CC BY
36
УДК 639.303.45:535.21: 577.3
АНАЛИЗ ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ ГИБРИДА БЕСТЕРА ПОД ВЛИЯНИЕМ ОПТИЧЕСКОГО ИЗЛУЧЕНИЯ НИЗКОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ
Н. В. БАРУЛИН
УО «Белорусская государственная сельскохозяйственная академия», г. Горки, Могилевская обл., Республика Беларусь, 213407
(Поступила в редакцию 01.02.2015)
Введение. Государственной программой развития рыбохозяйст-венной деятельности на 2011-2015 годы предусмотрено значительное увеличение объемов выращивания товарной рыбы, т. ч. ценных видов рыб за счет внедрения инновационных методов в технологию акваку-льтуры [15, 17]. Интенсивное выращивание объектов аквакультуры сталкивается с проблемой нарушений воспроизводительной функции ценных видов рыб, в т. ч. и осетровых рыб [1, 5]. В связи с этим возникла необходимость в разработке эффективных методов повышения функции воспроизводства, в т. ч. и за счет использования нетрадиционных методов воздействия. Одним из таких методов является низкоинтенсивное оптическое излучение [6, 18].
Сперматозоиды являются популярным биологическим объектом для оценки влияния факторов физической и химической природы на качество мужских половых продуктов. Так, увеличение срока хранения спермы индейки наблюдалось при добавлении витаминов Е и С [10], а введение цианокобаламина в криозащитную среду на начальных этапах криоконсервации спермы русского осетра повышает выживаемость и время движения сперматозоидов [3]. Воздействие на сперму человека рентгеновским излучением угнетало, ультрафиолетовым излучением не влияло [9], а инфракрасным излучением и электромагнитным полем повышало подвижность сперматозоидов [4]. Воздействие гамма-излучением на сперматозоиды крысы оказывало негативное влияние [19], а воздействие лазерным излучением красной области спектра повышало качество спермы индейки и собаки [8]. Кроме того, воздействие на сперму телапии светом белой, а также красной областей спектра приводило к повышению подвижности сперматозоидов. Воздействие светом синей и ультрафиолетовой областей спектра оказывало отрицательный результат [14]. Приведенные данные свидетельствуют о способности лазерного излучения и других источников света оказывать влияние на качество мужских половых продуктов.
11
Известен способ обработки спермы рыб для ее стимуляции, основанный на воздействии на сперму перед оплодотворением лазерным излучением красной и/или инфракрасной спектральной области. Время экспозиции выбирают не менее 10 с при энергетической дозе 1 мДж/см2-2,5 Дж/см2 [2]. Как следует из описания [2], в аналоге в качестве источника излучения используется либо гелий-неоновый лазер красной области спектра с длиной волны X = 632,8 нм, работающий в непрерывном режиме, либо импульсный лазер «Узор» инфракрасной области спектра с длиной волны X = 890 нм. Недостатком известного способа является низкий стимулирующий эффект. Известен также способ обработки спермы рыб и животных [14], основанный на воздействии на сперматозоиды перед оплодотворением непрерывным оптическим излучением одного из источников: белым светом светодиодного источника в спектральном диапазоне 400-800 нм при плотности мощности 40 мВт/см2 в течение 1-15 мин.; красным светом светодиодного источника с длиной волны 660 нм при плотности мощности 10 мВт/см2 в течение 1-15 мин.; ультрафиолетовым излучением лампы с длиной волны 360 нм при плотности мощности 1,5 мВт/см2 в течение 1-15 мин.; ультрафиолетовым излучением лампы с длиной волны 294 нм при плотности мощности 0,1 мВт/см2 в течение 10-75 с. Недостатками известного способа являются: ингибирование оплодотворяющей способности спермы при воздействии на сперматозоиды ультрафиолетового излучения. Во всем диапазоне воздействующих доз с длиной волны 294 или 360 нм наблюдается снижение ее активности по сравнению с контрольными (интактными) образцами, не подвергающимися действию излучения; низкое стимулирующее действие на активность сперматозоидов непрерывного излучения видимой области спектра с длиной волны 660 нм (красный диапазон) или белого света в спектральном диапазоне 400-800 нм, а также необходимость длительного воздействия (5-10 мин.) для получения оптимального стимулирующего эффекта, что снижает производительность процесса и увеличивает вероятность нарушения режима стерильности.
