CC BY
35
УДК 579.843.1:579.26:579:575.25
DOI 10.18522/0321-3005-2016-1-49-53
АНАЛИЗ ВНУТРИВИДОВОЙ КОНКУРЕНЦИИ VIBRIO CHOLERAE
В БИОПЛЕНКАХ
© 2016 г. С.О. Водопьянов, С.В. Титова, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников, Л.К. Лысова
Водопьянов Сергей Олегович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: serge100v@ gmail.com
Титова Светлана Викторовна - кандидат медицинских наук, директор, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: [email protected]
Водопьянов Алексей Сергеевич - кандидат медицинских наук, руководитель группы, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: alexvod@ gmail. com
Олейников Игорь Павлович - научный сотрудник, Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора, ул М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: alexvod@ gmail.com
Лысова Людмила Константиновна - научный сотрудник, Ро-стовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзо-ра, ул. М. Горького, 117/40, г. Ростов-на-Дону, 344002, e-mail: [email protected]
Vodop'yanov Sergei Olegovich - Doctor of Medical Sciences, Head of Laboratory, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service in the Sphere of Consumer Right Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: serge100v@gmail. com
Titova Svetlana Viktorovna - Candidate of Medical Sciences, Director, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service in the Sphere of Consumer Right Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: [email protected] Vodop'yanov Aleksei Sergeevich - Candidate of Medical Science, Team Leader, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service in the Sphere of Consumer Right Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: alexvod@ gmail.com
Oleinikov Igor Pavlovich - Researcher, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service in the Sphere of Consumer Right Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: alexvod@ gmail.com Lysova Lyudmila Konstantinovna - Researcher, Rostov-on-Don Anti-Plague Institute of the Federal Service in the Sphere of Consumer Right Protection, M. Gorkii St., 117/40, Rostov-on-Don, 344002, Russia, e-mail: [email protected]
Представлена разработка на модели биопленок способа быстрого определения внутривидовой ингибирующей активности холерных вибрионов на основе изучения INDEL-маркеров. В работе использовали три токсигенных штамма V. с^1егае и атоксигенный штамм, выделенный в 2015 г. из речной воды. Установлено, что один из изученных токсигенных штаммов способен успешно противостоять ингибирующей активности атоксигенного штамма как в планктонной форме, так и в составе биопленки. Следовательно, способность токсигенных штаммов вибрионов противостоять внутривидовой конкуренции может иметь большое биологическое значение. Таким образом, наибольшую опасность при попадании в водоемы представляют токсигенные штаммы V. Ло1егае «резистентного» фенотипа, способные противостоять ингибирующей активности атоксигенных штаммов.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, биопленка, внутривидовая конкуренция, INDEL-маркеры.
The purpose of this work - the development of model biofilms way quickly determine intraspecific inhibitory activity of Vibrio cholerae from a study INDEL-markers. We used three of toxigenic strains of V. cholerae and nontoxigenic strain isolated in 2015 from the river water. It is found that one of toxigenic strains studied is able to successfully withstand the inhibiting activity nontoxigenic strain, in planktonic form, and as part of the biofilm. In our opinion, the ability of toxigenic Vibrio strains resist intraspecific competition can be of great biological significance. The greatest danger when released into water bodies are toxigenic strains of V. cholerae «resistant» phenotype can withstand inhibitory activity nontoxigenic strains.
Keywords: Vibrio cholerae, biofilm, intraspecific competition, INDEL-markers.
Целью эпидемиологического надзора за холерой, реализуемого в Российской Федерации, являются своевременное выявление завозных и возможных местных случаев холеры и быстрое проведение противоэпидемических мероприятий [1]. Эту задачу невозможно решить без учета всех особенностей биологии возбудителя.
Между тем в настоящий момент практически все знания о биологии холерного вибриона получе-
ны на модели свободноживущих аксенных клеток -планктонной формы. В последнее время установлено, что многие микроорганизмы в естественных экосистемах, кроме традиционной планктонной формы, могут существовать и в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ -биопленок [2]. Установлено, что такая форма существования микроорганизмов обеспечивает им защиту и позволяет выживать в самых неблагоприят-
ных условиях. Тем самым биопленки способствуют длительной персистенции микробов в окружающей среде [3, 4].
