CC BY
134
экспериментальные статьи
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.842.11:579.252.55:579.222].083.1
А.В. Козырь1, Н.М. Лунева1, А.Е. Хлынцева1, И.Г. Шемякин1, О.Н. Красавцева1,
А.В. Колесников1'2
антибиотик-зависимая селекция клонов e. coli c повышенной шаперональной активностью для получения
высокоэффективных продуцентов растворимой полноразмерной
металло-бета-лактамазы new delhi
1Институт прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора РФ, Московская область, п. Оболенск; 2ООО "Институт Инженерной Иммунологии", Московская область, п. Любучаны
Металло-бета-лактамаза New Delhi (NDM-1) является одним из новых факторов лекарственной устойчивости ряда патогенных микроорганизмов, обусловливающих их резистентность к любым известным антибиотикам пенициллинового ряда. Разработка эффективных методов получения этого фермента в растворимом состоянии является необходимым условием для изучения путей секреции и проведения высокопроизводительного скрининга для отбора специфичных терапевтически значимых ингибиторов и средств ранней диагностики NDM-1. При суперпродукции в E. coli полноразмерная рекомбинантная NDM-1, как правило, аккумулируется в тельцах включения в неактивной форме. Нами разработан метод получения высокоэффективной экспрессии полноразмерной металло-бета-лактамазы в E. coli c использованием бета-лактамного антибиотика как фактора позитивной селекции бактериальных клонов-продуцентов целевого белка и показано, что эффективность продукции растворимой NDM-1 зависит от уровня шаперональной активности в бактериальной клетке.
Ключевые слова: шаперональная активность, E. coli
Бета-лактамазы обусловливают устойчивость микроорганизмов к природным антибиотикам пенициллинового ряда. Бета-лактамные антибиотики, архетипом для которых является пенициллин, необратимо ингибируют ферменты биосинтеза клеточной стенки бактерий, необходимые для метаболизма пептидогли-канов. Ингибирование биосинтеза пептидогликана приводит к разрушению клеточной стенки, осмотическому шоку и лизису бактериальной клетки. Бета-лактамные антибиотики практически нетоксичны для человека [8, 23], и их единственным, относительно нечасто встречающимся, побочным эффектом является аллергическая реакция, которая может быть легко выявлена заблаговременно. Эти свойства сделали бе-та-лактамные антибиотики самыми распространенными антибактериальными агентами.
Широкое использование бета-лактамных антибиотиков первого поколения привело к распространению бета-лактамаз, гидролизующих расширенный спектр антибиотиков пенициллинового ряда. Применение антибиотиков 2-го и 3-го поколения (цефалоспо-ринов) также индуцировало появление патогенных штаммов микроорганизмов, продуцирующих бета-лактамазы, способные к расщеплению данных соединений. До недавнего времени наиболее эффективными, неуязвимыми и надежными в борьбе с патогенными микроорганизмами считались полусинтетические антибиотики класса карбапенемов. Карбапенемы обладают устойчивостью к гидролизу ферментами всех известных классов сериновых бета-лактамаз и используются, как правило, в качестве антибиотиков резерва против наиболее лекарственно-устойчивых патогенов, таких как метициллин-устойчивые штаммы Streptococcus aureus [26], экстремально лекарственно-
устойчивые штаммы Mycobacterium tuberculosis [12], Streptococcus pneumoniae [10].
Однако в последние годы появились микроорганизмы, устойчивые к действию карбапенемов и нечувствительные к специфическим ингибиторам бета-лактамаз, таким как тазобактам или клавулано-вая кислота. Эти патогены продуцируют ферменты, получившие название карбапенемаз или бета-лакта-маз расширенного спектра [15]. Одними из наиболее распространенных карбапенемаз являются металло-зависимые бета-лактамазы (МБЛ), иначе называемые карбапенемазы класса B [3]. Активные центры этих ферментов содержат не остаток серина, а ионы бива-летных металлов (например, цинка), которые являются необходимыми кофакторами для обеспечения каталитической активности [3, 15]. Как указано выше, МБЛ не ингибируются ни одним из применяемых в медицине ингибиторов бета-лактамаз. Хотя МБЛ ин-гибируются различными хелатирующими агентами, например, ЭДТА или орто-фенантролином [5, 31], а также тиольными соединениями, такими как 2-омега-фенилалкил-3меркаптопропионовая кислота [17] или К-(2-меркаптоэтил)-2фенилацетамид [29], ценность таких ингибиторов с точки зрения разработки терапевтических препаратов ограничена ввиду их способности к неспецифическому ингибированию многих металлосодержащих ферментов. Пример металло-протеаз показывает, что разработка высокоселективных ингибиторов металлозависимых ферментов является весьма сложной задачей.
Особо опасна "мобильность" генетических детерминант многих МБЛ. Хотя некоторые ферменты этой группы закодированы в геномной ДНК, например, BcII из Bacillus cereus [6], CcrA из Bacteroides fragilis [28], BlaB из Chryseobacterium meningosepticum [11], целый ряд генов МБЛ локализуется на плазмидах, которые имеют весьма широкий спектр возможных бактерий-реципиентов [38].
Ярким примером МБЛ, способных к горизонтальному (межвидовому) переносу, является недавно описанная лактамаза New Delhi (NDM-1). Эта лактамаза была впервые идентифицирована в бактериальном изоляте, происходящем из Нью-Дели в Индии [38]. Впоследствии бактериальные изоляты, содержащие NDM-1, были обнаружены в целом ряде государств на различных континентах [22, 24, 36]. Активное распространение NDM-1 частично обусловлено высокой эффективностью горизонтального переноса плазмид группы несовместимости IncL/M, несущих ген данной металло-бета-лактамазы [16], однако существенным фактором положительной селекции патогенных
штаммов с NDM-1 является широкое (и зачастую бесконтрольное) применение бета-лактамных антибиотиков. NDM-1 расщепляет все известные карбапене-мы и бета-лактамные антибиотики. При попадании плазмиды с NDM-1 в бактерии последние становятся устойчивыми к любым из упомянутых антибиотиков, представляя собой значительную угрозу здоровью людей. Лишь очень немногие антибиотики, такие как колистин, тайгециклин, фторохинолоны, Д-каптоприл и полимиксин Б [11], могут быть использованы для терапии заболеваний, вызванных патогенами, несущими NDM-1.