Цель работы - исследование влияния поляризованного оптического излучения с длиной волны 450-1270 нм, модулированным по интенсивности частотой 50-60 Гц на сперматозоиды осетровых рыб.
Материал и методика исследований. Исследования выполнялись на кафедре ихтиологии и рыбоводства УО БГСХА и в ГНУ «Институт физики им. Б. И. Степанова НАН Беларуси». Производственные исследования выполнялись в рыбном цеху осетрового завода «Аквато-
12
рия», на базе фермерского хозяйства «Василек» (д. Наквасы, Путчин-ский с/с, Дзержинский район, Минская обл.).
В качестве объекта исследований была выбрана сперма самцов гибрида бестера (Р1), выращенных от стадии личинки до половозрелого состояния в условиях установки замкнутого водоснабжения (частное хозяйство «Акватория», фермерское хозяйство «Василек», Минская обл.). Возраст самцов - 5 лет, средняя масса - 7,5 кг, средняя длина - 97,5 см.
Работа с самцами включала следующие этапы: осенняя бонитировка, зимовка производителей, весенняя бонитировка, преднерестовое выдерживание производителей, гормональная стимуляция нереста производителей, получение зрелых половых продуктов. Самцов отбирали осенью для возможного использования в воспроизводстве с гонадами, находящимися в Ш-ГУ и IV стадиях зрелости. Осеннюю бонитировку маточного стада и старшего ремонта проводили при снижении температуры воды до 12 °С, при которой рыбу прекращали кормить. Для отбора зрелых самцов при осенней бонитировке использовали метод определения стадий зрелости гонад при помощи неинвазивного экспресс-метода УЗИ [8]. Перевод производителей в режим зимовальных температур производили постепенно с температурным градиентом 2-3 °С - для самцов. Температурный режим во время зимовки самцов составлял 4-5 °С. При этом допускалось кратковременное повышение температуры до 7 °С и ее понижение до 2 °С. Перевод в нерестовый режим был постепенным: с суточным градиентом при повышении температуры не более 2-3 °С, с периодами содержания при постоянной температуре.
Во время весенней бонитировки основным требованием к режиму преднерестового содержания самцов являлось сохранение их репродуктивных качеств. Поскольку самцы обычно готовы к нересту уже при кратковременном выдерживании при нерестовых температурах, наиболее эффективным приемом сохранения их репродуктивных качеств являлось содержание при невысоких температурах. Для стимулирования созревания самцов применяли суперактивный синтетический аналог гонадотропин-релизинг-гормона млекопитающих ^пКНа, сурфа-гон). Для инъекций использовали медицинские шприцы. Инъекцию производили в спинные мышцы между спинными и боковыми жучками на уровне 3-5 спинной жучки. При введении препарата в мышечные ткани соблюдали осторожность и следили за тем, чтобы рыба при сжатии мышц не вытолкнула препарат. Отбор спермы осуществляли при помощи катетера и пластикового шприца Жане. Средний объем полученного эякулянта 110 см3. Температура воды в период взятия
13
половых продуктов составляла 14,5 °С. Вся отобранная сперма оценивалась в 5 баллов по 5 бальной шкале Персова. Температура воды соответствовала температуре эякулята. Перед получением спермы производители обтирали полотенцем или марлевой салфеткой, особенно тщательно вытирали место у анального отверстия, а также анальный и хвостовой плавники. При этом следили, чтобы в пробирку не попали вода, полостная жидкость или экскременты рыбы. Пробирки со спермой ставили в холодильник или в холодное затененное место.
Подвижность сперматозоидов исследовали на тринокулярном (тип Зидентопфа) биологическом микроскопе проходящего света серии MMC-KZ-900 с независимой планахроматической оптической системой на бесконечность F=200 мм. Для анализа подвижности использовали счетные камеры с фиксированной глубиной марки Leja. Запись подвижности сперматозоидов осуществляли при помощи видеокамеры MMC-31C12-M, построенной на основе сенсора компании Aptina. Частота кадров в секунду - 12 к/с при разрешении 2048*1536, 60 к/с при 800x600, 95 к/с при 640*480, 135 к/с при 512*384. Для исследований качества спермы использовали автоматизированное программное обеспечение ММС Сперм, которое представляло собой основу для компьютерного спермоанализатора (CASA). Оценка концентрации сперматозоидов и анализ их подвижности производился на видеоклипах в формате AVI (захваченных в память компьютера или записанных на жесткий диск) на основе алгоритма анализа с учетом требований руководства Всемирной организации здравоохранения [20].
