CC BY
116
УДК 616.61-008.64-092-07:577.175.823
АНАЛИЗ СЕРОТОНИНЕРГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В РАЗВИТИИ ОСТРОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И ВОЗМОЖНОСТИ НЕФРОПРОТЕКТОРНОГО ДЕЙСТВИЯ ОНДАНСЕТРОНА
А.В. Дубищев, Е.Н. Зайцева, М.И. Панина
Кафедра фармакологии (зав. - проф. А.В. Дубищев) Самарского государственного медицинского университета
Современная классификация серотони-новых рецепторов, предложенная в 1993 г. "Serotonin Club", выделяет 7 популяций рецепторов: 5-НТ1-5-НТ7 [1, 6]. Основное их количество локализовано в центральной нервной системе. Некоторые рецепторы найдены и в периферических тканях (5-НТ2, 5-НТ3, 5-НТ4) [14]. Так, 5-НТ3-рецепторы обнаружены в парасимпатических нервах, где они регулируют сокращение гладких мышц, деполяризацию постганглионарных волокон
[9]. Агонистом последнего типа рецепторов является 2-метилсеротонин, а антагонистами - гранисетрон, ондансетрон, рензаприд, закоприд и др. [8]. Эффекторной системой, сопряженной с 5-НТ3-рецепторами, выступают ионные каналы. На изолированных фрагментах мембран серотонин вызывает ток, переносящийся катионами. Это означает, что 5-НТ3-рецепторы напрямую связаны с ионными каналами и позволяют серо-тонину участвовать в регуляции транспорта ионов [4]. Локализация и роль других серотониновых рецепторов в периферических тканях изучена крайне недостаточно. Вместе с тем основное количество серото-нина синтезируется в энтерохромаффинных клетках слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, где он накапливается в гранулах [13,15]. Серотонин находится в определенном количестве в плазме крови [11], тромбоцитах, паренхиматозных органах, что предполагает его участие в функциях многих органов и систем [7]. В том числе он оказывает выраженное влияние на функцию почек [12]. При внутривенной инфузии серотонина чаще всего регистрируется антидиуретическая реакция почек
[10]. Такой эффект дает основание считать, что серотонин и серотонинергические структуры могут играть специфическую роль в
регуляции почечной деятельности как в норме, так и при патологии [2]. Однако участие отдельных типов рецепторов, их агонистов и антагонистов в экскреторной функции почек остается неизученным.
Цель настоящей работы - исследовать серотонинергические механизмы формирования экспериментальной острой почечной недостаточности (ОПН) и возможности блокатора серотониновых 5-НТ3-рецеп-торов ондансетрона оказывать нефропро-текторное действие.
Опыты были поставлены на белых беспородных крысах обоего пола массой от 180 до 250 г. У животных под эфирным наркозом удаляли левую почку; почечную артерию и вену правой почки полностью пережимали сосудистым зажимом на 1,5 часа. На 3-и сутки развития постише-мической ОПН после наркотизации крыс производили декапитацию животных, быстрое изъятие почек, крови (1 мл). Каждую почку разрезали пополам, одну половину исследовали в общей массе, из другой - выделяли корковый и мозговой слои. Ткани почек гомогенизировали и помещали в 10% раствор трихлоруксусной кислоты на 30 ми-нут. Кровь сразу заливали трих-лоруксусной кислотой, а затем гомогенат и кровь центрифугировались в течение 15 минут. Супернатант помещали в морозильную камеру с последующим определением в нем серотонина стандартным методом в модификации В. Г. Подковкина (1989) и С. А. Мещеряковой (2000) [3, 5]. По аналогичной методике параллельно проводили анализ содержания серотони-на в тех же объектах при физиологических условиях на интактных животных, у которых для исследования также изымали правую почку и кровь.
Рис.1. Содержание серотонина в почках и крови в норме и при постишемической ОПН. Примечание: контроль - норма, опыт - постишемическая ОПН (3-и сутки). * р<0,05; достоверность различия показателей опыта по отношению к контролю. То же в табл. 1, 2.
р<0,01 -
Для выявления роли в функции почек наиболее вероятного 5-НТ3-рецептора исследован дозозависимый эффект блокато-ра 5-НТ3-рецепторов ондансетрона на экскрецию воды, натрия, калия, креатинина при физиологических условиях. Предварительно животные получали водную нагрузку в количестве 3% от массы тела, после этого их помещали на 4 часа в обменные клетки для сбора мочи. Подопытным крысам одновременно с водной нагрузкой вводили ондансетрон, который инъецировали подкожно в дозах 0,05, 0,1, 0,2, 1,0 и 10,0 мг/кг. Определяли объем выделенной мочи, концентрации натрия и калия методом пламенной фотометрии (ПАЖ-1), креатинина мочи - фотоэлектроколоримет-рическим методом (ФЭК-56М).
