CC BY
477
УДК 579.8: [615.33+615.322] DOI: 10.21626/vestnik/2018-1/12
АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РАСТИТЕЛЬНЫХ ЭКСТРАКТОВ И ИХ КОМБИНАЦИЙ С АНТИБИОТИКАМИ В ОТНОШЕНИИ ЭКСТРЕМАЛЬНО-АНТИБИОТИКОРЕЗИСТЕНТНЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ
© Тапальский Д.В.1, Тапальский Ф.Д.2
1 Гомельский государственный медицинский университет, Гомель, Беларусь
2 Витебский государственный медицинский университет, Витебск, Беларусь
E-mail: [email protected]
Определены минимальные подавляющие концентрации (МПК) водных настоев 17 официнальных лекарственных растений в отношении антибиотикочувствительных экстремально -антибиотикорезистентных изолятов Pseudomonas aeruginosa и Acinetobacter baumannii. Обнаружена выраженная антибактериальная активность (МПК < 1 мг/мл) водных экстрактов брусники (Vaccinium vitis-idaea), эвкалипта (Eucalyptus viminalis), дуба (Quercus robur), толокнянки (Arctostaphylos uva-ursi). При сочетанном воздействии на микробную клетку водные растительные экстракты не оказывали значимого влияния на антибактериальную активность аминогликозидов, карбапенемов и фторхинолонов. Выявлен универсальный дозозависимый антагонистический эффект растительных экстрактов на микробиологическую эффективность колистина в отношении A. baumannii и P. aeruginosa. Выявлен синергидный антибактериальный эффект (ЕФПК 0,25-0,50) комбинации водного экстракта эвкалипта и цефтазидима в отношении 29,2% экстремально-антибиотикорезистентных штаммов A. baumannii, продуцирующих OXA-карбапенемазы.
Ключевые слова: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, лекарственные растения, антибиотики, антибактериальная активность, синергизм.
ANTIBACTERIAL EFFECTS OF HERBAL EXTRACTS AND THEIR COMBINATIONS WITH ANTIBIOTICS IN RELATION TO EXTENSIVELY ANTIBIOTIC-RESISTANT MICROORGANISMS
Tapalski D.V.1, Tapalski F.D.2
1 Gomel State Medical University, Gomel, Belarus; 2 Vitebsk State Medical University, Vitebsk, Belarus
Minimal inhibitory concentrations (MICs) of 17 officinal aqueous medicinal herbal extracts in regard to antibiotic-sensitive and extensively antibiotic-resistant P. aeruginosa and A. baumannii isolates were determined. The expressed antibacterial activity (MIC < 1 mg/mL) was found for aqueous cowberry (Vaccinium vitis-idaea), eucalyptus (Eucalyptus viminalis), oak (Quercus robur), and bearberry (Arctostaphylos uva-ursi) extracts. Aqueous herbal extracts did not influence significantly the antibacterial activity of aminoglycosides, carbapenems and fluoroquinolones during their combined action on a microbial cell. A universal dose-dependent antagonistic effect of herbal extracts on the colistin microbiological efficacy in relation to A. baumannii and P. aeruginosa was revealed. A synergistic antibacterial effect (EFIC 0.25-0.50) of the combination of aqueous eucalyptus extract with the ceftazidime against 29.2% of OXA-carbapenemase producing A. baumannii strains was detected.
Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, medicinal herbs, antibiotics, antibacterial activity, syn-ergism.
P. aeruginosa и A. baumannii относятся к наиболее частым возбудителям инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи. Важной особенностью этих микроорганизмов является способность к быстрому формированию устойчивости к большинству антимикробных препаратов (АМП) [1, 3] с формированием состояния экстремальной антибиотикорезистентности (XDR -extensively drug resistance, нечувствительность по крайне мере к одному АМП во всех категориях АМП, за исключением 1-2 категорий) и панрези-стентности (PDR - pandrug resistance, нечувствительность ко всем АМП во всех категориях) [11]. Важной причиной развития XDR является продукция карбапенемаз (карбапенемазы ОХА-23, ОХА-40, ОХА-56 у A. baumannii, металло-ß-лактамазы VIM и IMP у P. aeruginosa). Продукция карбапенемаз как правило, ассоциирована с
устойчивостью к большинству не ß-лактамных АМП, за исключением полимиксинов [2].