Таким образом, необходима срочная разработка специфических ингибиторов NDM-1, которые могут служить основой для создания новых эффективных антибиотиков. Эта задача осложняется как нахождением ингибиторов, селективных по отношению к металлосодержащим ферментам человека, в частности, металлопротеиназам, так и обеспечением исследовательских программ высокопроизводительного скрининга и кристаллизации NDM-1 достаточным количеством высокоочищенного фермента-мишени (сотни и более миллиграмм). Достигнутый уровень экспрессии рекомбинантной NDM-1, в особенности полноразмерного белка, содержащего всю N-концевую область, в E. coli невысок. [20]. До конца неясным остается тип процессинга и секреции белка: сайт отщепления сигнального пептида, как и тип секреторного пути NDM-1, точно не определены [39]. Указанные факторы затрудняют эффективную продукцию и очистку NDM-1, изучение созревания NDM-1 и локализации ее зрелой формы, проведение структурно-функционального анализа NDM-1 и разработку специфических ингибиторов, в том числе аллостерических или конформационных, которые могут значительно превосходить по селективности классические ингибиторы, связывающиеся с активным центром фермента [9]. Нами было проведено изучение свойств белка и параметров его продукции, на основании которого удалось значительно повысить уровень экспрессии различных форм растворимой рекомбинантной бета-лактамазы NDM-1 в E. coli.
Материалы и методы
Реактивы и материалы
Если не указано иное, реактивы, использованные в данной работе, приобретались в компании "Sigmа" (США) и имели квалификацию "ACS Grade" или "Molecular Biology Grade". Олигонуклеотиды были синтезированы компаниями "Евроген" и "Синтол" (Россия). Вода, использованная для проведения экспериментов, была получена на установке Millipore Integral 3 ("Millipore", США) и имела сопротивление 18 МП. Воду дополнительно стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при температуре 121°С и давлении 1 атм. Были использованы бактериальные среды и агар-агар производства компании "Becton Dickinson" (США). Ферменты, модифицирующие нуклеиновые кислоты, приобретались в компании "Thermo/Fermentas" (США). Нитроцефин был получен в компании "EMD Millipore" (США). Плазмида, содержащая гены белков GroES/GroEL, была любезно предоставлена Dr. K.E. Amrein (Швейцария). Хроматографи-ческие сорбенты Chelating Sepharose FF и Talon SuperFlow приобретались в компаниях "GE Healthcare" и "Clontech" (США).
Получение конструктов, кодирующих рекомбинантные белки
Ген металло-бета-лактамазы NDM-1 синтезировали при помощи ПЦР на основании аминокислотной последовательности NDM-1 (номер GenBank ADP05158.1) c использованием кодонов, оптимизированных для высокоэффективной продукции белков в E. coli. Полученный ген был клонирован в плазмиду pET22b(+) ("Novagen", США) по сайтам NdeI и XhoI, внесенным в состав синтетической последовательности.
Для получения гена NDM-1, не содержащего сигнального пептида, оптимизированный конструкт был амплифицирован с использованием обратного праймера F3RV_XH (ATAATTCTCGAGTTAGCGCAGCTTGTC GGCCATGC) и прямого праймера F1FV_BM (ATAATTTGGATCCGGG CCAGCAAATGGAAACTGGCGA). Продукт амплификации был переварен эндонуклеазами BamHI и XhoI и клонирован в экспрессионный вектор, несущий ген устойчивости к канамицину pET-MASMT(Kan), расщепленный эндонуклеазами BamHI и XhoI [1]. Аналогичным образом проводилось получение экспрессионных конструктов для делеционных вариантов NDM-1.
Клон кДНК, кодирующий полноразмерную протеинкиназу CSK человека, был приобретен в компании "ImaGenes" (Германия), ген протеин-киназы был амплифицирован при помощи прямого и обратного прайме-ров CSKForNde (TTATCTAACCATATGTCAGCAATACAGGCCGCCT) и CSKRevXho (TTTAGA CTCGAG TTACAGGTGCAGCTCGTGGGTTT) и клонирован в экспрессионный вектор pET22b(+), расщепленный эндо-нуклеазами BamHI и XhoI.
Получение бицистронного конструкта, содержащего экспрессион-ные модули CSK и NDM-1, проводилось на базе плазмидного вектора pET28a(+) ("Novagen", США). Модуль CSK амплифицировали с плаз-мидной ДНК экспрессионного вектора, полученного на базе pET22b(+), и использованием стандартного форвардного праймера T7 ("Novagen", США) и реверсного праймера CSKRevRI (TTTAGAGAATTCTTACAGG TGCAGCTCGTGGGTTT), содержащего сайт эндонуклеазы EcoRI. Продукт амплификации обрабатывали эндонуклеазами EcoRI и XbaI и клонировали в вектор pET28a(+), расщепленный теми же эндонуклеазами. Модуль NDM-1 NA36 амплифицировали с плазмидной ДНК экспресси-онного вектора, содержащего ген NDM-1 c соответствующей делеций, и с использованием форвардного праймера ForSal (AATTGTCGACGG GGAATTGTGAGCGGATAACA) и реверсного праймера CSKRevXho. Продукт амплификации клонировали в вектор, содержащий экспресси-онный модуль CSK, по сайтам эндонуклеаз рестрикции SalI и XhoI.
Корректность встраивания последовательностей всех экспрессионных конструктов тестировали при помощи секвенирования плазмидной ДНК.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков
Получение протеинкиназы CSK
Вектор, кодирующий оперон GroES//GroEL, содержал участок инициации репликации ДНК p15, совместимый с репликоном ColEl, и нес ген устойчивости к хлорамфениколу в качестве селективного маркера. Векторами, кодирующими протеинкиназу и шапероны, котрансформировали бактерии штамма E. coli BL21(DE3) методом электропорации и высевали на селективную агаризованную (1%) среду 2xYT, содержащую 100 мкг/ мл ампициллина и 50 мкг/мл хлорамфеникола. Наращивание культуры проводили из единичной колонии-трансформанта в жидкой среде 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, 50 мкг/мл хлорамфеникола и 0,1% глюкозы. Продукцию белка инициировали добавлением ИПТГ до концентрации 0,2 мМ и наработку белка проводили при температуре 30°С в течение 3 ч. Бактерии собирали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, суспендировали в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 8, и 50 мМ NaCl, и лизировали добавлением Тритона X-100 до концентрации 0,5%. Бактериальную ДНК расщепляли обработкой ДНКазой в концентрации 10 мкг на 1 мл лизата и осветляли лизат центрифугированием при 18000 об/мин в течение 30 мин. Рекомбинантную протеинкиназу CSK, не содержащую гексагистидинового пептида, очищали из бактериального лизата с использованием металл-хелатной хроматографии на колонке, упакованной Chelating Sepharose FF ("GE Healthcare", США), заряженной ионами Zn2+, используя естественную способность активного центра протеинкиназы CSK хелатировать ионы двухвалентных металлов [30].
