Антиастматическая активность новых соединений в ряду металлокомплексов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 615.234:546.3

АНТИАСТМАТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ В РЯДУ МЕТАЛЛОКОМПЛЕКСОВ

© 2006 г. И. А. Крылов, *В. Л. Ковалева, *Л. Н. Сернов,

**Э. А. Парфенов

Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск *Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ,

**НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, г. Москва

Проведен целенаправленный поиск новых биологически активных соединений в ряду комплексов переходных металлов (титан, ванадий, кобальт и медь) с кислород-и азотсодержащими хелатирующи-ми лигандами в рамках разработки эффективных и безопасных средств коррекции синдрома бронхиальной обструкции, сочетающих в себе как минимум два вида фармакологической активности — бронхолитическую и противовоспалительную. Показано, что в ряду новых оригинальных металлокомплексных соединений имеются высокоэффективные в отношении профилактики и устранения бронхоспазма вещества с улучшенным токсикологическим профилем, что служит предпосылкой для разработки на их основе средств, корригирующих эндоэкологический дисбаланс бронхопульмональной системы организма.

Ключевые слова: металлокомплек-сы, средства сочетанной бронхоли-тической и противовоспалительной направленности действия.

Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) являются одними из наиболее часто встречающихся заболеваний человека. Современные эколого-социальные проблемы (табакокурение, промышленные поллютанты, загрязнение окружающей среды, значительный рост популяции, сенсибилизированной к аллергенам внешней среды, жилых помещений; новорожденные с низкой массой тела, ранние и повторяющиеся инфекционные заболевания детей) имеют прямое отношение к росту заболеваемости БА и ХОБЛ. Арсенал современных антиастматических средств довольно широк. В него входят как традиционные бронхолитические препараты (стимуляторы адренорецепторов, М-холиноблокаторы, спазмолитики миотропного типа действия) и противовоспалительные средства (глюкокортикостероиды, стабилизаторы мембран тучных клеток, антилейкотриеновые средства), так и вновь появляющиеся соединения, предложенные для клинического изучения (ингибиторы фосфодиэстеразы 4 типа, ингибиторы р-38 митогенактивирующей протеинкиназы и нуклеарный фактор каппа-В) [4, 5]. Несмотря на значительные достижения в терапии этой патологии и понимании механизмов развития болезни, течение БА и ХОБЛ у пациентов не всегда контролируется адекватно [6]. С учетом современной концепции патогенеза БА и ХОБЛ особенно актуальным и практически необходимым представляется поиск принципиально новых эффективных средств, сочетающих в себе как минимум два вида активности — бронхолитическую и противовоспалительную.

В последние годы повышенный интерес у биологов и фармакологов вызывает класс металлокомплексных соединений. Они интересны с позиций новой концепции металло-лигандного гомеостаза, согласно которой взаимодействие между эндогенными лигандами и металлами, входящими в активный центр многих ключевых ферментов, определяет нормальное функционирование биологических систем [2]. Нарушение этого взаимодействия приводит к развитию различных видов системной патологии. В ранних работах [1, 3] проведено экспериментальное изучение некоторых комплексных соединений металлов переходной группы (медь, цинк, марганец, кобальт) на основе кумариновых и родственных лигандов, показавших значимые бронхолитические и противовоспалительные свойства. Однако, по данным токсикологических тестов, многие из них проявили высокую токсичность, что побудило к исследованию новых оригинальных представителей класса металло-комплексов, имеющих в составе иные комплексообразователи (титан) и лигацды ^-ацетил-Ь-цистеин, аскорбиновая кислота, эскулетин). Комплексные соединения ^ацетил-Ь-цистеина с биометаллами можно рассматривать как метаболиты по отношению и к металлу, и

к лиганду. Отсюда вероятность обнаружения фармакологического эффекта у комплексного соединения выше, чем у металла или лиганда, взятых порознь. Эти соображения легли в основу углубленного фармакологического изучения перспективного в плане создания новых лекарств класса химических соединений — металлокомплексов.