Ведется поиск и изучение свойств антибактериальных веществ растительного происхождения, активных в отношении антибиотикорезистентных бактерий, особенно в странах с развитой традиционной медициной [4]. Разработана методология скрининга растительного лекарственного сырья на присутствие микробиологически активных соединений [6]. Изучается возможность использования фитотерапии для лечения инфекций, вызванных XDR-патогенами [7, 16]. Показана бактерицидная активность ряда растительных экстрактов в отношении штаммов P. aeruginosa и A. baumannii с множественной устойчивостью к АМП [5, 9, 12]. Одним из перспективных направлений является изучение фармакодинамических взаимодействий вторичных метаболитов расте-
ний с антибактериальной активностью и АМП. Описан ряд сочетаний растительных экстрактов и АМП, оказывающих синергидный (взаимно усиливающий) эффект при совместном воздействии на бактериальную клетку [5, 14].
Цель работы - оценить антибактериальную активность официнальных лекарственных растений в отношении XDR грамотрицательных бактерий и выявить комбинации АМП и растительных экстрактов, обладающих синергидной активностью.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследование включено 17 наименований официнальных лекарственных растений в виде сухого измельченного растительного сырья, приобретенных в аптечной сети (таблица 1).
Для приготовления настоев к 10 г растительного сырья добавляли 100 мл дистиллированной воды, флаконы кипятили на водяной бане в течение 10 мин и охлаждали 45 мин при комнатной температуре. Настои фильтровали через марлевый и бумажный фильтры, затем проводили стерилизующую фильтрацию с помощью фильтров Filtropur S 0,45 (Sarstedt, Германия). До выполнения микробиологических исследований настои хранили при 6°С не более 24 ч. Для определения суммарной концентрации растворенных веществ в полученных настоях проводили выпаривание 10 мл настоя в течение 12 ч при 44°С с последующим взвешиванием полученного сухого водного экстракта на аналитических весах.
В исследование включены контрольные
Образцы растительного сы
штаммы микроорганизмов Escherichia coli ATCC 25922 и P. aeruginosa ATCC 27853, а также 2 ан-тибиотикочувствительных и 32 XDR изолята P. aeruginosa и A. baumannii.
Определение минимальных подавляющих концентраций (МПК) и минимальных бактерицидных концентраций (МБК) водных растительных экстрактов проводили методом последовательных микроразведений в бульоне Мюллера-Хинтона. Готовили 11 -серийных двукратные разведения в лунках 96-луночных планшетов и вносили стандартизованные по оптической плотности суспензии тестируемых бактериальных культур (конечная концентрация 106 клеток/мл). Планшеты закрывали крышками, помещали в герметичные полиэтиленовые пакеты и инкубировали 18 ч - 35°С с постоянным орбитальным встряхиванием 90 об/мин (шейкер-инкубатор ES-20, Biosan, Латвия).
Учет МПК выполняли визуально по отсутствию видимого роста микроорганизмов. Для определения МБК делали высев 10 мкл из каждой лунки на сектор плотной питательной среды (ГРМ-агар), чашки инкубировали в течение 16-18 ч при 35°С и оценивали рост на плотной среде. Минимальную концентрацию водного экстракта, подавляющую бактериальный рост на 99,9% (отсутствие роста или рост не более 1 колонии микроорганизмов в секторе), указывали как МБК.