Получение металло-бета-лактамазы NDM-1
Для проведения экспрессии рекомбинантной NDM-1 в стандартных условиях вектором, несущим экспрессионный конструкт NDM-1, трансформировали компетентные клетки E. coli BL21(DE3). Единичные колонии полученного трансформанта выращивали в течение ночи на жидкой среде 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1% глюкозы. Наращивание продуцента NDM-1 проводили до достижения оптической плотности 0,8—1 ОЕ при 37°С в качалочных колбах с 250 мл среды 2xYT, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозы, засеянных ночной культурой NDM-1 из расчета 1/20 объема среды. Индукцию синтеза белка осуществляли добавлением ИПТГ до конечной концентрации 0,2 мМ, продукцию белка вели при температуре 30°С в течение 3 ч. При проведении экспрессии белка в оптимизированных условиях индукцию осуществляли при температуре 25°С добавлением ИПТГ до концентра-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ции 0,1 мМ, и вели продукцию белка при той же температуре в течение 10 ч с дополнительным добавлением 100 мкг/мл ампициллина через 5 ч после индукции. В тех же условиях проводили экспрессию белка с использованием бицистронного конструкта, несущего модули протеинки-назы CSK и NDM-1. Осветленный лизат во всех случаях готовили так, как описано для протеинкиназы CSK.
Очистку всех вариантов рекомбинантной NDM-1 проводили с использованием металл-хелатной хроматографии на сорбенте Talon ("Clontech", США), заряженном ионами Co2+. Осветленный лизат наносили на колонку, упакованную данным сорбентом, колонку промывали 10 объемами буфера (20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl) и элюи-ровали целевой белок тем же буфером, содержащим 250 мМ имидазо-ла. Все хроматографические процедуры проводили при +4°С. Чистоту полученных белковых препаратов контролировали денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле по методике Лэммли. Полученный белок стабилизировали добавлением 30% глицерина и хранили в аликвотах при -70°С.
Солюбилизация телец включения
Тельца включения, содержащиеся в осадке после отделения осветленного лизата центрифугированием, трижды промывали, суспендируя в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 1 М хлорида натрия, собирая тельца центрифугированием при 18 000 об/мин в течение 15 мин на каждом раунде промывки. Растворение телец проводили в буфере, содержащем 20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ хлорида натрия, 6 М гуа-нидин-хлорида, в который добавляли либо не добавляли ДТТ до концентрации 10 мМ в зависимости от условий эксперимента. Растворение телец осуществляли с использованием гомогенизатора Даунса 20 ударами плотно прилегающего пестика. Нерастворенный материал и клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 18 000 об/мин в течение 20 мин. Растворение телец включения контролировали денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле по методике Лэммли.
Кинетические исследования гидролиза хромогенного субстрата нитроцефина под действием NDM-1
Для определения кинетических параметров металло-бета-лактама-зы NDM-1 проводили измерение оптического поглощения раствора при конверсии колориметрического хромогенного субстрата нитроцефина в различных концентрационных соотношениях фермента к субстрату. Описание параметров стационарной кинетики — константы Михаэлиса (Км) и константы каталитической (kcat) для полученного рекомбинантно-го фермента NDM-1 проводили на основе серии проведенных измерений значений оптической плотности при длине волны 486 нм. Реакцию расщепления субстрата (в концентрации от 1 до 100 мкМ) проводили в буфере с троекратной повторностью, содержащем 10 мМ ХЕПЕС, pH 7,5, при температуре 30°С. Скорость реакции определяли по скорости изменения оптической плотности (OD/мин) в растворе при различных соотношениях концентраций фермента и субстрата. Расчеты констант выполняли с применением метода линеаризации Ханеса—Вулфа [14]. Кинетический процесс расщепления субстрата описывали уравнением Михаэлиса— Ментена, показывающим зависимость начальной скорости реакции (v0) от равновесия комплекса фермент-субстрат и константы скорости реакции
vo = V„[S]/Km + [S],
где vo — начальная скорость реакции;
Vmax — максимальная скорость реакции;
S—максимальная концентрация субстрата в ферментативной реакции;
Км — константа Михаэлиса.
Константа скорости реакции первого порядка kcat отражает число оборотов фермента или число молекул субстрата нитроцефина, конвертированного лактамазой NDM-1 в продукт реакции за единицу времени в случае, если фермент работает с максимальной эффективностью. Соотношение константы скорости реакции с максимальной скоростью реакции рассчитывали в соответствии с уравнением
Vmax = kcat [Et],
где Vmax — максимальная скорость реакции;
Et — тотальная концентрация фермента в реакции.
Каталитическая эффективность фермента характеризовалась соотношением значений констант kcat/Км.
Определение каталитической активности рекомбинантной протеинкиназы CSK
Удельную активность CSK определяли при помощи универсального набора ADP-Glo™ ("Promega"). Определение активности фермента проводили в сопряженной реакции, в которой измерение активности
фермента проводили на основании активности люциферазы в присутствии АТФ, конвертированного из АДФ, являющегося, в свою очередь, продуктом реакции фосфорилирования под действием протеинкиназы. Реакцию фосфорилирования проводили в буфере, содержавшем 30 мМ ХЕПЕС, pH 6,8, 20 мкМ АТФ, 5 мМ MnCb, 0,05 мМ ДТТ и 200 мкг/мл дефосфорилированного альфа-казеина. Согласно инструкции производителя, после остановки реакции и элиминации непрореагировавшего АТФ и конверсии АДФ с использованием ADP-Glo™ реагента, в реакционную смесь добавляли люциферазу и проводили измерения люминесценции с использованием прибора Varioskan Flash ("Thermo Scientific", США). В реакции использовали от 100 пг до 10 нг протеинкиназы. В качестве положительного контроля использовали препарат CSK, полученный при ко-оверпродукции шаперонов GroES и GroEL [2].