Расширенное фармакологическое изучение ме-таллокомплексов на предмет наличия сочетанной бронхорасширяющей и противовоспалительной активности, установление оптимальных способов их применения позволит по-новому оценить перспективы этого класса химических соединений в решении актуальной проблемы респираторной медицины — фармакологической коррекции брон-хообструктивной патологии.

Материалы и методы

В экспериментах были использованы морские свинки обоих полов массой 400 — 600 г, крысы-самцы Вистар массой 200—250 г, 500 неинбред-ных мышей-самцов массой 20—25 г. Основным объектом исследования явились новые химические соединения в ряду металлокомплексных соединений, содержащих металлы переходной группы (кобальт, титан, цинк, медь), синтезированных Э. А. Парфеновым. Общее количество изучаемых соединений — 40. Строение вновь синтезированных химических соединений (ХС) подтверждено элементным анализом и спектральными данными (ЯМР- и ИК-спектрами), индивидуальность — данными тонкослойной хроматографии. Тестирование новых соединений проводили в соответствии с требованиями по экспериментальному (доклиническому) изучению лекарственных средств на различных моделях бронхоспазма и воспаления: гистамин-, ацетилхолин-индуцированной контрактуре гладкомышечного препарата трахеи морской свинки, модели антиген-индуцированного бронхоспазма in vivo, каррагенинового отека лап крыс, модели сефа-декс-индуцированного бронхоальвеолита у крыс.

В качестве референтных препаратов использовали кромогликат натрия (Fisons), субстанцию будесонида (Пульмомед, Россия), теофиллин (KRKA), формо-терол, сальбутамола сульфат (Polfa), индометацин (Taicang Foreing Trade Corp., CHINA), ацетилци-стеин — АЦЦ.

Результаты и их обсуждение

На начальном этапе проведен скрининг новых металлокомплексных соединений на модели гистамин-индуцированной контрактуры гладких мышц изолированного препарата трахеи морской свинки in vitro по R. Blattner et al. (1980). Результаты экспериментов показали, что большинство исследуемых соединений обладают бронхорасширяющей активностью, выраженной в различной степени. Из всего ряда изучаемых металлокомплексов наибольшей активностью обладают вещества, содержащие в качестве лиганда

эскулетин: PQ 907, PQ 908, PQ 910, PQ 911, PQ 912, PQ 914, PQ 915, PQ 916 (табл. 1). В представленном ряду наиболее активны титансодержащие комплексы PQ 912, PQ 911: их внесение в среду инкубации в сопоставимых с препаратом сравнения (теофиллин) концентрациях эффективно и полно устраняет и предотвращает развитие гистамин-индуцированной контрактуры гладкомышечного препарата. Однако в сравнении с другим референтным препаратом — саль-бутамолом сульфатом — тестируемые соединения существенно уступали ему. Применение PQ 907, PQ 903 и PQ 910 оказалось эффективным лишь на гладкомышечном препарате трахеи иммунизированной морской свинки. Важно, что сами лиганды, в отличие от их комплексов, не эффективны на модели гистаминовой бронхоконстрикции in vitro. Так, внесение в среду инкубации N-ацетил-Ь-цистеина в концентрации 10-4 М/л приводило к торможению развития гистаминовой контрактуры гладкомышечного препарата лишь на (30,2 ± 8,1) %, с более значимым эффектом при превентивном внесении вещества — на (51,7 ± 21,4) %.

