CC BY
57
АБИСИЛИН АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА □ 13
УДК 615.322.015.44:611.018.74
Л.А. Лацерус1, Н.М. Пинигина1, А.Ю. Барышников2, Е.В. Степанова2
АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА АБИСИЛИН® IN VITRO И IN VIVO
1ООО «Инитиум-Фарм», Москва 2РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация
Лацерус Людмила Анатольевна, кандидат медицинских наук, генеральный директор ООО «Инитиум-Фарм» адрес: 142000, Московская область, г. Домодедово, Каширское ш., д. 7, тел.: +7(499)-722-2357 e-mail: [email protected]
Статья поступила: 24.11.2009, принята к печати 25.03.2010.
Резюме
Абисилин® - отечественный пероральный препарат, содержащий в своем составе природный комплекс терпеноидов, синтезируемый хвойными деревьями. Проведены исследования по оценке антиангиогенных свойств препарата с использованием цитотоксического, пролиферационного и миграционного тестов, а также метода ингибирования формирования сосудистоподобных структур. В опытах in vitro показано, что Абисилин® вызывает гибель (LD50=0,21 мг/мл) и блокирует пролиферацию (ИК50=0,09 мг/мл) эндотелиальных клеток SVEC-4-10. Препарат концентрации 0,25 мг/мл блокирует на 89 % миграцию эндотелиальных клеток в и тормозит в концентрации 0,125 мг/мл образование трубочкоподобных структур. Установлено, что препарат Абиси-лин® при введении мышам C57BL/6 перорально в течение 7 дней в дозах 2; 1 и 0,2 мг/мл блокирует рост новых сосудов в имплантанте Матригеля с введенным стимулятором ангиогенеза bFGF. Полученные данные свидетельствуют о способности препарата Абисилин® блокировать основные этапы опухолевого ангиогенеза.
Ключевые слова: Абисилин®, антиангиогенные свойства, эндотелиальные клетки.
L.A. Latserus1, N.M. Pinigina1, A.Yu. Baryshnikov2, E.V. Stepanova2 ANTIANGIOGENIC ACTIVITY OF ABISILIN® IN VITRO AND IN VIVO 'Initium-Parm, LTD, Moscow
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow Abstract
In this study we have examined the cytotoxic, antiproliferative and migrative activity of Russian anticancer drug - Abisilin® - which is known to be the complex of terpenoids. Here we show that Abisilin® induced the cell death (LD50=0,21 mg/ml) and inhibited endothelial SVEC 4-10 cells proliferation (IK=0,09 mg/ml). The migration of cells was inhibited for about 89 % at the concentration 0,25 mg/ml. In this study we have also studied the effect of Abisilin® on capillary-like structures formation by SVEC 4-10 cells. Abisilin® blocked the formation of such structures. In vivo experiments demonstrated that Abisilin® at doses 2; 1 et 0,2 mg/kg body weigh reduced the microvascu-lar density of vessels when administrated per os.
Key words: Abisilin®, antiangiogenic capacity, endothelial cells.
Введение
Лекарственный препарат Абисилин® (Абисил 20%-ный раствор в масле для перорального применения) содержит в своем составе природный комплекс терпеноидов (изопреноидов), синтезируемый хвойными деревьями.
Субстанция препарата (Абисил - пихты сибирской терпены) и его лекарственная форма для местного и наружного применения, включенные в Государственный реестр лекарственных средств, проявляют антимикробные, противовоспалительные, ранозаживляющие, иммуномодулирующие и другие фармакологически значимые эффекты [1-3].
Широкий спектр фармакологической активности препарата, по-видимому, связан с многокомпонентным набором терпеноидов, входящих в его состав. Известно, что среди природных соединений этого класса найдены вещества с выраженными противоопухолевыми свойствами.
Например: таксаны, каротиноиды, токоферолы и другие [4].
Цель работы - изучение антиангиогенной активности препарата Абисилин® in vitro и in vivo.
Материалы и методы
В работе использованы культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10, трансформированные вирусом SV40.
Для исследования использовали препарат Аби-силин® для перорального применения. Раствор препарата готовился в стоковой концентрации 10 мг/мл (10% ДМСО/PBS) в лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН в день постановки экспериментов. Препарат
- взвесь белого цвета - разводили в 1% PBS. Все эксперименты были повторены не менее 4 раз [5].
Анализ цитотоксического действия на культуру эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10
Клетки (6х104 в мл) сажали на 96-луночный планшет в среде ,3MEM, содержащей 10 % эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина. Спустя 24 ч добавляли препарат в различных концентрациях. Инкубацию с препаратом проводили 1 день, затем добавляли МТТ в конечной концентрации 0,5 мг/мл. Клетки инкубировали 4 ч, затем среду отбирали и клетки растворяли в ДМСО.