Для растительных экстрактов с выраженной антибактериальной активностью (МПК <1 мг/мл [17]) оценивали эффективность сочетанного воздействия в комбинациях с АМП на XDR штаммы
Таблица 1
:, включенные в исследование
№ п/п Видовое название Часть растения Производитель
1 Багульник болотный (Ledum palustre) побеги ООО «Падис'с», Беларусь
2 Береза белая (Betula alba) почки ООО «НПК Биотест», Беларусь
3 Брусника обыкновенная (Vaccinium vitis-idaea) листья ЗАО «БелАсептика», Беларусь
4 Дуб обыкновенный (Quercus robur) кора ООО «НПК Биотест», Беларусь
5 Душица обыкновенная (Origanum vulgare) трава ООО «Калина», Беларусь
6 Зверобой продырявленный (Hypericum perforatum) трава ООО «НПК Биотест», Беларусь
7 Календула лекарственная (Calendula officinalis) цветки ООО «Калина», Беларусь
8 Можжевельник обыкновенный (Juniperus communis) плоды ООО «НПК Биотест», Беларусь
9 Мята перечная (Mentha piperita) листья ООО «НПК Биотест», Беларусь
10 Подорожник большой (Plantago major) листья ООО «НПК Биотест», Беларусь
11 Ромашка аптечная (Chamomilla recutita) цветки ООО «НПК Биотест», Беларусь
12 Толокнянка обыкновенная (Arctostaphylos uva-ursi) листья ООО «НПК Биотест», Беларусь
13 Тысячелистник обыкновенный (Achillea millefolium) трава ООО «Падис'с», Беларусь
14 Хвощ полевой (Equisetum arvense) трава ООО «НПК Биотест», Беларусь
15 Чабрец (тимьян ползучий) (Thymus serpyllum) трава ООО «НПК Биотест», Беларусь
16 Шалфей лекарственный (Salvia officinalis) листья ООО «НПК Биотест», Беларусь
17 Эвкалипт прутовидный (Eucalyptus viminalis) листья ООО «Алтайфарм», Россия
A. baumannii и P. aeruginosa. В расплавленный и остуженный до 45°С агар Мюллера-Хинтона вносили растительные экстракты для обеспечения концентрации 1/4 от МПК и 1/8 от МПК. Полученные среды разливали в полистироловые чашки Петри. В качестве контроля использовали чашки с МХА без добавления растительных экстрактов. Опытные и контрольные чашки инокулировали бактериальными суспензиями (0,5 МакФарланд) и автоматическим диспенсером наносили по 8 дисков с АМП (BD Sensi-Disc Susceptibility Test Discs, Becton Dickinson, США): амикацин 30 мкг, тобрамицин 30 мкг, имипенем 10 мкг, меропенем 10 мкг, цефтазидим 30 мкг, ципрофлоксацин 5 мкг, тигециклин 15 мкг, колистин 10 мкг.
После инкубации 18 ч при 35°С измеряли диаметры зон подавления роста вокруг дисков, сравнивали диаметры на опытных и контрольных чашках. При уменьшении диаметра зоны подавления роста вокруг диска с АМП в присутствии растительного экстракта на 3 мм и более по сравнению с контролем эффект взаимодействия считали антагонистическим, при увеличении на 3 мм и более - синергидным.
Для более точной количественной оценки выявленной синергидной активности проведено определение фракционных подавляющих концентраций (ФПК) АМП в присутствии растительного экстракта методом «шахматной доски» [18] в диапазоне концентраций от 1/16*МПК до 4*МПК. Заданные концентрации АМП и растительного экстракта готовились в бульоне Мюлле-ра-Хинтона и в объеме 100 мкл вносились в 64 ячейки (8х8) стерильного полистиролового 96-луночного планшета (общий объем среды в каждой ячейке - 200 мкл), после чего планшет инокулировали суспензией исследуемой культуры (конечная концентрация микробных клеток ~ 5*105 клеток/мл) и инкубировали в течение 18 часов при 35°С в шейкере-инкубаторе с непрерывным низкоамплитудным встряхиванием. Учет результатов проводили по сравнению с контролем (рост в ячейке со средой, не содержащей АМП). Рассчитывали ФПК для АМП и растительного экстракта в комбинации:
ФПКа = МПКаэ / МПКа ФПКЭ = МПКэа / МПКЭ,
где МПКаэ - МПК АМП в присутствии растительного экстракта, МПКА - МПК АМП без добавления растительного экстракта, МПКэа -МПК растительного экстракта в присутствии АМП, МПКЭ - МПК растительного экстракта без добавления АМП.