Таблица 1

Влияние металлокомплексных соединений на гистамин-индуцированную контрактуру гладкомышечного препарата трахеи интактной морской свинки in vitro (кумулятивный режим внесения ХС)

ХС (n=5) IC50 (М/л) ХС (n=5) IC50 (М/л)

PQ 911 >10-4 PQ 903 Н/э

PQ 582 3 x10-4 PQ 907 Н/э

PQ 915 >10-4 PQ 541 Н/э

PQ 807 >10-4 PQ 1247 Н/э

PQ 901 2 x10-4 PQ 920 Н/э

PQ 671 5 x10-5 PQ 590 Н/э

PQ 916 10-4 PQ 948 Н/э

PQ 912 8 x 10-4 PQ 460 Н/э

PQ 906 > 10-4 PQ 1213 Н/э

PQ 908 10-4 PQ 919 Н/э

PQ 910 2 x 10-4 Ацизол Н/э

PQ 917 10-4 Теофиллин 1 x 10-4

PQ 914 8 x 10-4

Сальбутамола сульфат 5 x 10-10 Формотерол 10-11

Ацетилхолин является значимым фактором бронхоконстрикции. В этой связи представляется целесообразным изучение бронхорасширяющей активности металлокомплексных соединений на модели ацетил-холин-индуцированной контрактуры гладких мышц изолированного препарата трахеи морской свинки in vitro. На данной модели наибольшая активность выявлена у соединений: PQ 907, PQ 914, PQ 915 и PQ 916. Характерной особенностью эффекта на данной модели для многих металлокомплексов явилось то, что в низких концентрациях (10-10—10-6 М/л) они не влияли на контрактильность гладких мышц, а в концентрации 10-5—10-4 М/л, как правило, быстро и полно устраняли контрактуру (табл. 2).

Таблица 2

Влияние металлокомплексных соединений на ацетилхолин-индуцированную контрактуру гладкомышечного препарата трахеи морской свинки in vitro (кумулятивный режим внесения ХС)

ХС (n=5) IC50 (М/л) ХС (n=5) IC50 (М/л)

PQ 907 8 x10-5 PQ 914 3 x10-6

PQ 906 >10-4 PQ 910 2 x10-4

PQ 908 8 x10-4 PQ 912 10-4

PQ 911 10-4 PQ 916 3 x 10-5

PQ 915 8 x 10-5 PQ 901 10-4

PQ 886 10-4 PQ 902 > 10-4

PQ 920 > 10-4 PQ 1213 > 10-4

Ацизол > 10-4 PQ 919 Н/э

PQ 903 Н/э PQ 948 Н/э

Сальбутамол 6 x 10-8 Теофиллин 1,0 x 10-4

В основе бронхообструктивного синдрома аллергического генеза лежит реакция гиперчувствительности немедленного типа. Ключевым механизмом данного процесса является взаимодействие аллергена с антиген-специфическим IgE на мембранах тучных клеток и базофилов, которые являются первичными эффекторными клетками. Поэтому при изучении бронхорасширяющих свойств металлокомплексов проведено исследование их действия на модели ан-тиген-индуцированной контрактуры гладких мышц трахеи активно иммунизированных морских свинок in vitro (реакция Шульца — Дейла). Наиболее эффективными на данной модели оказались соединения PQ 911, PQ 910, PQ 907 (IC50 10-8, 10-5, 10-4 М/л соответственно).

Дальнейшее исследование наиболее активных соединений проводилось на модели бронхоспазма in vivo, дающей представление об эффективности данных веществ в условиях экспериментальной патологии (бронхоспастическая реакция), обусловленной воздействием одного из ведущих медиаторов бронхоспазма — гистамина. Эксперименты проводили на морских свинках с аэрозольным введением гистамина (1 000 мкг/кг) с помощью небулайзера. Время экспозиции спазмогена определялось индивидуально — до достижения острой фазы на воздействие бронхоконстриктора. Оценочными критериями служили: продолжительность экспозиции, длительность острой и подострой фазы. На следующие сутки превентивно (за 1 час до повторного введения гистамина) животным вводили изучаемые соединения в виде 1,0 % водных растворов (небулизация), а также препарат сравнения формотерол (однократно, ингаляционно за 5 минут до введения спазмогена). Полученные данные отображены в табл. 3.