Результаты и обсуждение
Задачей настоящего исследования являлась разработка высокоэффективной системы экспрессии ме-талло-бета-лактамазы NDM-1, необходимой для получения больших количеств различных форм белка для проведения биохимического анализа и поиска различных типов ингибиторов и детектирующих молекул, включая аптамеры и моноклональные антитела к данному ферменту. Ранее проведенные исследования показали, что уровень экспрессии растворимой рекомби-нантной NDM-1, как правило, невысок. На основании компьютерного моделирования и анализа N-концевой последовательности зрелого фермента была выдвинута гипотеза о том, что что NDM-1 имеет классический сигнальный пептид, что обусловливает его секрецию в периплазму бактерий по первому (Type I) пути секреции [32]. Альтернативная гипотеза рассматривает секрецию NDM-1 по пути липопротеинового сортинга (Type II), c локализацией фермента на внешней мембране бактерий, что является нетипичным для бета-лактамаз [21]. В некоторых работах указывалось, что в результате периплазматической экспрессии NDM-1 образуются различные субтипы целевого белка, имеющие гетерогенную jV-концевую область [32]. Уточнение локализации и путей секреции NDM-1 важно для разработки специфических ингибиторов и терапевтических стратегий. Неизбежным требованием к проведению исследований по уточнению путей секреции и локализации NDM-1 является создание высокоэффективной системы гетерологичной экспрессии данного фермента, позволяющей продуцировать различные модификации фермента, не содержащие гетерогенных фрагментов, в частности, вариант NDM-1, содержащий интактную N-концевую последовательность [37].
Известно, что при продукции белка с использованием стандартных подходов выход растворимого белка NDM-1 в E.coli невысок, в особенности при экспрессии NDM-1 с нативной лидерной последовательностью [20]. Количественные данные о продукции растворимого фермента, содержащего полноразмерную сигнальную последовательность, отсутствуют. Степень удаления N-концевой части белка коррелирует не только с каталитической активностью, но, по-видимому, и с выходом растворимого белка. Полноразмерный белок NDM-1 нерастворим и при продукции образует нерастворимые тельца включения [37]. Для обеспечения продукции растворимых фрагментов NDM-1, содержащих делеции в N-концевой области, используют технологии слитных белков, при этом объемные белки-партнеры, как правило, необходимо удалять при помощи сайт-специфического про-теолиза [32, 37].
Таблица 1
Продукция растворимого белка в E. coli при экспрессии конструктов, содержащих полноразмерный ген NDM-1
и его делеционные мутанты
Вариант гена NDM-1 Количество белка NDM-1, полученное после экспрессии и очистки растворимой фракции клеточного лизата с 1 л культуры продуцента Наличие телец включения Удельная активность NDM-1 1 Ед = 1 мкМ х мин-1 х мг-1
NDM-1 A0 (полноразмерный) Не определено +++ <1
NDM-1 A6 Не определено +++ <1
NDM-1 A21 Не определено +++ <1
NDM-1 A36 5,2 мг +/- 72
NDM-1 A38 5,1 мг +/- 69
NDM-1 A47 4,9 мг + 58
Примечание. Экспрессию белка проводили в стандартных условиях (наработка биомассы при 37°С до оптической плотности 0,8, индукция ИПТГ при 30°С с последующей трехчасовой инкубацией при той же температуре). Единицы удельной активности фермента определяли по отношению к субстрату нитроцефину (коэффициент экстинкции нитроцефина составляет 20500 при длине волны 486 нм).
Нами была проанализирована эффективность экспрессии N-концевых делеционных мутантов фермента, содержавших C-концевой пептид His6 для аффинной очистки. Данные о выходе растворимого белка для различных мутантов и полноразмерной NDM-1, А0, суммированы в табл. 1. При стандартных условиях экспрессии (наработка биомассы при 37°С до оптической плотности 0,8, индукция ИПТГ при 30°С с последующей трехчасовой инкубацией при той же температуре) только мутанты А36 [32, 37], А38 [20] и А47 [13] продуцировали около 5 мг/л растворимого белка. Остальные производные NDM-1 (мутанты А21, А6 [37] и полноразмерный белок) формировали нерастворимые тельца включения, хотя белок, очищенный из растворимой фракции при помощи металл-хелатной хроматографии, с низкой эффективностью был способен гидролизовать нитроцефин. Поскольку контрольные лизаты E. coli не обладали нитроцефин-гидролизую-щей активностью, был сделан вывод о присутствии в данных препаратах незначительных количеств растворимого белка NDM-1, чистота и удельная активность которого не удовлетворяли поставленной задаче.
Рентгеноструктурный анализ показал отсутствие дисульфидных связей в NDM-1, в молекуле которой Cys26 находится в составе сигнального пептида, а Cys208 участвует в координации иона цинка, Zn2+, в активном центре этой МБЛ [21]. Электрофоретический анализ гомогенности белка NDM-1 в солюбилизированных тельцах включения, обработанных и не обработанных восстанавливающим агентом (дитиотрейтол), также продемонстрировал отсутствие внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей в структуре содержащегося в них белка. Известно, что цистеин входит в активный центр многих МБЛ и, по-видимому, вовлечен в формирование консервативного элемента фолдинга, являясь малодоступным для формирования S-S связей [34].
Нами была изучена возможность позитивной селекции клонов E. coli, эффективно продуцирующих активную NDM-1 в цитоплазме [32]. Конструкты, А36 и А0, были модифицированы путем введения в последовательность экспрессируемого продукта N-концевого пептида, содержащего трансляционный контекст гена 10 фага Т7 для обеспечения успешной инициации трансляции, пептид His6 и гидрофильный пептид с-тус, распознаваемый антителом 9Е10 [1]
(рис. 1). Полученные конструкты, обозначенные как NA36 и NA0, были клонированы в вектор pET28a(+) (KanR). Полученные плазмиды, а также ранее сконструированные мутанты A36 и A0 трансформировали в E. coli, инкубировали 3 ч в среде без антибиотика для того, чтобы обеспечить накопление NDM-1, и высевали на 3 вида агаризованной селективной среды (Amp+/Kan+; Amp+/Kan-; Amp-/Kan+), каждый из которых был представлен двумя вариантами — содержащим или не содержащим 1% глюкозы, являющейся катаболитным репрессором 1ас-промотора [33]. В присутствии глюкозы рост колоний на средах Amp+/Kan+ и Amp+/Kan- полностью блокировался, тогда как в отсутствие глюкозы на обеих средах наблюдался рост колоний, число которых уступало числу колоний, выросших на среде Amp-/Kan+, в 30 и в 10 раз соответственно. Статистически значимых различий между числом колоний, содержащих различные варианты конструктов, обнаружить не удалось. На основании полученной информации была предпринята попытка провести экспрессию NDM-1 в присутствии обоих антибиотиков. Однако прямое воспроизведение в жидкой культуре условий роста клеток на агаризованной среде (рост в отсутствие глюкозы с добавлением антибиотиков) приводило к низкому выходу биомассы, в силу чего эффективность продукции NDM-1 не была увеличена.