Индекс ФПК рассчитывался как сумму ФПК: ЕФПК = ФПКа + ФПКв
При ЕФПК < 0,5 эффект комбинации оценивался как синергидный, при 0,5 < ЕФПК <1 - как
аддитивный, при 1 < ЕФПК < 4 - как нейтральный.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выраженная антибактериальная активность (МПК <1 мг/мл) в отношении как XDR, так и ан-тибиотикочувствительных изолятов P. aeruginosa и A. baumannii выявлена для водного экстракта брусники обыкновенной (МПК 0,35-0,78 мг/мл). Экстракты эвкалипта прутовидного и дуба обыкновенного проявляли выраженную антибактериальную активность в отношении клинических XDR изолятов P. aeruginosa (МПК 0,630,75 мг/мл). Водный экстракт толокнянки обыкновенной подавлял рост всех включенных в исследование изолятов A. baumannii (МПК 0,380,78 мг/мл). Экстракты брусники обыкновенной, эвкалипта прутовидного, дуба обыкновенного, толокнянки обыкновенной также оказывали выраженное антибактериальное действие на контрольную культуру E. coli ATCC 25922 (МПК 0,38-0,75 мг/мл). Для остальных экстрактов отмечена меньшая выраженность антибактериальных свойств (МПК >1 мг/мл). Минимальные бактерицидные концентрации для большинства растительных экстрактов были равны МПК или отличались от нее не более чем на одно разведение.
Исследование сочетанного воздействия в комбинациях с АМП выполнено для 4 растительных экстрактов с выявленной высокой антибактериальной активностью (экстракты брусники обыкновенной, эвкалипта прутовидного, дуба обыкновенного, толокнянки обыкновенной). Данные экстракты в концентрациях 1/4 и 1/8 от МПК не оказывали значимого влияния на активность аминогликозидов (амикацин, тобрамицин), кар-бапенемов (имипенем, меропенем) и фторхино-лонов (ципрофлоксацин). Все водные экстракты оказывали универсальный антагонистический эффект на антибактериальную активность коли-стина в отношении всех штаммов P. aeruginosa и A. baumannii, что может объясняться ограничениями диско-диффузионного метода. Большая молекулярная масса полимиксинов (969 для коли-стина) затрудняет диффузию АМП в питательной среде. Компоненты растительных экстрактов могут оказывать модифицирующее воздействие на структуру входящего в состав среды агар-агара и замедлять диффузию колистина.
В отношении XDR штаммов A. baumannii БА-026 и A. baumannii БА-032 выявлен синергидный эффект комбинации цефтазидима и водных растительных экстрактов, наиболее выраженный для водного экстракта эвкалипта прутовидного (таблица 2).
Таблица 2
Эффекты сочетанного воздействия экстракта эвкалипта прутовидного и цефтазидима на микроорганизмы
Диаметр зоны подавления роста, мм Эффект взаимодействия
1/4 МПК 1/8 МПК контроль
A. baumannii БА-026 16 13 9 С
A. baumannii БА-032 17 15 10 С
P. aeruginosa БП-056 23 25 25 Н
P. aeruginosa БП-074 25 30 27 Н
P. aeruginosa ATCC 27853 30 30 30 Н
Примечание: Н - нейтральный эффект, С - синергидный эффект.
Таблица 3
Эффекты сочетанного воздействия экстракта эвкалипта прутовидного и цефтазидима на XDR клинические изоляты A. baumannii
№ п/п Микроорганизм Лаб. № Карба-пенемаза Цефтазидим, диаметр зон подавления роста (мм) Характер взаимодействия ЕФПК
эвкалипт, 1/8 МПК контроль
1 A. baumannii БА-005 OXA-40 8 6 Н
2 A. baumannii БА-006 OXA-40 26 22 Н
3 A. baumannii БА-007 OXA-40 14 11 С 0,50
4 A. baumannii БА-011 OXA-40 6 6 Н
5 A. baumannii БА-012 OXA-40 6 6 Н
6 A. baumannii БА-026 OXA-40 12 6 С 0,25
7 A. baumannii БА-029 OXA-40 6 6 Н
8 A. baumannii БА-032 OXA-40 14 7 С 0,38
9 A. baumannii А-010 OXA-40 14 10 С 0,5
10 A. baumannii А-019 OXA-40 6 6 Н
11 A. baumannii А-034 OXA-23 + OXA-40 10 9 Н
12 A. baumannii А-036 OXA-23 + OXA-40 12 8 С 0,5
13 A. baumannii А-041 OXA-23 15 12 С 0,75
14 A. baumannii А-042 OXA-40 6 6 Н
15 A. baumannii А-047 OXA-23 6 6 Н
16 A. baumannii А-049 OXA-40 6 6 Н
17 A. baumannii А-050 OXA-40 6 6 Н
18 A. baumannii А-053 OXA-40 6 6 Н
19 A. baumannii А-054 OXA-40 12 9 С 0,75
20 A. baumannii А-057 OXA-40 6 6 Н
21 A. baumannii А-059 OXA-40 13 8 С 0,50
22 A. baumannii А-065 OXA-40 14 7 С 0,38
23 A. baumannii А-075 OXA-40 6 6 Н
24 A. baumannii А-076 OXA-40 6 6 Н
Примечание: Н - нейтральный эффект, С - синергидный эффект.