По степени выраженности рассматриваемого вида активности металлокомплексы располагаются в следующем ряду (по убыванию выраженности эффекта): PQ 911 > PQ 898 = PQ 897 > PQ 907 > PQ 902. Максимальная активность присуща соединениям, содержащим в качестве лиганда эскулетин, а комплексообразующего металла — титан (PQ 911). Замена

металла на кобальт и/или смена лиганда на ^аце-тил-Ь-цистеин (PQ 898, PQ 897, PQ 902, PQ 907) сопровождается некоторым снижением эффекта.

Таблица 3

Влияние металлокомплексных соединений (1,0 % водные растворы) и формотерола при их превентивном ингаляционном введении на бронхоспастическую реакцию у ненаркотизированных морских свинок, вызванную ингаляционным введением гистамина (М ± т)

До лечения После введения ХС

Веще- ство Экспо- зиция (сек.) Острая фаза (сек.) Под- острая фаза (сек.) Экспозиция (сек.) Острая фаза (сек.) Под- острая фаза (сек.)

PQ 902 263±30 174±20 286±30 227±25* 133±10 226±15

PQ 907 290±20 176±25 250±40 270±45* 126±15 180±40

PQ 911 270±50 140±40 210±30 260±20 105±15 135±25

PQ 898 260±55 180±20 245±45 250±50* 120±20 120±40

PQ 897 230±50 180±45 230±30 225±40* 115±25 130±30

Формо- терол 195±25 186,7±20 225±25 195±25 0 0

Примечание. * — гибель 16 % животных.

Не менее важным при исследовании новых брон-холитических средств является их тестирование на модели антиген-индуцированного бронхоспазма у активно сенсибилизированных ненаркотизированных морских свинок. Наиболее активные соединения (PQ 908, PQ 910, PQ 911) вводили ингаляционно при помощи небулайзера в различных дозах от 1 до 25 мг/кг. У морских свинок вызывали бронхоспазм аэрозольным воздействием овальбумина в дозе 2,5 мг/кг (в 1 мл 0,9 % раствора натрия хлорида) с помощью небулайзера. Время экспозиции для каждой свинки определялось индивидуально (до наступления острой фазы бронхоспастической реакции). Каждое вещество ингалировали в объеме 1 мл в течение 3 минут. Контрольной группе интактных животных при помощи небулайзера вводили ингаляционно 1 мл

0,9 % раствора натрия хлорида в течение 3 минут. В качестве референтного препарата использовали будесонид в дозе 30 мкг/кг.

В острой фазе протективный эффект ХС начинал проявляться при ингаляции вещества в дозе, равной 10 мг/кг (а в меньших дозах — 1 и 5 мг/кг

— эффект отсутствовал), и усиливался с увеличением дозы, т. е. являлся отчетливо дозозависимым. Максимальное торможение бронхоконстрикторной реакции (65—80 %) по отношению к контролю вызывала ингаляция ХС в дозе 25 мг/кг. Эффект PQ 908 был более выражен, чем эффект PQ 910 и PQ 911, что позволяет предположить участие в реализации протективного эффекта природного кумарина — эскулетина. По выраженности протек-тивного эффекта металлокомплексные соединения уступали будесониду, который проявлял эффект в низких дозах — 30—40 мкг/кг.

В связи с тем, что воспалительный процесс является основным звеном патогенеза при бронхиальной астме, краеугольным камнем модифика-

ции бронхиального тонуса становится коррекция флогистической реакции в стенке бронхов. В силу сказанного представляется важным выяснение возможного влияния изучаемых металлокомплексов на воспалительный компонент аллергической реакции. Поскольку обязательной составной частью флогог-енного процесса является экссудация, была выбрана традиционная экспериментальная модель острого воспаления — каррагениновый отек лап крыс, дающая представление о влиянии соединений на ЦОГ-опосредованную продукцию простагландинов. Тестируемые соединения вводились внутрижелудочно за 1 час до введения флогогена. Расчет доз исследуемых соединений производился эквивалентно средней дозе классического нестероидного противовоспалительного средства — индометацина (10 мг/кг).