Возможный нефропротекторный эффект ондансетрона исследовали в хронических опытах с моделированием пост-ишемической ОПН по вышеописанной методике. Крыс помещали в обменные клетки для сбора мочи на 24 часа в течение 5 суток, при этом ежедневно вводили онда-нсетрон в дозе 0,1 мг/кг, которая у ин-тактных крыс вызывала выраженную экскреторную реакцию. Контрольным животным инъецировали в эквивалентном количестве изотонический раствор натрия
хлорида. Регистрировали те же показатели мочи; кроме того, определяли концентрацию кальция, магния, хлора на автоматическом биохимическом анализаторе "И^асЫ-902" фирмы "Roch-Diagnostics". Параллельно учитывали выживаемость животных в указанном периоде наблюдения. Установлено, что содержание серото-нина в почках крыс в норме равно 13,93±1,20 мкг/г, в корковом слое -11,24± 1,74 мкг/г, мозговом - 3,91± ±0,34 мкг/г, в крови - 0,19±0,01 мкг/г (рис.1). Обращает на себя внимание значительное преобладание (в 2,9 раза) содержания серотонина в кортикальных структурах по сравнению с мозговыми.
Уровень серотонина значительно возрастал в почке (в 1,7 раза), в корковом слое почек (в 1,9 раза) на 3-и сутки постишеми-ческого периода, что является, по-видимому, патогенетическим звеном формирования недостаточности органа. Характерно, что содержание серотонина в мозговом слое при ОПН не изменялось. Параллельно увеличивалось содержание серотонина в крови. Указанные сдвиги можно оценить как следствие гиперпродукции медиатора в почках и выхода его в кровеносное русло.
В результате изучения дозозависимого эффекта ондансетрона на интактных жи-
Таблица 1
Влияние ондансетрона на 4-часовую экскреторную функцию почек интактных крыс
Дозы, мг/кг Диурез, мл Натриурез, мкМ Калиурез, мкМ Экскреция креатинина, мг
контроль опыт контроль опыт контроль опыт контроль опыт
0,05 1,52±0,18 1,56±0,17 114,9± ±11,6 113,6±8,4 81,6±5,7 94,6±9,9 0,41±0,02 0,39±0,02
0,1 1,21±0,04 3,55±0,14* 100,0±4,4 239,9± ±14,7** 64,0±1,8 105,5±5,6** 0,32±0,02 0,49± ±0,02**
0,2 1,26±0,06 2,43± ±0,07** 84,0±3,7 52,3± ±3,5** 44,3±2,3 27,4±1,1** 0,46±0,02 0,29± ±0,02**
1,0 1,08±0,06 1,55± ±0,03** 143,7±4,9 28,6± ±2,1** 105,4±4,5 27,2±2,0** 0,62±0,02 0,31± ±0,02**
10,0 1,67±0,05 1,34± ±0,04** 100,4±5,8 101,7±3,8 54,4±2,5 26,4±1,0** 0,37±0,03 0,37±0,02
Таблица 2
Влияние ондансетрона в дозе 0,1 мг/кг на суточную экскреторную функцию почек крыс в первые 5 дней постишемического периода
Дни Диурез, мл Натриурез, мкМ Калиурез, мкМ Экскреция креатинина, мг
контроль опыт контроль опыт контроль опыт контроль опыт
1-й 1,10±0,20 1,67±0,17* 186,70± ±31,29 281,64± ±37,18 146,97± ±12,43 218,00± ±27,14 2,13±0,37 3,21±0,33
2-й 2,95±0,31 5,71± ±0,39** 287,16± ±33,74 601,63± ±46,04** 177,53± ±27,33 338,18± ±31,98** 2,01±0,25 4,04± 0,33**
3-й 4,68±0,43 6,61±0,51* 505,03± ±62,97 758,13± ±56,74** 239,65± ±19,76 362,70± ±27,61** 3,27±0,19 4,91± 0,32*
4-й 5,46±0,50 5,44±0,48 579,03± ±53,38 567,91± ±50,98 287,76± ±36,95 279,91± ±36,98 4,28±0,34 4,35± 0,31
5-й 6,93±0,73 4,65±0,47* 650,01± ±69,30 433,34± ±50,23* 323,86± ±30,73 217,21± ±23,92* 4,98±0,42 3,34±0,41
вотных установлено, что препарат в минимальной дозе 0,05 мг/кг за 4 часа наблюдения не вызывал существенных сдвигов в водно-электролитном составе мочи крыс (табл .1), однако в дозе 0,1 мг/кг значительно (в 2,9 раза) увеличивал экскрецию воды, в 2,4 раза - натрия, в 1,6 раза - калия, в 1,5 раза - креатинина. Поскольку экскреция воды и натрия увеличивалась в большей степени, чем креатинина, то можно предположить, что усиление выделительной реакции происходит посредством не только усиления клубочковой фльтрации, но и угнетения канальцевой реабсорбции. Увеличение дозы препарата до 0,2 мг/кг приводило к увеличению в 1,9 раза диуреза. В то