Оптическую плотность оценивали на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» при 540 нм, используя DMSO как нулевой контроль.
Ингибирование миграции культуры эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 (метод «раневой поверхности »
Клетки (3*105 в мл) сажают на 24-луночный планшет в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина, и инкубируют до образования монослоя. Затем монослой нарушают путем соскабливания части клеток. В течение 24 ч клетки инкубируют в среде ДМЕМ, содержащей 10% FCS, 2мМ глутамина и нецитотоксиче-ские дозы препарата.
В качестве положительного контроля используют клетки, инкубировавшиеся в ДМЕМ без добавления сыворотки.
Результаты оценивают как процент мигрирующих клеток в опыте по отношению к контролю (клетки в среде ДМЕМ, содержащей 10% эмбриональной сыворотки, 2мМ глутамина).
Ингибирование образования трубочкоподобных структур эндотелиальными клетками SVEC-4-10
24-луночную плашку покрывают раствором Матригеля (250 мкл/лунка) и инкубируют 20 мин при 37 °С до его полимеризации. Клетки (4*105 в мл) инкубируют в среде ДМЕМ с добавлением не-цитотоксических доз препарата в течение 30 мин при 37 °С.
Затем клетки (500 мкл) наносят в лунки, покрытые Матригелем, и инкубируют в СО ^инкубаторе в течение 4-5 ч. В качестве положительного контроля используют клетки, инкубировавшиеся в среде ДМЕМ без добавления препарата. Оценивают длину трубочек и количество контактов между трубочками.
Модель имплантанта Матригеля in vivo
В экспериментах использовали мышей-самок С57В1/6 возрастом 6-8 нед. Матригель (BD Bioscience, Discovery Labware) при 4 °С смешивали только со 100 нг/мл bFGF (Becton Dickinson Lab-ware). Смесь Матригеля затем вводили подкожно мышам в подмышечную впадину, где он полимери-зовался с формированием имплантанта.
Имплантант удалялся на 7-й день, фиксировался в 10 %-ном нейтральном формалине в течение 24-36 ч и заключался в парафин. Срезы толщиной 4-5 мкм докрашивались гематоксилин-эозином. Препарат Абисилин® вводился мышам перорально ежедневно в течение 7 дней в дозе 2; 1 и 0,2 мг/мл.
Результаты
Цитотоксическое действие Абисилина□
Был проведен анализ цитотоксического действия Абисилина® на эндотелиальные клетки при инкубации в течение 24 ч с клетками линии SVEC4-10, высаженными в высокой плотности.
По нашим данным Абисилин® вызывает гибель эндотелиальных клеток в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 0,125 мг/мл (рис. 1). ЛД50 составила 0,21 мг/мл.
Был проведен анализ влияния Абисилина® на пролиферативную активность активированных bFGF эндотелиальных клеток SVEC4-10, высаженных в низкой плотности.
Показано, что Абисилин® блокирует пролиферацию эндотелиальных клеток SVEC4-10 в диапазоне концентраций от 1 мг/мл до 0,125 мг/мл (ИК50=0,09 мг/мл).
В двух нецитотоксических концентрациях (0,0625 мг/мл и 0,031 мг/мл) наблюдалось блокирование пролиферации эндотелиальных клеток на 20 % (рис. 2).
Антимиграционное действие Абисилина □
Способность Абисилина® блокировать миграцию эндотелиальных клеток «в рану» была оценена на диапазоне доз препарата от 0,25 мг/мл до
0,031 мг/мл (рис. 3-4).
Наблюдается блокирование миграции эндотелиальных клеток на S9 % при концентрации Аби-силина® 0,25 мг/мл.
Абисилин® не блокирует миграцию эндотелиальных клеток «в рану» в нецитотоксических концентрациях (0,0625 мг/ мл и 0,031 мг/мл).
Действие Абисилина□ на трубочкоподобные структуры
Способность Абисилина® блокировать образование трубочкоподобных структур была оценена в диапазоне доз препарата от 0,125 мг/мл до 0,015 мг/мл.
Исследование показало, что Абисилин® частично блокирует образование трубочкоподобных структур в концентрации 0,125 мг/мл.
Наблюдаемые трубочки являются короткими, незамкнутыми и не ограничены контактами с другими трубочками. При концентрации Абисили-на® 0,0625; 0,031 и 0,015 мг/мл блокирования образования трубочкоподобных структур не наблюдалось (рис. 5).