Способность холерного вибриона образовывать биопленки в последнее время привлекла внимание исследователей у нас в стране и за рубежом. Исследователей интересует вопрос, как в составе биопленки изменяются такие важные характеристики вибрионов, как устойчивость к дезинфектантам, антибактериальным препаратам, желчным кислотам, кислому рН [3-7], выживаемость во внешней среде [8] или вирулентность [9].
Одним из важных свойств вибрионов является их способность противостоять меж- и внутривидовой конкуренции. Показано, что некоторые представители других видов микроорганизмов подавляют колонизирующую и патогенную активность вибрионов [10]. Кроме того, на территории Российской Федерации в пробах воды поверхностных водоемов регулярно обнаруживают атоксигенные штаммы холерных вибрионов, что указывает на их стабильное сохранение в окружающей среде [11]. На данный момент имеются лишь единичные сообщения о внутривидовой конкурентной активности планктонной формы атоксигенных и токсиген-ных штаммов вибрионов [12]. Недавно был разработан метод оценки внутривидовой конкуренции вибрионов на основе анализа INDEL-маркеров [12]. Сведений о внутривидовой конкурентной активности атоксигенных и токсигенных штаммов вибрионов на модели биопленок в доступной литературе мы не встретили.
Цель настоящей работы - разработка на модели биопленок способа быстрого определения внутривидовой ингибирующей активности холерных вибрионов на основе изучения INDEL-маркеров.
Материалы и методы
В работе использовали характерные для шестой и седьмой пандемии холеры токсигенные штаммы V. сholerae, выделенные в разные годы, эпидемически опасные, с генотипами ctxAB+tcpA+ (№ 19191, 301, 569В) и эпидемически неопасные, с генотипом ctxAB"tcpA" № 434, (выделенный в 2015 г. из реки Агуры). Все штаммы были получены из музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора. Исходные культуры выращивали на агаре Мартена при 37 оС в течение 18 ч.
Для изучения свойств штаммов биопленки холерных вибрионов получали на твердом субстрате, во флаконах (100 мл), контаминированных взвесью п*104 микробных клеток холерных вибрионов каждого штамма. Способ получения опи-
сан в [13]. В качестве сред культивирования инкубации использовали воду водопроводную, речную (р. Агура) и морскую, забранную в Черном море в месте впадения р. Агуры. В качестве контроля -1-процентную пептонную воду. Культивирование проводили в 30 мл при комнатной температуре; в качестве твердого субстрата приняли пластинки (0,5 х 1,5 см) из пищевого пластика.
Из 18-часовых агаровых культур изучаемых штаммов холерного вибриона по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО-42-25-59-86 П) готовили 1 млрд взвеси. Культуры в соответствующем разведении объединяли в изучаемые пары, контрольные пробы содержали только один из пары исследуемых штаммов. В опытных пробах были смешаны взвеси двух штаммов в соотношениях 1:1 или 1:3 соответственно. Количество образующих единиц (КОЕ) подтверждали путем высева на агар Мартена и подсчетом КОЕ/мл. Внутривидовую конкуренцию изучали одномоментно у планктонной формы (для этого 0,5 мл среды инкубации из экспериментальной пробы переносили в пробирку типа эппендорф -1,5 мл) и в форме биопленок. Для этого стерильным пинцетом из флакона извлекали одну пластиковую пластину, трижды промывали методом погружения соответствующей средой от несвязав-шихся неадгезированных вибрионов; в вертикальном положении высушивали на листе стерильной фильтровальной бумаги. Далее сухую пластиковую пластину пинцетом помещали в пробирку типа эп-пендорф емкостью 1,5 мл. Обеззараживание пробы и выделение ДНК проводили немедленно после отбора пробы путем температурного лизиса, прогревая пробирки при 99 оС в течение 30 мин.