Для более детальной оценки эффективности синергидного взаимодействия водного настоя эвкалипта и цефтазидима из рабочей коллекции отобрано 24 штамма A. baumannii, устойчивых к большинству Р-лактамных АПМ, включая кар-бапенемы. Все отобранные штаммы являлись
продуцентами ОХА-карбапенемаз (таблица 3). Синергидный эффект был выявлен для 9 из 24 штаммов (37,5%), при этом для 7 из них (29,2%) он подтвержден методом «шахматной доски» (ЕФПК 0,25-0,50).
Выявлен синергидный антибактериальный эффект (ЕФПК 0,25-0,50) комбинации водного экстракта из эвкалипта прутовидного и цефтази-дима в отношении 29,2% XDR штаммов A. baumannii, продуцирующих OXA-карба-пенемазы. Отсутствие аналогичного влияния на активность карбапенемов позволяет предположить, что механизм обнаруженного эффекта не связан с блокированием ферментативной активности карбапенемаз, а вызван, скорее, восстановлением проницаемости клеточной стенки для АМП или блокированием эффлюксных систем в результате воздействия отдельных компонентов растительного экстракта.
В доступной литературе имеются многочисленные указания на выраженную антибактериальную активность экстрактов и эфирных масел, получаемых из листьев эвкалиптов различных видов [15]. В работе F.M. Reda выявлен синер-гидный антибактериальный эффект метанолового экстракта из листьев E. camaldulensis в сочетании с гентамицином или цефтриаксоном в отношении штаммов S. aureus и P. aeruginosa, антибактериальная активность в отношении A. baumannii авторами не исследовалась [14]. Заслуживает внимания выраженная бактерицидная активность дербенника иволистного (Lythrum salicaria) в отношении A. baumannii и P. aeruginosa, выявленная в работе E. Guclu [8]. Предложено использование экстрактов из L. salicaria для местной антисептической терапии при инфекциях кожи и мягких тканей, инфекций ожоговых ран, диабетической стопы, вызванных MDR и XDR грамотрица-тельными возбудителями. Известно, что L. salicaria широко используется в традиционной медицине еще с античных времен, в том числе перорально в виде настоев и отваров, например для лечения диареи, а также местно для лечения трофических язв и инфекционных поражений кожи [10].
В работе Y. Miyasaki скрининг антибактериальной активности 60 различных растений, выполненный методом микроразведений в бульоне, позволил выявить несколько экстрактов, высокоактивных в отношении MDR штаммов A. baumannii, в том числе экстракты харитаки (Terminalia chebula), шиповника морщинистого (Rosa rugosa) и шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis) [12]. В дальнейшем при хроматографическом разделении веществ, входящих в состав растительных экстрактов, и определении антибактериальной активности каждой из фракций был выделен и идентифицирован норвогонин, МПК и МБК которого для клинически значимых XDR штаммов A. baumannii составили соответственно 0,128 мг/мл и 0,256 мг/мл. Норвогонин выделен из экстракта шлемника бай-
кальского - растения, используемого в традиционной медицине, в том числе в качестве местного антисептика [13]. Однако при изучении сочетан-ного воздействия норвогонина совместно с синтетическими АМП различных классов не обнаружено ни одной комбинации с синергидной антибактериальной активностью на антибиотикорези-стентные штаммы A. baumannii.