В качестве анализируемых параметров мы использовали следующие показатели, получившие распространение при исследовании подвижности сперматозоидов человека в медицинских исследованиях [20]: VCL - криволинейная скорость (микрон/сек.), усредненная по времени скорость движения сперматозоида вдоль его реальной траектории, как она воспринимается в двухмерном пространстве под микроскопом; VSL - прямолинейная скорость (микрон/сек.), усредненная по времени скорость движения сперматозоида вдоль линии, проведенной между начальной и конечной точкой траектории; VAP - средняя скорость движения по траектории (микрон/сек.), усредненная по времени скорость движения сперматозоида по усредненной траектории; WOB -колебание (величина, описывающая колебание реальной траектории относительно усредненной VAP/VCL); LIN - линейность (линейность реальной траектории).
Для исследования подвижности сперматозоидов пробу разбавляли активирующей средой в соотношении 1:50. Состав активирующей среды: 10 мм NaCl, 1 мМ CaCl2,10 мМ Трис рН 8,5 [7]. Для исследований допускались образцы, подвижность которых превышала 90 %. Для предотвращения прилипания сперматозоидов, предметные стекла обрабатывались 1 % сывороточным альбумином. В каждом видеоклипе оценивалось от 20 до 70 сперматозоидов. Сперматозоиды со скоростью менее 3 мкм/сек. считались неподвижными и исключались из расчета подвижности. По результатам полученных данных определяют величину стимулирующего действия физических факторов на показатели подвижности сперматозоидов.
После воздействия на сперму оптическим излучением она помещалась на хранение в прохладное затемненное место. Температура хранения не выше 4-5 °С. По истечении 24 ч проводилось определение подвижности сперматозоидов. Контрольные образцы икры выдерживали в тех же условиях, что и опытные.
Для статистической обработки использовали компьютерные статистические пакеты STATISTICA 8, BioStat 2009, OriginPro 8, Stat Plus 2007. Для соблюдения условий возможности применения параметрических статистических методов мы осуществляли проверку анализируемых данных на подчинение закону нормального распределения (распределение Гаусса). Проверку гипотезы о равенстве генеральных дисперсий проводили с помощью U-критерия Манна-Уитни для независимых переменных. Для проверки гипотезы об отсутствии различий между сравниваемыми группами в целом использовали параметрический однофакторный дисперсионный анализ, при условии нормального распределения анализируемого признака и однородности дисперсий. Для оценки различия показателей у исследовательских групп, использовали методы множественных сравнений (критерий Ньюмена-Кейлса) при условии нормального распределения и независимости выборок. В случае несоблюдений условий нормальности распределения использовали дисперсионный анализ Фридмана (для зависимых выборок) или H-тест Крускала-Уоллиса (в других вариантах) с использованием медианного теста [11, 12].
Результаты исследований и их обсуждение. Воздействие осуществляли модулированным по интенсивности поляризованным излучением лазерных или светодиодных источников в спектральном диапазоне от 450 до 1270 нм, плотностью мощности P = 0,5-100 мВт/см2, частотой модуляции F = 50-60 Гц. Излучатель аппарата располагали
15
таким образом, чтобы размер светового пятна соответствовал размеру слоя облучаемой спермы. Мощность излучения (W) на выходе излучателя контролировали с помощью измерителя средней мощности ИМО-3С. Плотность мощности (P, мВт/см2) излучения, воздействующего на слой спермы, определяли по формуле: P = W/S, где W - средняя мощность излучения в мВт; S - площадь светового пятна в см2 на уровне слоя спермы. Энергетическую дозу (E, мДж/см2) определяли по формуле: E = Pt, где t - время облучения в секундах.