Изучение внутривидовой конкуренции вибрионов проводили в ПЦР с использованием праймеров к INDEL-локусу 012, как описано ранее [12].
Для обнаружения токсигенных штаммов вибрионов в этих же образцах ДНК использовали ПЦР в реальном времени, а также систему праймеров и зонд [14]. Олигонуклеотидный зонд, меченный по концам флюорофором HEX и гасителем BHQ1, был синтезирован НПФ фирмой «Евроген» (Москва). Амплификацию в формате реального времени ставили в амплификаторе «ДТ-лайт» (НПФ «ДНК-технология», Москва).
Результаты
Ранее на моделях внутривидовой конкуренции и планктонной формы нами была установлена гетерогенность популяции ctx+ tcpA+-штаммов холерных вибрионов по способности планктонной формы конкурировать с ctx- tcpA--штаммами [12]. Изу-
ченные с1х+ tcpA+-штаммы по устойчивости к ин-гибирующей активности атоксигенного штамма разделились на две группы: подавляемые Сх- tcpA"-штаммом при совместной инкубации и штаммы резистентные, т.е. сохраняющие свое количество на уровне штамма-антагониста.
Поэтому в данную работу были взяты штаммы двух описанных выше групп. В качестве атокси-генного был выбран один из штаммов, выделенных в 2015 г. из воды реки Агуры.
В первой серии экспериментов внутривидовую конкуренцию изучали при соотношении токсиген-ных и атоксигенных штаммов 1:1. При таком соотношении отмечено полное подавление всех изучаемых токсигенных штаммов атоксигенным штаммом. Поэтому для последующих экспериментов соотношение токсигенных и атоксигенных штаммов увеличили до 3:1.
В контрольной пробе при инкубации в 1-процентной пептонной воде в соотношении токсигенных и атоксигенных штаммов 3:1 обнаружено, что атоксигенный штамм полностью подавлял все три токсигенных штамма уже через 48 ч как в планктонной форме, так и в форме биопленок. Это проявлялось в наличии мажорной полосы INDEL-маркера атоксигенного штамма и отсутствии полосы амплификата INDEL-маркера токсигенных штаммов (рис. а). Однако при проведении ПЦР в формате реального времени во всех пробах пеп-тонной воды регистрировали наличие ДНК токси-генных штаммов в возрастающей концентрации. Учитывая разрешающую способность метода, основанного на анализе INDEL-маркеров как 1:10 [12], можно считать, что в случае инкубации в пеп-тоной воде имеет место преобладающий рост атоксигенного штамма. Подобная разность в скорости роста различных штаммов вибрионов описана в литературе [15].
Совершенно иные результаты наблюдали при инкубации указанных пар штаммов в водопроводной, речной или морской воде (рис. б). В этом случае при совместной инкубации со штаммом 19191 во всех средах культивирования обнаружено равномерное распределение INDEL-маркеров токсигенных и атоксигенных штаммов (рис. б, лунки 213). Это доказывало, что токсигенный штамм 19191 способен успешно противостоять ингибирующей активности атоксигенного штамма как в планктонной форме, так и в составе биопленки. В то же время в пробах при совместной инкубации токсигенных штаммов 301 INDEL-маркер токсигенных штаммов отсутствовал (рис. б, лунки 14-18). Подобную картину ингибиции регистрировали и во всех пробах со штаммом 569В классического биовара. И в этом случае при проведении ПЦР в
формате реального времени во всех «негативных» пробах регистрировали наличие ДНК токсигенных штаммов в возрастающей концентрации. Это свидетельствовало об отсутствии гибели токсигенных штаммов при соинкубации [15].