На следующем этапе клетки, выращенные на ага-ризованной среде Amp+/Kan+ в отсутствие глюкозы, засевали в жидкую среду, содержащую 0,1% глюкозу и канамицин, но не содержащую ампициллина, и растили в течение 4—4,5 ч, за которые накопление клеточной массы происходило так же, как и при проведении стандартного протокола экспрессии, при этом OD600 достигала 0,9—1 ОЕ. Примерно за это же время глюкоза метаболизируется, что способствует частичной инициации экспрессии целевого белка. На этой стадии синтез белка индуцировали добавлением 0,1 мМ ИПТГ, температуру снижали до 25°С и в среду добавляли ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Продукцию белка вели в течение 10 ч при температуре 25°С с дополнительным добавлением 100 мкг/ мл ампициллина через 5 ч после индукции. По окончании экспрессии проводили выделение и очистку растворимого белка методом металл-хелатной хрома-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
NDM-1 ДО
MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGD. ...MADKLR
NDM-1 Д6
..................MHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGD.
...MADKLR
NDM-1A21
...............................................................MLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGD.
...MADKLR
NDM-1ДЗ 6
.........................................................................................................MQQMETGDQRFGD.
...MADKLR
NDM-1A38
................................................................................................................METGDQRFGD.
...MADKLR
NDM-1 Д47
.......................................................................................................................................MD...
...MADKLR
Рис. 1. Структура делеционных мутантов NDM-1.
тографии. Данные электрофореза по результатам экспрессии и очистки NDM-1 c применением оптимизированных условий приведены на рис. 2.
Выход полноразмерной растворимой NDM-1 NA0 и ДО в результате очистки составил 20 мг с литра среды, а выход модифицированной NDM-1 NД36 и Д36 — более 50 мг c литра среды без оптимизации условий наработки биомассы и выделения белка. Данный результат как минимум в 4 раза превосходит данные, приводимые ранее по максимальному уровню продукции белка с удаленной лидерной областью [32]. В работе [20] указывается, что выход NDM-1 с де-лецией 38-Ы-концевых аминокислот составил около 100 мг с 1 л культуры. Авторам не удалось воспроизвести условия, при которых выход белка достигал бы таких величин, кроме того, цифры, приведенные в данной работе, не воспроизводятся и другими исследователями [32], а детальный протокол экспрессии в работе [20] не приводится. На основании опубликованной информации сложно судить и о степени улучшения продукции полноразмерной растворимой формы NDM-1, однако в вышеупомянутой работе он не превышал 2 мг с 1 л культуры [20] (неясно, шла ли речь о зрелом секретируемом продукте или о тотальном растворимом белке). В другом исследовании указывается на продукцию полноразмерной NDM-1 исключительно в виде телец включения [37], что свидетельствует о значительном преимуществе разработанного нами подхода к продукции полноразмерного продукта NDM-1 в цитоплазме.
Полученные результаты демонстрируют, что проведение селекции клонов клеток, наиболее успешно продуцирующих NDM-1 на агаризованной среде, оказывается достаточно эффективным для того, чтобы последующая наработка биомассы в отсутствие селекционного давления не привела к существенной потере уровня продукции целевого белка отобранными клонами. Повторное добавление ампициллина при индукции экспрессии обеспечивает элиминацию клеток, неэффективно продуцирующих NDM-1, и приводит к сохранению продукции растворимого целевого белка на высоком уровне.
12 3 4
Рис. 2. Электрофореграмма по результатам экспрессии и очистки полноразмерного рекомбинантного белка NDM-1 Д0. Экспрессию белка проводили в оптимизированных условиях (индукция 0,1 мМ ИПТГ, температура продукции белка 25°С, время продукции
10 ч, двухкратное добавление ампициллина до 100 мкг/мл — при индукции и через 5 ч после индукции). Разделение продуктов вели в 10% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу Лэммли, окрашивание Кумасси. Дорожка 1 — маркер молекулярной массы SM 0671 ("Thermo/Fermentas", США); дорожка 2 — растворимая фракция клеточного лизата по окончании продукции белка; дорожка 3 — нерастворимая фракция клеточного лизата по окончании продукции белка; дорожка 4 — белок NDM-1, очищенный из клеточного лизата металл-хелатной хроматографией.
Нами был проведен анализ кинетики гидролиза нитроцефина четырьмя вариантами NDM-1, сконструировавши в ходе данного исследования. Результаты анализа приводятся в табл. 2. Полученные значения кинетических констант близки к ранее опубликованным кинетическим параметрам гидролиза нитроцефина рекомбинантными вариантами NDM-1 [37]. Как и ожидалось, каталитическая активность полноразмерной NDM-1 значительно ниже активности фрагмента NDM-1 с ^концевой делецией. При этом отличия значений констант между вариантами, содержащими и не содержащими ^концевой пептид His6-с-myc, невелики, что свидетельствует об отсутствии влияния этого компонента на активный центр NDM-1. Таким образом, в случае необходимости получения значительных количеств активного белка NDM-1, не содержащего посторонних ^концевых последовательностей, возможно использование конструктов Д0 и Д36, несущих С-концевой пептид His6.