В результате наших исследований установлено, что воздействие на сперму самцов осетровых рыб модулированным оптическим излучением приводило к повышению активности сперматозоидов, что выражалось в увеличении подвижности сперматозоидов после активации. Вышесказанное подтверждалось данными, представленными в табл. 1-3.
Т а б л и ц а 1. Влияние поляризованного оптического излучения с длиной волны 450 нм в различных энергетических дозах и режимах воздействия на параметры подвижности сперматозоидов самцов осетровых рыб (указаны максимальные величины стимулирующего действия для каждой плотности мощности)
Группы Время облучения, t, с Плотность мощности, P, мВт/см2 Энергетическая доза, Е, мДж/см2 Величина стимулирующего действия, у, %
Контроль 0 0 0 100
Непрерывное излучение 180 0,5 90 119,0±2,2*
30 3,0 90 132,2±7,6*
0,9 100 90 115,0±1,2*
Излучение, 240 0,5 120 107,0±4,8*
модулиро- 40 3,0 120 118,9±11,2*
ванное с
частотой Р = 5 Гц 1,2 100 120 103,5±7,5*
Излучение, 180 0,5 90 121,7±1,2*
модулиро- 30 3,0 90 135,3±1,3*
ванное с
частотой Р = 50 Гц 0,9 100 90 117,7±4,5*
Излучение, 180 0,5 90 119,8±5,0*
модулиро- 30 3,0 90 133,1±3,8*
ванное с
частотой Р = 60 Гц 0,9 100 90 115,8±1,2*
Излучение, 180 0,5 90 114,7±4,2*
модулиро- 30 3,0 90 127,4±14,3*
ванное с
частотой Р = 100 Гц 0,9 100 90 110,9±1,9*
Примечание: *- статистический уровень значимости, P <0,05.
16
Т а б л и ц а 2. Влияние поляризованного оптического излучения с длиной волны 670 нм в различных энергетических дозах и режимах воздействия на время активности сперматозоидов самцов осетровых рыб (указаны максимальные величины стимулирующего действия)
Группы Время облучения, г, с Плотность мощности, Р, мВт/см2 Энергетическая доза, Е, мДж/см2 Величина стимулирующего действия, у, %
Непрерывное излучение 40 3,0 120 216,7±6,4*
Излучение, модулированное с частотой Р = 5 Гц 40 3,0 120 137,8±9,6*
Излучение, модулированное с частотой Р = 50 Гц 40 3,0 120 225,5±4,3*
Излучение, модулированное с частотой Р = 60 Гц 240 0,5 120 264,8±2,4*
Излучение, модулированное с частотой Р = 100 Гц 40 3,0 120 204,8±10,1*
Примечание: *- статистический уровень значимости, Р <0,05.
Из представленных данных следует, что воздействие непрерывного лазерного излучения в спектральном диапазоне от 450 до 1270 нм приводит к повышению качества половых продуктов, что проявляется в увеличении подвижности после их активации. Увеличение длины волны воздействующего излучения свыше 1270 нм являлось нецелесообразным в связи с тем, что в области ~1300 нм наблюдалось поглощение излучения водой, что могло приводить к термическому повреждению сперматозоидов. Использование излучения с длиной волны короче 450 нм является нецелесообразным, так как в этом случае стимулирующее действие слабо выражено и зачастую наблюдается ингибиро-вание активности клеток спермы.
Выполненные исследования (табл. 1-3) показали, что фотобиологическое действие на сперматозоиды зависит как от длины волны воздействующего излучения, так и от его плотности мощности, энергетической дозы и частоты модуляции.
Максимальное стимулирующее действие света на сперму рыб регистрировалось при плотности мощности Р = 0,5-100 мВт/см2 и энергетической дозе 60-180 мДж/см2. Снижение плотности мощности ниже
17
0,5 мВт/см2 является нецелесообразным, так как в этом случае наблюдалось снижение стимулирующего эффекта, а кроме того, для набора энергетической дозы 60-180 мДж/см2 длительность воздействия могла превышать t = 600 сек. (10 мин.), что снижало производительность процесса и увеличивало вероятность нарушения режима стерильности. Повышение плотности мощности свыше 100 мВт/см2 также являлось нецелесообразным, так как в этом случае можно вызвать термическое повреждение сперматозоидов, что приводило к эффекту ингибирова-ния их активности. Установлено, что применение режима модуляции излучения в зависимости от ее частоты способно как повысить стимулирующий эффект, характерный для непрерывного излучения, так и снизить его.