же время отмечалось отчетливое угнетение в 1,6 раза натриуреза, в 1,6 раза - калиуре-за, в 1,6 раза - экскреции креатинина. Формировалась противоположная реакция почек на ондансетрон, которая достигала максимума под действием препарата в дозе 1,0 мг/кг массы тела. Наблюдался выраженный антисалурез - снижение в 5,0 раз натриуреза и в 4,0 раза - калиуреза. Экскреция креатинина уменьшалась за это время в 2,0 раза. Вместе с тем диуретическая реакция оставалась увеличенной в 1,4 раза, по-видимому, за счет избирательного угнетения канальцевой реабсорбции воды. При повышении дозы препарата до 10,0 мг/кг отмечалось угнетение диуреза
в 1,3 раза и калиуреза в 2,0 раза, натриу-рез и экскреция креатинина стабилизировались. Таким образом, оптимальной дозой ондансетрона, вызывающей выраженный экскреторный ответ, является 0,1 мг/ кг.
Для выявления нефропротекторного действия ондансетрона при постишемичес-кой почечной недостаточности была использована оптимальная доза препарата, равная 0,1 мг/кг. Оказалось, что ежедневное введение ондансетрона крысам с постишеми-ческой патологией приводит к увеличению диуреза в 1,5 раза по сравнению с таковой у контрольных животных, которым препарат не вводился (табл. 2). Экскреторная реакция увеличивалась на 2-й день: диурез -в 1,9 раза, натриурез - в 2,1, калиурез -в 1,9, креатининурез - в 2,0. Выделительная функция почек у подопытных крыс оставалась усиленной и на 3-й день (диурез - в 1,4 раза, натриурез, калиурез, креатининурез - в 1,5 раза). На 4-й день с учетом гибели животных в контрольной группе различий в функции почек оставшихся в живых крыс и животных подопытной группы не было. В последний день наблюдения отмечался полиурический эффект в контрольной группе (полиурическая форма ОПН); в опытной группе произошла полная нормализация функции почек. Характерно, что закономерности в экскреции кальция, магния, хлора не выявлено. Выживаемость крыс в контроле составила 70%, в опыте - 100%.
Следовательно, преимущественное накопление серотонина в кортикальных структурах свидетельствует о важной роли его в регуляции клубочково-канальцевого аппарата почек при физиологических условиях. Резкое возрастание уровня серо-тонина в корковом слое в разгаре пост-ишемической ОПН указывает на включение серотонинергических механизмов и рецепторов в патогенетические звенья формирования патологии нефронов. В это время падает экскреция креатинина, свидетельствующая о выраженном угнетении клубочковой фильтрации. Есть основание полагать, что падение фильтрационного процесса происходит за счет вазопрессор-ного эффекта медиатора. Значительное
Рис. 2. К гипотезе функционирования почечных пресинаптических 5-НТ3-рецепторов.
угнетение клубочковой фильтрации и приводит к развитию ОПН, угнетению экскреторной функции и гибели животных. Почечную олигурию можно объяснить и увеличением канальцевой реабсорбции, вызванным серотонином, но последний механизм нуждается в специальном изучении. Поэтому актуальной задачей является дальнейший поиск препаратов нефропротекторного действия из соединений, блокирующих серотониновые рецепторы и тем самым уменьшающих неблагоприятное действие серотонина на почечные структуры. Поскольку пресинаптические 5-НТ3-рецепторы найдены в основном в периферических тканях [8], то наиболее вероятно присутствие этих рецепторов и в почечных структурах. В связи с этим мы в своих исследованиях использовали селективный блокатор 5-НТ3-рецепторов ондан-сетрон. Из всех изученных доз препарата только доза 0,1 мг/кг вызывала выраженный диуретический и электролитовыдели-тельный эффекты у интактных животных. Диссоциацию реакции на диурез (в 2,9 раза) и креатининурез (в 1,5 раза) можно связать с неодинаковым воздействием препарата на сосуды клубочков и канальцы нефронов, т.е. ондансетрон значительнее влияет на канальцы, чем на клубочки. Что касается различий реакции почек на введение малых и больших доз, то здесь не исключается наличие в них, по крайней мере, двух типов пресинаптических 5-НТ3-рецеп-торов с противоположными функциями, либо в малых дозах (0,1 мг/кг) ондансет-
рон блокирует рецепторы с положительной обратной связью, а в больших дозах (1 мг/кг) блокирует рецепторы с отрицательной обратной связью (рис. 2).