Определенные в настоящем исследовании МПК водных экстрактов из нескольких растений Беларуси сопоставимы с МПК норвоганина для A. baumannii (0,128 мг/мл) [13], хотя и превышают ее в 3-6 раз. Так, МПК экстракта брусники обыкновенной и толокнянки обыкновенной составили для карбапенемаза-продуцирующих штаммов A. baumannii 0,35-0,78 мг/мл. Поскольку полученные экстракты представляют собой совокупность различных веществ, выделение из их состава вторичных метаболитов, обусловливающих антибактериальную активность, позволит получить антисептические препараты с более низкими значениями МПК для A. baumannii и других XDR грамотрицательных микроорганизмов.
Таким образом, МПК водных растительных экстрактов значительно (в десятки и сотни раз) превышают МПК АМП для антибиотикочувстви-тельных штаммов. Однако в случае инфекций, вызванных XDR микроорганизмами с высокими значениями МПК АМП, можно рассматривать возможность проведения фитотерапии в качестве дополнения к проводимой системной антибиоти-котерапии. При сочетанном воздействии на микробную клетку водные растительные экстракты не оказывают значимого влияния на антибактериальную активность аминогликозидов, карбапе-немов и фторхинолонов. Только для комбинации водного экстракта эвкалипта прутовидного и це-фтазидима выявлен синергидный антибактериальный эффект в отношении некоторых XDR штаммов A. baumannii, продуцирующих OXA-карбапенемазы.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Сухорукова М.В., Эйдельштейн М.В., Склеено-ва Е.Ю., Иванчик Н.В., Шек Е.А., Дехнич А.В., Козлов Р.С., исследовательская группа «МАРАФОН». Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Acinetobacter spp. в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013-2014 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2017. - Т. 19, № 1. - С. 42-48. [Sukho-rukova M.V., Edelstein M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Shek E.A., Dekhnich A.V., Kozlov R.S., «MARATHON» study group. Antimicrobial resistance of nosocomial Acinetobacter spp. isolates in Russia: results of multicenter epidemiological study «MAR-
ATHON» 2013-2014. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2017; 19 (1): 42-48. (in Russ.)].
2. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Карбапенемазы грамотрицательных бактерий: распространение и методы детекции // Медицинский журнал. - 2012. - № 2. - С. 10-15. [Tapal-ski D.V., Osipov V.A., Zhavoronok S.V. Carbapenema-ses of gram-negative pathogens: spread and methods of detection. Meditsinskiy zhurnal. 2012; (2): 10-15. (in Russ.)].
3. Эйдельштейн М.В., Сухорукова М.В., Склеено-ва Е.Ю., Иванчик Н.В., Микотина А.В., Шек Е.А. Дехнич А.В., Азизов И.С., Козлов Р.С. Антибиоти-корезистентность нозокомиальных штаммов Pseudomonas aeruginosa в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013-2014 // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2017. - Т. 19, № 1. - С. 37-41. [Edel-steinM.V., Sukhorukova M.V., Skleenova E.Yu., Ivan-chik N.V., Mikotina A.V., Sheck E.A., Dekhnich A.V., Azizov I.S., Kozlov R.S. «MARATHON» study group. Antimicrobial resistance of nosocomial Pseudomonas aeruginosa isolates in Russia: results of multicenter epidemiological study «MARATHON» 2013-2014. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2017; 19 (1): 37-41 (in Russ.)].
4. Abdallah E.M. Plants: an alternative source for antimicrobials // Journal of Applied Pharmaceutical Science. - 2011. - Vol. 1, N 6. - P. 16-20.
5. Adwan G., Abu-Shanab B., Adwan K. Antibacterial activities of some plant extracts alone and in combination with different antimicrobials against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa strains // Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. - 2010. - Vol. 3, N 4. - P. 266-269. - DOI: 10.1016/S1995-7645(10)60064-8.
6. Das K., Tiwari R.K.S., Shrivastava D.K. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: current methods and future trends // Journal of Medicinal Plants Research. - 2010. -Vol. 4, N 2 - P. 104-111. - DOI: 10.5897/JMPR09.03.