Почему в определенных условиях в присутствии бе-та-лактамного антибиотика происходит значительное повышение уровня продукции активного фермента? Логичное объяснение этому заключается в том, что при наличии селективного давления (присутствие бета-лак-тамного антибиотика) преимущество получают те по-
Таблица 2
Кинетические параметры NDM-1, определенные по отношению к субстрату нитроцефину для препаратов рекомбинантного белка, полученных при экспрессии конструктов, содержащих полноразмерный ген NDM-1 и его делеционные мутанты
Вариант гена NDM-1 kcat, с-1 Km, мкМ kcat / Km, моль"1хс"1
NDM-1 Д0 1,4±0,2 18,2±0,3 1,3 х 107
(полноразмерный)
NDM-1 ^0 1,8±0,3 27,1±0,4 1,5 х 107
(полноразмерный)
NDM-1 Д36 1,9±0,2 97,6±4 5,1 х 107
NDM-1 ^36 2,2±0,4 129,8±3 5,9 х 107
пуляции клеток, в которых выше продукция активной металло-бета-лактамазы. Неоднородность популяции E. coli с точки зрения эффективности продукции ре-комбинантных белков описана достаточно давно [18]. Гетерогенность популяции экспрессионного штамма E. coli может быть связана как с мутациями в управляющих индукцией экспрессии элементах [25, 35], так и с другими, до сих пор не идентифицированными факторами [19]. Фактором, обусловливающим эффективную продукцию NDM-1 в конкретной субпопуляции E. coli, может быть повышенный уровень экспресии одного или нескольких белков-катализаторов фолдин-га, известных как шапероны [4]. Под действием селекционного давления, обеспечиваемого ампициллином, наиболее эффективно выживают те субпопуляции клеток, в которых повышенная активность шаперонов обеспечивает корректный фолдинг больших количеств NDM-1. Принципиальным отличием фолдинга цито-плазматических и периплазматических белков может быть необходимость правильного формирования у последних дисульфидных связей, однако структурные исследования показали отсутствие у NDM-1 дисуль-фидных мостиков. Вместе с тем хорошо известны се-кретируемые белки, способные корректно складываться в цитоплазме E. coli, например, летальный фактор и протективный антиген сибирской язвы [1]. Интересно, что в составе этих больших белков (масса 80—90 кД), аминокислотные остатки цистеина отсутствуют.
С целью проверки гипотезы о роли повышенной продукции шаперонов в повышении выхода активной NDM-1 в цитоплазме E. coli был проведен модельный эксперимент с использованием протеинкиназы CSK. Ранее было показано, что фолдинг CSK в цитоплазме E.coli малоэффективен, и что эффективность формирования корректно сложенного белка может быть значительно увеличена совместной сверхпродукцией шаперонов GroEL и GroES [2]. Другие шаперональ-ные белки (dnaK/J) также могут повышать эффективность фолдинга этой и других протеинкиназ [7]. Вне зависимости от того, какая из шаперональных систем обладает повышенной активностью в клетках, селектированных под действием ампициллина, она может обеспечить увеличение продукции CSK. Таким образом, протеинкиназа CSK может быть использована в качестве репортера для определения зависимости уровня продукции растворимого активного фермента NDM-1 от уровня шаперональной активности. Для проверки этой гипотезы в плазмиде pET28a(+) был создан бицистронный конструкт, состоящий из гена
CSK и гена NDM-1 NA36. Устойчивость бактерий к антибиотикам, обусловленная наличием этой плазми-ды, обеспечивается как за счет гена устойчивости к канамицину, расположенного на плазмиде в виде отдельного цистрона (резистентность к Kan), так и за счет клонированного в составе экспрессионного конструкта гена NDM-1 (резистентность к Amp). Колонии после трансформации выращивали на среде, содержавшей Amp и Kan, затем проводили экспрессию, полностью воспроизводя условия эффективной продукции NDM-1, описанные выше. Экспрессионная конструкция, служащая отрицательным контролем, содержала только ген CSK, положительный контроль обеспечивался системой из двух плазмид (с геном CSK и генами GroES/GroEL) с совместимыми сайтами начала репликации (см. "Материалы и методы"). После проведения экспрессии и очистки продукты анализировали электрофоретически. Результаты анализа приводятся на рис. 3. Видно, что высокий уровнь экспрессии NDM-1 NA36 в составе дицистронного конструкта наблюдается на фоне значительного повышения выхода растворимой протеинкиназы CSK. Изучение активности CSK показало сравнимую удельную активность фермента, полученного при совместной сверхэкспрессии как GroES/EL, так и NDM-1 NA36. На основании полученной информации можно сделать вывод о том, что при экспрессии NDM-1 в присутствии селективного давления происходит отбор клеток, обладающих повышенным уровнем продукции шаперональных комплексов. Эти комплексы обеспечивают эффективный фолдинг бета-лактамазы и, следовательно, преимущество в росте по сравнению с клетками, не обеспечивающими высокий уровень продукции корректно сложенной NDM-1.
Таким образом, в ходе данного исследования нами разработана эффективная система продукции растворимой каталитически активной бета-лактамазы NDM-1 на основе селекции продуцентов под действием ампициллина. Показано, что в присутствии фактора селекции при сверхпродукции NDM-1 происходит отбор клеток, характеризующихся повышенным уровнем экспрессии шаперональных белков. Данная система экспрессии NDM-1 может применяться для получения больших количеств активного фермента с гомогенным N-концевым участком, для кристаллизации белка, поиска ингибиторов NDM-1 методом высокопроизводительного скрининга, биохимических и физико-химических исследований. Разработанная методика экспрессии NDM-1, позволяющая эффективно продуцировать фермент с дополнительными N-концевыми и C-концевыми пептидами, может быть успешно применена для идентификации пути секреции и локализации NDM-1 с использованием, к примеру, in vivo биотини-лирующегося пептида [27]. Полученные данные могут создать предпосылки для разработки эффективных ингибиторов NDM-1 и других металло-бета-лактамаз. Система селекции клонов E. coli с повышенным уровнем шаперональной активности может быть использована для определения эффективности фолдинга реком-бинантных белков в E. coli.