б
Результат электрофореза в 10-процентном геле полиакри-ламида продуктов амплификации образцов ДНК со специфическими праймерами к INDEL-маркеру 012. Положение специфических ампликонов, характерных для атоксигенного штамма 434, и токсигенных штаммов (ctx+) указано стрелками: а - результат совместного культивирования
атоксигенного и токсигеного штаммов 434 и 19191 в 1-процентной пептонной воде. Лунки: 1, 2 - 2 ч инкубации; 3, 4; 5, 6 и 7, 8 - инкубация в течение одних, двух и трех суток соответственно. Нечетные лунки - проба содержит планктонную форму, четные - образец ДНК получен из биопленки; 9 - маркеры молекулярного веса; б - результат совместного культивирования атоксигенного и токсигеных штаммов 19191 и 301 в водопроводной (лунки 2-5), речной (лунки 6-9) или морской воде (лунки 10-13). Лунка 1 содержит маркеры молекулярного веса; 2-13 - совместная инкубация штаммов 434 и 19191; 14-18 - совместное культивирование штаммов 434 и 301 в водопроводной воде
Полученные данные подтвердили наше раннее наблюдение о существовании «резистентного» и «подавляемого» фенотипов при внутривидовом контакте в планктонной форме [12]. Более того, данная закономерность характерна и для штаммов вибрионов, находящихся в составе биопленок. Тот факт, что штамм 569В классического биовара обладает «подавляемым» фенотипом, может быть следствием феномена вытеснения вибрионов классического биовара вибрионами эльтор [1].
а
Таким образом, разработан несложный метод оценки внутривидовой конкурентной активности вибрионов в составе биопленок, основанный на анализе в ПЦР уникальных INDEL-маркеров ток-сигенных и атоксигенных штаммов.
Ранее описанная гетерогенность токсигенных штаммов холерного вибриона по способности планктонной формы конкурировать с атоксиген-ным штаммом характерна и для биопленок. На наш взгляд, способность токсигенных штаммов вибрионов противостоять внутривидовой конкуренции может иметь большое биологическое значение; при этом наибольшую опасность при попадании в водоемы представляют штаммы резистентного фенотипа, способные противостоять ингибирующей активности атоксигенных штаммов.
Литература
1. Онищенко Г.Г., Москвитина Э.А., Кругликов В.Д., Тито-
ва С.В., Адаменко О.Л., Водопьянов А.С., Водопьянов С.О. Эпидемиологический надзор за холерой в России в период седьмой пандемии // Вестник РАМН. 2015. Т. 70, № 2. С. 249-256.
2. Бухарин О.В. Инфекционная симбиология // Журн. мик-
робиологии. 2015. № 4. С. 4-9.
3. Hung D.T., Zhu J., Sturtevant D., Mekalanos J.J. Bile acids
stimulate biofilm formation in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 2006. Vol. 59. P. 193-201.
4. Matz C., McDougaldD., Moreno AM, Yung P.Y., Yildiz F.H.,
Kjelleberg S. Biofilm formation and phenotypic variation enhance predation-driven persistence of Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005. Vol. 102. P. 1681916824.
5. Сизова Ю.В., Черепахина И.Я., Балахнова В.В., Бурлако-
ва О.С., Сизова Е.В., Помухина О.И., Фецайлова О.П. Вариабельность свойств, характеризующих способность к выживанию холерных вибрионов в биопленочных сообществах // Проблемы особо опасных инфекций. 2012, вып. 3. С. 54-57.
6. КуликаловаЕ.С., Урбанович Л.Я., Саппо С.Г., Миронова Л.В.,
Марков Е.Ю., Мальник В.В., Корзун В.М., Миткеева С.К., Балахонов С.В. Биопленка холерного вибриона: получение, характеристика и роль в резервации возбудителя в водной окружающей среде // Журн. микробиологии. 2015. № 1. С. 3-11.
7. Титова С.В., Веркина Л.М., Кирилова О.Д., Лысова Л.К.,
Таркаева Ж.В. Действие перекиси водорода и хлорамина Б на биоплёнки холерных вибрионов // Дезинфекционное дело. 2015. № 3. С. 6-13.
8. Faruque S.M, Biswas K., Udden S.M., Ahmad Q.S., SackD.A.,
Nair G.B., Mekalanos J.J. Transmissibility of cholera: in vivo-formed biofilms and their relationship to infectivity and persistence in the environment // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006.Vol. 103. P. 6350-6355.
