе [25], диктиокаулезе [4]. Во всех случаях иммунохимический анализ антигенного спектра этих гельминтов, проведенный с гипериммунными сыворотками, показывал в РИД в 3-4 раза больше проявленных полос преципитации и соответственно антигенных компонентов, чем с сыворотками животных с естественной или экспериментальной инвазией.
Таблица 2
Антигенный спектр соматических экстрактов из половозрелых дирофилярий и сетарий в гомологичной и гетерологичной системе РИД
№ Антисыворотки к антиге- Число комплексов АГ-АТ в РИД Антисыворотки к антиге- Число комплексов АГ-АТ в РИД
п/п нам экстракта из дирофилярий нам экстракта из сетарий
экстракт из дирофилярий экстракт из сетарий экстракт из сетарий экстракт из дирофилярий
1 кроличья кроличья
гипериммунная (а) 1-2 1-2 гипериммунная (в) 1 1-2
2 кроличья кроличья
гипериммунная (б) 3 2 гипериммунная (г) 2-3 2
3 кроличья гипериммунная кроличья гипериммунная
после реиммунизации (а) 4-5 4 после реиммунизации (в) 4-5 4
4 кроличья гипериммунная кроличья гипериммунная
после реиммунизации (б) 6-7 5 после реиммунизации (г) 4-6 5
5 сыворотка собаки, инвази- сыворотка собаки, инвази-
рованной Б. 1 1 рованной Б. 1 1
72
Российский паразитологический журнал, 2009, № 1
Особенно четко такие различия прослеживаются в адаптированных хо-зяино-паразитарных системах, где эволюционно развивающиеся адаптационные механизмы паразита приводят к ослаблению его антигенного воздействия на организм хозяина и соответственно иммунного ответа.
Иммунохимический анализ антигенов гельминтов позволяет устанавливать антигенное родство между различными видами, что в конечном итоге может быть с успехом использовано в разработке иммунодиагностических тестов с гетерологичными антигенами. Экспериментальными исследованиями перекрестно реагирующие антигенные компоненты были обнаружены даже у организмов, стоящих на разных ступенях зоологической лестницы, у свободноживущих, растительных нематод и паразитов животных [1-3, 6].
Установлено, что антигены, приготовленные из свободноживущих нематод Rhabditis axei, нематод растений A. avenae, выявляли антитела в сыворотках зараженных диктиокаулами овец. С положительным результатом был использован антиген из D. immitis для диагностики онхоцеркоза у человека в широких эпидемиологических исследованиях [22], антиген из фасциол для диагностики шистосомоза [19].
Аналогично в диагностике филяриатозозов человека успешно применяли антигены, полученные из гельминтов животных: Setaria equina, Acanthochei-lonema evansi, Onchocerca gutturosa [18, 23].
Применение гетерологичных антигенов в диагностических целях приобретает определенную значимость в тех случаях, когда получение гомологичного гельминтного материала - источника антигена, становится проблематичным. В значительной степени это относится к дирофиляриозу. Поэтому возникает необходимость изыскания гетерологичного источника, наиболее близкого в антигеном отношении к D. immitis.
Судя по результатам наших иммунохимических исследований экстрактов из дирофилярий и сетарий, таким объектом могут быть сетарии, в антигеном спектре которых был выявлен компонент, идентичный функциональному диагностическому антигену при дирофиляриозе.
Литература
1. Андреева Г.Н., Ермолин Г.А., Тараканов В.И. // Тр. Всес. ин-та гель-минтол. - 1975. - Т. 22. - С. 3-7.
2. Андреева Г.Н. // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1979. - Вып.24. - С. 81-85.
3. Андреева Г.Н., Бережко В.К. // Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1980. - Т. 25. - С. 15-21.
4. Бережко В.К. // Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1970. - Т. 16. - С.17-24.
5. Бережко В.К. // Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1972. - Т. 19. - С. 14-22.
6. Бережко В.К. // Бюл. Всес. ин-та гельминтол. - 1973. - Вып. 10. - С. 16-18.
7. Гусев А.И., Цветков В.С. // Лаб. дело. - 1961. - № 2. - С. 43-45.
8. Ермолин Г.А., Ефремов Е.Е. // Сб. «Достижение мед. паразитологии и троп. мед.». - Тбилиси, 1975. - С. 316-321.
9. Желева Р.Ц. // Мед. паразитол. и паразитарн. бол. - 1975. - Т. 43, № 3.
- С. 293-298.
10. Мухин В.Н. // Мед. паразитол. и паразитарн. бол. - 1972. - Т. 41, № 5.
- С. 558-564.
11. Полетаева О.Г. // Тр. Всес. ин-та гельминтол. - 1971. - Т. 17. - С. 277-280.
12. Раззаков Ш.А. // Мед. паразитол. и паразитарн. бол. - 1976. - Т. 45, № 2. - С. 148-150.
13. ЧунтоноваМ.И. // Тез. докл. к годичн. конф. Всес. ин-та гельминтол. - 1969. - С. 59-60.
14. Despommier D.D., Muller M. // J. Parasitol. - 1970. - V. 56, № 4/11. - P. 76-77.
15. Espinoza B., Flisser A. // Arch. Invest. Med. - 1986. - V. 17, № 3. - P. 115-127.
16. Kennedy M. W., Oureshi F. // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyg. -1985. - V. 79, № 6. - P. 870.
17. Ouchterlony O. // Progress Allergy. - 1958. - V. 5. - P. 1-78.
18. Rifaat M.A., Khalil H.M., Salem S.A., Mohamed H.H. // 3-rd Int. Congr. Parasitol. Munich. - 1974. - V. 3. - P. 1209.
19. RifaatM.A. // 2-nd Europ. multicol. parasitol. - Yugoslavia, 1975. - P. 63.
20. Smith W.D. // Res. Vet. Sci. - 1977. - V. 22, № 1. - P. 128-129.
21. Smith H.V., Quinn R., Bruel R.G., Gerdwood R.W. // Acta Parasitol. Pol. -1983. - V. 28, № 38/42. - P. 459-462.
22. Somorin A.O., Meiner D.C. // Clin. Allergy. - 1976. - V. 6, № 6. - P. 573576.
23. Twaiko G.L., Mkufya A. // E. Afr. Mod. J. - 1977. - V. 54, № 12. - P. 680-683.
24. Vior C., Fromunda V., Popescu S. et al. // Arch. Vet. - 1970. - V. 6, № 1/2. - S. 135-145.
25. Wendrychowicz H., Bezubic B. // Acta parasitol. pol. - 1983. - V. 28, № 24. - P.233-244.
Antigenic spectrum of somatic extracts from mature Setaria and Dirofilaria K.A. Hajdarov, V.K. Berezhko
The results of research of the antigenic spectrum of albuminous somatic extracts from mature Dirofilaria and Setaria by reaction immunodiffusion in agar gel (RID) with use of hyperimmune serum in homologous and heterologous variants of reaction are given. It is established in albuminous extract from Dirofilaria 7 and 5, from Setaria - 6 and 5 potential antigenic components respectively. Both extracts reacted with whey infected by D. immitis dogs, showing in RID one complex antigen-antibody. Thus, the albuminous extract from Setaria contains the antigenic component identical functional diagnostic at dirofilariosis.