Работа выполнена в рамках Федеральной целевой программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007—2012 годы"
ЭKСПEРИMEHTAЛЬHЫE СТАТЬИ
1 2 3 4 5 6 7 8
Рис. 3. Продукция NDM-1 и С8К в зависимости от шаперональной активности. Электрофореграмма растворимой фракции клеточного лизата по окончании продукции белка. Экспрессию проводили в стандартных условиях, электрофорез вели в 10% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях по методу Лэммли, окрашивание Кумасси. Дорожка 1 — маркер молекулярной массы SM 0671 ("Thermo/Fermentas", США);
дорожка 2 — лизат клеток BL21(DE3), не содержащих плазмиды с экспрессионным конструктом; дорожка 3 — лизат клеток BL21(DE3), трансформированных экспрессионной плазмидой pET22b^SK; дорожка 4 — лизат клеток BL21(DE3), ко-трансформированных экспрессион-ными плазмидами pET22b^SK и p15GroEs/GroEL; дорожка 5 — лизат клеток BL21(DE3), трансформированных экспрессионной плазмидой pET28a/NDMNД36; дорожки 6—8 — лизаты клонов клеток BL21(DE3), трансформированных экспрессионной плазмидой pET28a/NDMNД36/ CSK, обладающие различным уровнем шаперональной активности.
по лоту 2011-1.2-512-018-080 "Разработка методов идентификации и анализа патогенности и/или лекарственной устойчивости бактерий для создания диагностических тест-систем" по теме "Разработка технологии высокочувствительной ранней диагностики бактериальных патогенов и на основе амплификации мишень-направленных ДНК-аптамеров".
Сведения об авторах:
Козырь Арина Владимировна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, e-mail: [email protected] Лунева Нина Михайловна — мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, e-mail: [email protected]
Хлынцева Анна Евгеньевна — канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, e-mail: [email protected]
Шемякин Игорь Георгиевич — д-р биол. наук, зам. директора ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, e-mail: [email protected]
Красавцева Ольга Николаевна — науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, e-mail: [email protected]
Колесников Александр Владимирович — канд. биол. наук, зав. лаб. иммунопротеомики Института Инженерной Иммунологии, Любучаны, вед. науч. сотр. лаб. молекулярной биологии ФБУН ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, Оболенск, e-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА
1. Колесников А.В., Захарова М.Ю., Козырь А.В., Шемякин И.Г. Патент 2361921, РФ [Электронный ресурс]: ФИПС. URL: http:// www.fips.ru/cdfi/Fips2009.dll/CurrDoc?SessionKey=WFWM51 WE1EVX0C5C37I0&GotoDoc=3&Query=1 (дата обращения 18.09.2012).
2. AmreinK.E., TakacsB., StiegerM. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92: 1048—52.
3. Bebrone C. Biochem. Pharmacol. 2007; 74: 1686—701.
4. Bochkareva E.S., Lissin N.M., Girshovich A.S. Nature. 1988; 336: 254—7.
5. BushK., Jacoby G. Antimicrob. Agents Chemother. 2010; 54: 969— 76.
6. CarfiA., Pares S, DueeE. et al. EMBO J. 1995; 14: 4914—21.
7. Caspers P., Stieger M., Burn P. Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 1994; 40: 635—44.
8. DrawzS.M., BonomoR. Clin. Microbiol. Rev. 2010; 23: 160—201.
9. Druker B.J., Tamura S., Buchdunger E. et al. Nat. Med. 1996; 2: 561—6.
10. Feldman C, AndersonR. Drugs. 2011; 71: 131—53.
11. Garcia-Saez I., Hopkins J., Papamicael C. et al. J. Biol.Chem. 2003; 278: 23868—73.
12. Gillespie S.H., Singh K. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 2011; 6: 77—83.
13. Guo Y, Wang J., Niu G. et al. Protein Cell. 2011; 2: 384—94.
14. Hanes C.S. Biochem. J. 1932; 26: 1406—21.
15. HelfandM.S., BonomoR.A. Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2003; 3: 9—23.
16. HoP.L., Lo W.U., YeungM.K. et al. PLoS One. 2011; 6: e17989.
17. Jin W., Arakawa Y., YasuzawaH. et al. Biol. Pharm. Bull. 2004; 27: 851—6.
18. Khlebnikov A., Datsenko K.A., Skaug T. et al. Microbiology. 2001; 147: 3241—7.
19. Khlebnikov A., Risa O., Skaug T. J. Bacteriol. 2000; 182: 7029—34.
20. Kim Y.C., Tesar C., Mire J. et al. PLoS One. 2011; 6: e24621.
21. KingD., StrynadkaN. Protein Sci. 2011; 20: 1484—91.
22. Kumarasamy K.K., Toleman M.A., Walsh T.R. et.al. Lancet Infect. Dis. 2010; 10: 597—602.
23. Llarrull L.I., Testero S., Fisher J.F. et al. Curr. Opin. Microbiol. 2010; 13: 551—7.
24. MarraA. Fut. Microbiol. 2011; 6: 137—41.
25. MirouxB., Walker J.E. J. Mol. Biol. 1996; 260: 289—98.
26. Nathwani D., Davey P.G., Marwick C.A. Clin. Evid. (Online). 2010. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=PMID%3A%20 21418679 (дата обращения 19.09.2012).