9. Tamayo R., Patimalla B., Camilli A. Growth in a Biofilm
Induces a Hyperinfectious Phenotype in Vibrio cholerae // Infection and Immunity. 2010. Vol. 78, № 8. P. 35603569.
10. Hsiao A., Ahmed A.M.S., Subramanian S., Griffin N.W.,
Drewry L.L., Petri Jr W.A., Haque R., Ahmed T., Gordon J.I.
Members of the human gut microbiota involved in recovery from Vibrio cholerae infection // Nature. 2014. Vol. 515, № 7527. P. 423-426.
11. Ежова М.И., Кругликов В.Д., Водопьянов А.С., Водопья-
нов С.О., Шестиалтынова И.С., Олейников И.П., Непомнящая Н.Б., Подойницына О.А. Холерные вибрионы O1 серогруппы, выделенные из водных объектов Ростова-на-Дону в ходе мониторинга в 2008-2012 гг. // Проблемы особо опасных инфекций. 2013. Вып. 4. С. 56-59.
12. Водопьянов С.О., Водопьянов А.С., Олейников И.П.,
Лысова Л.К., Титова С.В. Разработка метода оценки внутривидовой конкуренции холерных вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы : материалы проблемной комиссии. Ростов н/Д., 2015. Вып. 28. С. 116-119.
13. Патент России № 255946. Способ моделирования
образования биопленок холерных вибрионов в условиях эксперимента и устройство для его осуществления / С.В. Титова, Е.В. Кушнарева. 2015. № 22 от 10.08. 2015.
14. Huang J., Zhu Y., Wen H., Zhang J., Huang S., Niu J., Li Q.
Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae O1 and O139 strains and determination of their toxigenic potential // Appl. Environ. Microbiology. 2009. Vol. 75, № 22. P. 6981-6985.
15. Заднова С.П., Кульшань ТА, Челдышова Н.Б., Крицкий А А,
Плеханов Н.А., Смирнова Н.И. Сравнительный анализ выживаемости типичных штаммов и штаммов генова-риантов Vibrio cholerae биовара эль тор in vitro и in vivo // Проблемы особо опасных инфекций. 2015. Вып. 4. С. 65-69.
References
1. Onishchenko G.G., Moskvitina E.A., Kruglikov V.D., Tito-
va S.V., Adamenko O.L., Vodop'yanov A.S., Vodop'yanov S.O. Epidemiologicheskii nadzor za kholeroi v Rossii v period sed'moi pandemii [Surveillance of cholera in Russia during the seventh pandemic]. Vestnik RAMN, 2015, vol. 70, no 2, pp. 249-256.
2. Bukharin O.V. Infektsionnaya simbiologiya [Infectious sim-
biology]. Zhurn. mikrobiologii, 2015, no 4, pp. 4-9.
3. Hung D.T., Zhu J., Sturtevant D., Mekalanos J.J. Bile acids
stimulate biofilm formation in Vibrio cholerae. Mol. Mi-crobiol, 2006, vol. 59, pp. 193-201.
4. Matz C., McDougald D., Moreno A.M., Yung P.Y., Yildiz
F.H., Kjelleberg S. Biofilm formation and phenotypic variation enhance predation-driven persistence of Vibrio cholera. Proc. Natl. Acad. Sci. U.SA, 2005, vol. 102, pp. 16819-16824.
5. Sizova Yu.V., Cherepakhina I.Ya., Balakhnova V.V., Bur-
lakova O.S., Sizova E.V., Pomukhina O.I., Fetsailova O.P. Variabel'nost' svoistv, kharakterizuyushchikh sposobnost' k vyzhivaniyu kholernykh vibrionov v bioplenochnykh soob-shchestvakh [The variability of the properties characterizing the ability to survival of V. cholerae in biofilm communities]. Problemy osobo opasnykh infektsii, 2012, vol. 3, pp. 54-57.