По результатам исследования (табл. 4) все тестируемые соединения значительно тормозят развитие отека лап крыс при внутрижелудочном введении.

Таблица 4

Противовоспалительная активность металлокомплексов на

модели каррагенин-индуцированного отека лап крыс

ХС Торможение, % ХС Торможение, %

PQ 901 57,5 PQ 915 44,6

PQ 907 63,9 PQ 898 69,5

PQ 908 21,2 PQ 903 47,8

PQ 910 55,3 PQ 902 66,2

PQ 911 66,4 PQ 897 70,71

PQ 886 66,21 Индометацин 64,7

Наибольшая антиэкссудативная активность выявлена у соединений PQ 897, PQ 898, PQ 911, PQ 886 и PQ 902. Показатель торможения развития отека при их применении превысил таковой у индометацина. Широта терапевтической эффективности также оказалась выше по сравнению с референтным препаратом (например, при использовании PQ 911 и индометацина — 100 и 3,5 соответственно). Противовоспалительная активность исследуемых ХС, вероятно, связана с торможением простагландиновой фазы каррагенинового отека. Кроме того, указанное действие комплексных соединений может быть также объяснено их антиоксидантными свойствами.

Известно, что ^ацетил-Ь-цистеинсодержащие комплексы являются сильными антиоксидантами, поэтому представляло интерес изучить влияние исследуемых соединений на некоторые показатели антиокислительной системы организма у крыс Вис-тар в условиях модели сефадекс-индуцированного бронхоальвеолита. В качестве таких критериев были выбраны уровень супероксиддисмутазы, восстановленного глутатиона (Г^Н). О состоянии ПОЛ судили по уровню малонового диальдегида (МАД). Кроме того, использовали такой показатель функциональной активности нейтрофилов, как содержание в крови миелопероксидазы (МПО).

Результаты эксперимента представлены на рис. 1, 2. Металлокомплексы PQ 908 и PQ 910 и препарат сравнения АЦЦ нормализовали уровни Г^Н и МАД. Кроме того, они подавляли гиперпродукцию МПО нейтрофилами и увеличивали содержание су-пероксиддисмутазы (СОД). Эти результаты свидетельствуют о значительной антиоксидантной активности обоих PQ, проявляющейся на уровне референтного препарата. Следует отметить, что данный вид активности сильнее выражен у PQ 908, чем у PQ 910, что свидетельствует, по-видимому, о преимуществе эскулетина по сравнению с аминотиолами.

138,1

Ш

а"

2 100

£

<

118,1

86,4 82,7

37,9

13. 29,4 -±- 25,9

Г 1

МПО СОД Г-8И

□ контроль Исефадекс ПРО 908 ПРО 910 ЕПЗАТЩ

Рис. 1. Влияние металлокомплексов (Рр 908, Рр 910) на основные показатели антиоксидантной системы

0,35

0,25

I

2

ср

Шсефадекс

□Рр 908 □Рр 910 □АЦЦ

МАД

Рис. 2. Влияние металлокомплексов (Рр 908, Рр 910) на образование малонового диальдегида при сефадекс-индуцированном бронхоальвеолите

Заключение

Поводом к целенаправленному изучению новых биологически активных соединений в ряду комплексов переходных металлов (титан, ванадий, кобальт и

медь) с кислород- и азотсодержащими хелатирующими лигандами явилась недостаточная эффективность традиционных фармакологических средств, применяемых для лечения синдрома бронхиальной обструкции, однонаправленность их влияния на патологически измененные бронхи (только бронхорасширяющее или только противовоспалительное действие), зачастую низкий профиль безопасности. В этой связи представилось особенно важным выявить перспективы поиска нового класса соединений, обладающих благоприятными токсикологическими характеристиками, выраженными сочетанными бронхорасширяющими и противовоспалительными свойствами. В 70—80-е годы ХХ века рядом исследователей (Хьюз М., 1983; Парфенов Э. А., 2000) было показано, что фармакологический потенциал ряда лигандов, в том числе аскорбата, ^ацетилцис-теина и других, значительно усиливается в результате комплексообразования с металлами. В работах