Действие Абисилина □ на ангиогенез в имплантанте Матригеля
Исследование антиангиогенного действия Абисилина® in vivo проводилось по способности ингибировать ангиогенез в имплантанте Матригеля со стимулятором ангиогенеза bFGF. Абисилин® вводился перорально каждый день в течение 7 дней в концентрациях 0,2; 1 и 2 мг/мл.
Исследование показало, что Абисилин® в изученных концентрациях дозозависимо блокирует образование сосудов в Матригеле (рис. 6).
Максимальное блокирование наблюдалось при концентрациях Абисилина® 1 и 2 мг/мл, при концентрации 0,2 мг/мл - частичное блокирование образования новых сосудов в имплантанте Матри-геля. На гистологических срезах имплантанта Мат-ригеля, окрашенных гематоксилином и эозином, отмечено дозозависимое снижение количества эндотелиальных клеток и стромальных элементов при кормлении мышей Абисилином®.
Заключение
Проведенное исследование показало, что лекарственный препарат Абисилин® обладает анти-ангиогенными свойствами в экспериментах in vitro и in vivo.
Полученные данные позволяют рекомендовать его для клинических испытаний в качестве препарата, способного блокировать ангиогенез злокачественных опухолей.
Иллюстрации 4-б см. на стр. I-II
АБИСИЛИН АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА□ 15
Рис. 1. Цитотоксическое действие Абисилина® на культуру эндотелиальных клеток (8УБС-4-10).
Рис. 2. Антипролиферативное действие Абисилина® на культуру эндотелиальных клеток 8УБС-4-10.
16 АБИСИЛИН АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА□
Рис. 3. Влияние Абисилина® на миграцию эндотелиальных клеток SVEC-4-10 в тесте «заживление раны».
Литература
1. Государственный реестр лекарственных средств. - М., 2004. - Т. 1. - С. 93.
2. Лацерус Л.А., Носков А.П., Пинигина Н.М. Биологическая активность и клиническая эффективность нового фитопрепарата «Абисил-1» // Современные проблемы педиатрии и детской хирургии: Материалы Сибирско-Американской научно-практической конференции. Иркутск, 7-8 октября 1998 г.
- Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1998. - С. 233-8.
3. Пинигина Н.М., Лацерус Л.А., Брайн Э.В. и др. Средство «Абисил-1», обладающее противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью. Патент РФ №2054945 от 27.02.1996.
4. Трещалина Е.М. Противоопухолевая активность веществ природного происхождения. - М.: Практическая медицина, 2005. - 272 с.
5. PCT/RU2008/000147. Pub.No.: W0/2009/113902, 17.09.2009. Pinigina N.M., Latserus L.A., Baryshnikov F.U. et. al. Antitumoral terpenoid pharmaceutical composition “Abisilin” exhibiring angiogenesis-inhibitig action.
Рисунки к статье Л.А. Лацерус и соавт.
«АНТИАНГИОГЕННЫЕ СВОЙСТВА ПРЕПАРАТА АБИСИЛИН® IN VITRO И IN VIVO»
Рис. 4. Микрофотографии миграционной активности эндотелиальных клеток 8УЕС-4-10, полученных при инкубации с различными дозами препарата Абисилин®:
А - отрицательный контроль; Б - положительный контроль;
В - Абисилин® 0,25 мг/мл; Г - Абисилин® 0,0625 мг/мл.
Рис. 5. Микрофотографии трубочкоподобных
структур, образованных эндотелиальными клетками SVEC-4-10; получены при инкубации с различными дозами препарата Абисилин®:
А - контрольный образец;
Б - Абисилин® 0,125 мг/мл;
В - Абисилин® 0,0625 мг/мл.
Положительный контроль
0,2 мг/мл І мг/мл 2 мг/мл
Рис. 6. Микрофотографии имплантантов Матригеля, выделенных из подкожной клетчатки мышей, и гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином; получены in vivo введении Абисилина® per os.
Рисунки к статье Д.В. Соколовой и соавт.
«ОСНОВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ КСЕНОГРАФТОВ ЛИМФОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЛБР-2 КАК МИШЕНИ ДЛЯ ТАРГЕТНОЙ ТЕРАПИИ»
Рис. 1. Динамика роста 1-го пассажа п/к ксенографта ЛБР-2 у мышей- Рис. 2. Мышь линии Balb/c nude с п/к самок Balb/c nude после имплантации адаптированной культуры клеток. ксенографтом ЛБР-2 (1-й пассаж, 24-е
сутки после трансплантации).