6. Kulikalova E.S., Urbanovich L.Ya., Sappo S.G., Mironova
L.V., Markov E.Yu., Mal'nik V.V., Korzun V.M., Mitkeeva S.K., Balakhonov S.V. Bioplenka kholernogo vibriona: poluchenie, kharakteristika i rol' v rezervatsii vozbuditelya v vodnoi okruzhayushchei srede [Biofilm cholera: prepara-
tion, characterization and role in the reservations of the pathogen in the aquatic environment]. Zhurn. mikrobi-ologii, 2015, no 1, pp. 3-11.
7. Titova S.V., Verkina L.M., Kirilova O.D., Lysova L.K.,
Tarkaeva Zh.V. Deistvie perekisi vodoroda i khloramina B na bioplenki kholernykh vibrionov [The action of hydrogen peroxide and chloramine B on V. cholerae biofilms]. Dezinfektsionnoe delo, 2015, no 3, pp. 6-13.
8. Faruque S.M, Biswas K., Udden S.M., Ahmad Q.S., Sack
D.A., Nair G.B., Mekalanos J.J. Transmissibility of cholera: in vivo-formed biofilms and their relationship to infec-tivity and persistence in the environment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2006, vol. 103, pp. 6350-6355.
9. Tamayo R., Patimalla B., Camilli A. Growth in a Biofilm
Induces a Hyperinfectious Phenotype in Vibrio cholerae. Infection and Immunity, 2010, vol. 78, no 8, pp. 3560-3569.
10. Hsiao A., Ahmed A. M. S., Subramanian S., Griffin N.W.,
Drewry L.L., Petri Jr W.A., Haque R., Ahmed T., Gordon J.I. Members of the human gut microbiota involved in recovery from Vibrio cholerae infection. Nature, 2014, vol. 515, no 7527, pp. 423-426.
11. Ezhova M.I., Kruglikov V.D., Vodop'yanov A.S., Vodop'ya-
nov S.O., Shestialtynova I.S., Oleinikov I.P., Nepomnyash-chaya N.B., Podoinitsyna O.A. Kholernye vibriony O1 serogruppy, vydelennye iz vodnykh ob"ektov Rostova-na-Donu v khode monitoringa v 2008-2012 [Vibrio cholerae serogroup O1 isolated from water bodies of Rostov-on-Don
Поступила в редакцию
during the monitoring in 2008-2012]. Problemy osobo opasnykh infektsii, 2013, vol. 4, pp. 56-59.
12. Vodop'yanov S.O., Vodop'yanov A.S., Oleinikov I.P., Ly-
sova L.K., Titova S.V. [Development of a method of intra-specific competition assessment of V. cholerae]. Kholera i patogennye dlya cheloveka vibriony [Cholera and human pathogenic vibrios]. Proceedings of the problem commission. Rostov-on-Don, 2015, vol. 28, pp. 116-119.
13. Titova S.V., Kushnareva E.V. Sposob modelirovaniya obra-
zovaniya bioplenok kholernykh vibrionov v usloviyakh ek-sperimenta i ustroistvo dlya ego osushchestvleniya [Method of Vibrio cholerae biofilm modeling in experimental conditions and device for its realization]. Certificate, no 255946, 10.08.2015.
14. Huang J., Zhu Y., Wen H., Zhang J., Huang S., Niu J., Li Q.
Quadruplex real-time PCR assay for detection and identification of Vibrio cholerae O1 and O139 strains and determination of their toxigenic potential. Appl. Environ. Microbiology, 2009, vol. 75, no 22, pp. 6981-6985.
15. Zadnova S.P., Kul'shan' T.A., Cheldyshova N.B., Kritskii
A.A., Plekhanov N.A., Smirnova N.I. Sravnitel'nyi analiz vyzhivaemosti tipichnykh shtammov i shtammov genovari-antov Vibrio cholerae biovara el' tor in vitro i in vivo [Comparative analysis of the survival of typical strains and strains genovariants Vibrio cholerae El Tor biovar in vitro and in vivo]. Problemy osobo opasnykh infektsii, 2015, vol. 4, pp. 65-69.
21 января 2016 г.