Для изучения нефропротекторного действия ондансетрона при ОПН использовалась доза, вызывающая выраженную экскреторную реакцию. Блокируя 5-НТ3-рецепторы сосудов и канальцев, препарат оказывает позитивное влияние на сохранность, в первую очередь, кортикальных структур, что приводит к увеличению экскреции электролитов, воды, креатинина, ослаблению ОПН и снижению смертности животных. Следовательно, ондансетрон может представлять интерес для разработки способов использования его в клинике в качестве нефропротекторного средства при ишемическом поражении почек.
ВЫВОДЫ
1. В опытах на крысах установлено, что количество серотонина в корковом слое почек значительно преобладает над его содержанием в мозговом как в норме, так и при постишемической ОПН.
2. Селективный блокатор пресинапти-ческих 5-НТ3-рецепторов ондансетрон оказывает дозозависимое действие на экскреторную функцию почек: в малых дозах стимулирует экскрецию воды, электролитов, креатинина, а в больших - угнетает их выведение.
3. Ежедневное введение ондансетрона в дозе 0,1 мг/кг в первые 5 дней пост-ишемического периода нормализует экскреторную функцию почек и предотвращает развитие ОПН.
ЛИТЕРАТУРА
1. Амелин А.В., Игнатов Ю.Д., Скоромец А.А. Мигрень (патогенез, клиника и лечение). - СПб., 2001.
2. Берхин Е.Б. Фармакология почек и ее физиологические основы. - М., 1979.
3. Биохимические и иммунологические методы оценки регулирующих систем. / Углова М.В., Подковкин В.Г., Суздальцева Т.В. и др. - Куйбышев, 1989.
4. Гилман А. Клиническая фармакология по Гудману и Гилману. / Пер. с англ. - М., 2006.
5. Камышников В.С. Справочник по биохимической лабораторной диагностике. - Минск, 2000.
6. Петров В.И., Пиотровский Л.Б., Григорьев И.А. Возбуждающие аминокислоты. - Волгоград, 1997.
7. Пидевич И.Н. Фармакология серотонино-реактивных структур. - М., 1977.
8. Сазанов Л.А., Зайцев С.В. // Биохимия. - 1992. -№ 10. - С. 1443-1460.
9. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ. -Волгоград, 1999.
10. Физиология почки: Руководство по физиологии. / Под ред. Ю.В. Наточина. - Ленинград, 1972.
11. Aune T.M., Golden H.W., McGrath K.M. // J. Immunol. - 1994. - Vol. 153. - P. 489-498.
12. Berndt T.J, Liang M, Tyce G.M, Knox F.G. // J. Kidney Int. - 2001. - Vol. 59(2). - Р. 625-630.
13. Engelmann B.E., Bindslev N., Poulsen S.S. // J. Basic Clin Pharmacol Toxicol. - 2006. - Vol. 98(2). -Р. 142-149.
14. Darblade B, Behr-Roussel D, Gorny D et al. // World J. Urol. - 2005. - Vol. 23(2). - Р. 147-151.
15. Michel K., Zeller F., Langer R. et al. // J. Gastroenterology. - 2005. - Vol. 128(5). -Р. 1317-1326.
Поступила 19.06.07.
ANALYSIS OF SEROTONINERGIC MECHANISMS OF THE DEVELOPMENT OF ACUTE RENAL FAILURE AND POSSIBLE NEPHRO-PROTECTIVE ACTION OF ONDANSETRON
A.V. Dubischev, E.N. Zaitseva, M.I. Panina Summary
In experiments on rats, a significant preponderance of serotonin content in cortical structures of the kidneys compared with the cerebral was found. The level of serotonin increased in the cortex layer at 3rd day of postischemic acute renal insufficiency with stable level of its concentration in the cerebral layer. Usage of selective presynaptic serotonin receptor blocker, ondansetron, during postischemic acute renal failure leads to a higher excretion of water,electrolytes, creatinine, prevents the further development of pathology apparently due to normalization of cortical function structures.