7. Djeussi D.E., Noumedem J.A., Seukep J.A., Fankam A.G., Voukeng I.K., Tankeo S.B., Nkuete A.H., Kuete V. Antibacterial activities of selected edible plants extracts against multidrug-resistant Gramnegative bacteria // BMC Complementary and Alternative Medicine. - 2013. - Vol. 13. - P. 164. - DOI: 10.1186/1472-6882-13-164.
8. Guclu E., Genc H., Zengin M., Karabay O. Antibacterial activity of Lythrum salicaria against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa // Annual Research and Review in Biology - 2014. - Vol. 4, N 7. - P. 1099-1105. - DOI: 10.9734/ARRB/2014/7357.
9. Heidary M., Hashemi A., Goudarzi H., Khoshnood S., Roshani M., Azimi H., Goudarzi M. The antibacterial activity of Iranian plants extracts against metallo beta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa
strains // Journal of Paramedical Sciences. - 2016. -Vol 7, N 1. - P. 13-19. - DOI: 10.22037/jps.v7i1.11203.
10. Humadi S.S., Istudor V. Lythrum salicaria (purple loosestrife). Medicinal use, extraction and identification of its total phenolic compounds // FARMACIA. -2009. - Vol. 57, N 2. - P. 192-200.
11. Magiorakos A.P., Srinivasan A., Carey R.B., Car-meli Y., Falagas M.E., Giske C.G., Harbarth S., Hin-dler J.F., Kahlmeter G., Olsson-Liljequist B., Pater-son D.L., Rice L.B., Stelling J., Struelens M.J., Vato-poulos A., Weber J.T., Monnet D.L. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance // Clinical Microbiology and Infection. - 2012. -Vol. 18, N 3. - P. 268-281. - DOI: 10.1111/j.1469-0691.2011.03570.x.
12. Miyasaki Y., Nichols W.S., Morgan M.A., Kwan J.A., Van Benschoten M.M., Kittell P.E., Hardy W.D. Screening of herbal extracts against multi-drug resistant Acinetobacter baumannii // Phytotherapy Research. - 2010. - Vol. 24, N 8. - P. 1202-1206. -DOI: 10.1002/ptr.3113.
13. Miyasaki Y., Rabenstein J.D., Rhea J., Crouch M.-L., Mocek U.M., Kittell P.E., Morgan M.A., Nichols W.S., Van Benschoten M. M., Hardy W.D., Liu G.Y. Isolation and characterization of antimicrobial compounds in plant extracts against multidrug-resistant Acineto-bacter baumannii // PLoS One. - 2013. - Vol. 8, N 4. - Art. e61594. - DOI: 10.1371/journal.pone.0061594.
14. Reda F.M., El-Zawahry Y.A., Omar A.R. Synergistic effect of combined antibiotic and methanol extract of Eucalyptus camaldulensis leaf against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa // International Journal of Applied Sciences and Biotechnology. -2017. - Vol 5, N 4. - P. 486-497. - DOI: 10.3126/ijasbt.v5i4.18620.
15. Sebei K., Sakouhi F., Herchi W., Khouja M.L., Bou-khchina S. Chemical composition and antibacterial activities of seven Eucalyptus species essential oils leaves // Biological Research. - 2015. - Vol. 48, N 1. - P. 7. - DOI: 10.1186/0717-6287-48-7.
16. Srivastava J., Chandra H., Nautiya A.R., Kalra S.J.S. Antimicrobial resistance and plant-derived antimicrobials as an alternative drug line to control infections // 3 Biotech. - 2014. - Vol. 4, N 5 - P. 451-460. - DOI: 10.1007/s13205-013-0180-y.
17. Tegos G., Stermitz F.R., Lomovskaya O., Lewis K. Multidrug pump inhibitors uncover remarkable activity of plant antimicrobials // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2002. - Vol. 46, N 10. -P. 3133-3141. - DOI: 10.1128/AAC.46.10.3133-3141.2002.
18. White R.L., Burgess D.S., Manduru M., Bosso J.A. Comparison of three different in vitro methods of detecting synergy: time-kill, checkerboard, and E test // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1996. -Vol. 40, N 8. - P. 1914-1918.