В. Л. Ковалевой [3] были изучены комплексные соединения меди, кобальта, цинка и марганца, некоторые из них показали высокую бронхорелаксирующую активность. Однако у этих веществ прогнозировалась высокая токсичность, особенно у комплексов меди, кобальта и марганца. Поэтому дальнейший поиск в этом ряду на экспериментальных моделях бронхоспазма и воспаления был проведен среди новых представителей этого класса соединений, содержащих как другие металлы-комплексообразователи, так и не исследованные ранее лиганды.

Выводы

1. По данным токсикологических тестов изучаемые металлокомплексы обладают благоприятным профилем токсикологической безопасности, что в совокупности с высокой биологической активностью выгодно отличает исследованные соединения от имеющихся фармакологических классов антиастматических веществ.

2. На широком спектре экспериментальных моделей показано, что новые оригинальные соединения Рр 910 и Рр 908 обладают уникальным сочетанием бронхорасширяющего и противовоспалительного действия.

3. Изучение особенностей антиастматической активности данных соединений позволяет заключить, что действие их реализуется через различные механизмы и проявляется в условиях патологически измененных дыхательных путей, вызванных повреждением респираторного эпителия и активной иммунизации животных, что позволяет рассматривать данные вещества как

перспективные с точки зрения создания новых оригинальных антиастматических лекарственных препаратов.

Список литературы

1. Алейникова Т. Ю. Исследование механизмов брон-хорелаксирующего действия новых металлокомплексных соединений : дис. ... канд. мед. наук / Алейникова Т. Ю.

— Купавна, 2001.

2. Гладких С. П. Металло-лигандный гомеостаз /

С. П. Гладких, Л. Н. Сернов. — М., 2002.

3. Ковалева В. Л. Поиск и изучение механизмов действия новых соединений с антиастматической активностью среди производных пиридина, пиррохинолона и кумаринов : дис. ... д-ра мед. наук / Ковалева В. Л. — Купавна, 1997.

4. Barnes P. J. New drugs for asthma / P. J. Barnes // Nat. Rev. Drug Discov. — 2004. — Vol. 3(10). — P. 831—844.

5. Jeffery P. Phosphodiesterase 4-selective inhibition: novel therapy for the inflammation of COPD / P. Jeffery // Pulm. Pharmacol. Ther. — 2005. — Vol.18(1). — P. 9—17.

6. Nunes de Melo M. Rates and patterns of chronic obstructive pulmonary disease exacerbations / M. Nunes de Melo, P. Ernst, S. Suissa // Can. Respir. J. — 2004. — Vol. 11(8).

— P. 559—564.

ANTIASTHMATIC ACTIVITY OF NEW COMPOUNDS FROM LINE OF METALLOCOMPLEXES

I. А. Krylov, *V. L. Kovaleva, *L. N. Sernov,

**E. А. Parfenov

Northern State Medical University, Arkhangelsk *All-Russian Scientific Center for Safety of Biologically Active Substances,

**SRI of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, Scientific Center named after N.N. Blokhin RAMS, Moscow

The goal-seeking search of new biologically active compounds from the line of transitional metallocomplexes (titanium, vanadium, cobalt and copper) with oxygen- and nitrogen-containing chelate ligands has been carried out in the framework of development of effective and safe tools for correction of the syndrome of bronchial obstruction that combine two kinds of pharmacologic activity — broncholithical and antiinflammatory at the minimum. It has been shown that in the line of new original metallocomplex compounds, there were substances highly effective as regards prevention and removal of bronchospasms with improved toxicological profile, what serves as a prerequisite for working out of tools correcting endoecological unbalance of the broncho-pulmonary system of the organism.

Key words: metallocomplexes, tools with combined broncholithical and antiinflammatory action.