27. Predonzani A., Arnoldi F., Löpez-Requena A. BMC Biotechnol. 2008; 8: 41.
28. Rasmussen B.A., Yang Y., Jacobus N. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1994; 38: 2116—20.
29. SiemannS., ClarkeA.J., Viswanatha T. et.al. Biochemistry. 2003; 42: 1673—83.
30. Sun G., Budde R.J. Protein Expr. Purif. 2001; 21: 8—12.
31. Tamilselvi A., Mugesh G. J. Biol. Inorg. Chem. 2008; 13: 1039—53.
32. Thomas P.W., Zheng M., Wu S. et al. Biochemistry. 2011; 50: 10102—13.
33. TylerB., Loomis W.F. Jr., MagasanikB. et al. J. Bacteriol. 1967; 94: 2001—11.
34. VanhoveM., ZakhemM., DevreeseB. et al. Cell Mol. Life Sci. 2003; 60: 2501—9.
35. Wagner S., Klepsch M.M., Schlegel S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008; 105: 14371—6.
36. Yamamoto T., Takano T., Iwao Y. et al. J. Infect. Chemother. 2011; 17: 435—9.
37. YangH., AithaM., Hetrick A.M. et al. Biochemistry. 2012; 51: 3839—47.
38. Yong D., Toleman A.M., Giske G.C. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 53: 5046—54.
39. ZhangH., Hao Q. FASEB J. 2011; 25: 2574—82.
Поступила 15.01.13
ANTIBIOTIC-DEPENDENT SELECTION OF THE E.COLI CLONES WITH INCREASED CHAPERONE ACTIVITY FOR HIGHLY-EFFICIENT PRODUCTION OF THE FULL-LENGTH SOLUBLE NEW DELHI METALLO-BETA-LACTAMASE
А. V. Kozyr', N. М. Luneva', А. Е. Khlyntseva', I. G. Shemyakin', O. N. Krasavtseva', and А. V. Kolesnikov'2
'Institute of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Moscow Region, Russia; 2Lubychany Institute of Immunological Engineering, Lubychany, Moscow Region, Russia
The spread of the New Delhi metallo-beta-lactamase (NDM-1), a plasmid-borne enzyme conferring bacterial resistance to any known beta-lactam antibiotics, represents the global health threat. There is an
urgent need to develop the efficient NDM-1 inhibitors of various mode of action thereby necessitating structural studies of the enzyme as well as analysis of the secretion pathway and localization of the protein. The recombinant full-length NDM-1 is produced in E.coli in the inactive form and is mostly accumulated in the inclusion bodies. The secreted recombinant NDM-1 forms are several N-terminally truncated species. The robust expression system capable of high-level production of the
full-length NDM-1 and derivatives thereof is required to obtain NDM-1 in the quantities necessary for drug discovery, diagnostics, and research purposes. Therefore, we developed a new system that utilizes antibiotic pressure to select E. coli producing increased quantity of soluble NDM-1 and showed that an increase in the NDM-1 solubility occurs in the bacterial clones producing increased amounts in the chaperones. Key words: chaperone activity, E.coli
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.841.94:579.25].083.3
А.Ю. Медкова, Л.Н. Синяшина, Ю.П. Румянцева, О.Л. Воронина, М.С. Кунда, Г.И. Каратаев накопление авирулентных инсерционных ВVG мутантов bordetella
pertussis при экспериментальной инфекции лабораторных мышей
ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, Москва, Россия
Изучены длительность персистенции возбудителя коклюша и динамика накопления авирулентных инсерционных Вvg- мутантов Bordetella pertussis в легких лабораторных мышей после их интраназального и внутривенного инфицирования вирулентными бактериями. Установлено, что бактерии возбудителя коклюша способны к длительной персистенции в организме лабораторных мышей. ПЦР в режиме реального времени в легких мышей выявляет сотни геном эквивалентов ДНК B.pertussis, независимо от способа введения бактерий, спустя 2 мес после инфекции, тогда как время идентификации бактерий с помощью посева на селективную питательную среду ограничено 28 днями. С течением времени происходит накопление Вvg- мутантов B.pertussis, доля которых через 7—9 нед достигает 50% от общего числа бактерий в популяции. Полученный результат показывает возможность использования лабораторных мышей для изучения динамики накопления инсерционных мутантов B.pertussis in vivo и подтверждает предположение о накоплении инсерци-онных авирулентных мутантов в процессе развития коклюшной инфекции у людей.
Ключевые слова: коклюш, персистенция, инсерционные мутанты, вирулентность
Коклюш — респираторное инфекционное антро-понозное заболевание, вызываемое грамотрицатель-ными бактериями B.pertussis, характеризующееся приступообразным судорожным кашлем и высокой летальностью у детей раннего возраста. Несмотря на продолжительную массовую вакцинацию, проводимую в разных странах с начала 50-х годов прошлого столетия, элиминации возбудителя в популяции не происходит. Ежегодно в мире регистрируется до 50 млн случаев заболевания коклюшем, из которых около 300 тыс. приводят к летальному исходу [7]. В последние годы отмечается значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев заболевания коклюшем среди подростков и взрослых [20]. Недостаточно высокое качество ранней диагностики коклюша приводит к тому, что коклюш, протекающий в атипичных формах, часто смешанных с другими респираторными бактериальными или вирусными инфекциями, не диагностируется [2, 3]. Выявлены случаи бессимптомного носительства B. pertussis [20]. Взрослые и подростки, в том числе, и "практически здоровые", являются важным резервуаром возбудителя коклюша и источником инфекции для восприимчивых детей младшего возраста и неиммунизированных детей старшего возраста [9, 16, 19]. До 85% младенцев заражаются от членов семьи [20], при этом около 90% — от бессимптомных носителей инфекции [16].
Современные противоэпидемические мероприятия предполагают изоляцию больных коклюшем для
разрыва цепи передачи возбудителя. Однако неясно, как долго больной и тем более "практически здоровый" человек, у которого обнаружены бактерии B.pertussis, является носителем инфекции и способен выделять возбудитель. По данным ряда исследований, бактерии возбудителя присутствуют в носоглотке от 3 до 7 нед после установления диагноза "коклюш" и начала лечения [8, 10]. Длительность бактерионосительства "практически здоровыми" людьми, находившимися в контакте с больными коклюшем, не изучалась. В опубликованных нами работах представлены результаты анализа бактерий B.pertussis, обнаруженных у больных с типичными и атипичными формами коклюша, а также у "практически здоровых" людей. Показано, что исследованные популяции бактерий B.pertussis гетерогенны по фазовому составу и содержат разное число авирулентных бактерий, несущих инсерции Ш481 или ^1002 в специфическом сайте оперона вирулентности BvgAS, что предполагает возможность накопления инсерционных авирулентных мутантов в развитии инфекционного процесса [2, 3]. Значение таких мутантов для развития инфекционного процесса, переживания бактерий внутри эукариотических клеток, формирования бактерионосительства и передачи бактерий новому хозяину практически не изучено. Для экспериментальной проверки предполагаемого нами механизма формирования авирулентных, персистирующих в организме человека бактерий, в результате внедрения ^-элементов в оперон вирулентности необходим структурный анализ популяций бактерий B.pertussis у многочисленной группы больных на разных стадиях заболевания и у "практически здоровых" людей. Проведение таких исследований требует диспансерного наблюдения и соответствующего финансирования. В качестве первого приближения для решения поставленной задачи могут быть использованы лабораторные животные. В настоящей работе представлены результаты изучения динамики изменения фазового состава популяции бактерий B.pertussis при экспериментальном заражении лабораторных мышей. Несмотря на то что мыши не болеют коклюшем и не являются адекватной для человека экспериментальной моделью, на сегодняшний день "мышиная модель" используется для изучения некоторых характеристик инфекционного процесса и оценки качества коклюшных вакцин [21]. Важным преимуществом лабораторных мышей является воз-