Т а б л и ц а 3. Влияние поляризованного оптического излучения с длиной волны 1270 нм в различных энергетических дозах и режимах воздействия на время активности сперматозоидов самцов осетровых рыб (указаны максимальные величины стимулирующего действия)
Группы Время облучения, 1 с Плотность мощности, Р, мВт/см2 Энергетическая доза, Е, мДж/см2 Величина стимулирующего действия, у %
Непрерывное излучение 30 3,0 90 199,5±13,2
Излучение, модулированное с частотой Р = 5 Гц 30 3,0 90 140,5±13,2
Излучение, модулированное с частотой Р = 50 Гц 30 3,0 90 210,5±11,2
Излучение, модулированное с частотой Р = 60 Гц 0,9 100 90 269,1±1,6
Излучение, модулированное с частотой Р = 100 Гц 30 3,0 90 200,7±14,9
Примечание: * - статистический уровень значимости, Р <0,05.
Как следует из табл. 1-3, при воздействии излучения, модулированного низкой частотой (Р = 5 Гц), стимулирующий эффект ниже,
18
чем при непрерывном воздействии. При увеличении частоты модуляции происходило увеличение величины стимулирующего эффекта, который достигал своего максимума при Р = 50-60 Гц. При дальнейшем увеличении частоты модуляции до Р = 100 Гц эффект стимуляции светового воздействия мало отличался от такового при использовании непрерывного (смодулированного) излучения. Поэтому повышение или снижение частоты модуляции света за пределы Р = 50-60 Гц являлось нецелесообразным.
Установлено, что сперма, подвергнутая действию лазерного излучения при оптимальных параметрах (длина волны излучения в спектральном диапазон от 450 до 1270 нм, плотность мощности Р = 0,5100 мВт/см2, энергетическая доза Е = 60-180 мДж/см2), обладала более высокой способностью к оплодотворению икры. Увеличение (по сравнению с контролем) времени подвижности сперматозоидов в результате воздействия оптического излучения характеризует улучшение качества спермы, поскольку это приводит к более высокой вероятности успешного оплодотворения икры. И наоборот, снижение (по сравнению с контролем) времени подвижности сперматозоидов в результате воздействия оптического излучения отражает снижение качества спермы. Так если в случае использования интактой (контрольный вариант) спермы процент оплодотворения икры осетровых рыб составлял 72 %, то в случае использования спермы, обработанной заявляемым способом, процент оплодотворения икры достигал 90 %.
Заключение. Описываемый способ позволял увеличить время подвижности сперматозоидов после активации водой и повысить вероятность успешного оплодотворения икры. Данный способ может использоваться в практике осетроводства с целью сохранения качества спермы самцов при длительном хранении без консервации в условиях, когда сбор спермы самцов уже осуществлен, а овуляции икры самок растягивается на продолжительное время.
Исследования выполнены при финансовой поддержке Белорусского фонда фундаментальных исследований (проект Б14М-101).
ЛИТЕРАТУРА
1. Б а р у л и н, Н. В. Комплекс диагностического мониторинга физиологического состояния ремонтно-маточных стад осетровых рыб в установках замкнутого водоснабжения / Н. В. Барулин // Вестник Государственной полярной академии. - 2014. - № 1 (18). -С. 19-20.
2. Патент Российской Федерации 2035858, 1995.
19
3. Подбор криопротекторов и оптимизация режимов охлаждения спермы русского осетра при криоконсервации / Е. Н. Пономарева [и др.] // Вестник КБГУ. Биологические науки. - 2006. - Вып. 8. - С. 66-69.
4. Apreliminary study of oscillating electromagnetic field effects on human spermatozoon motility / R. Iorio [et al.] // Bioelectromagnetics. - 2007. - Vol. 28. - № 1. - P. 72-75.
5. B a r u l i n, N. V. Diagnostyka stanu fizjologicznego stada selektow i tarlakow sterleta (Acipenser ruthenus L.) w systemach recyrkulacyjnych / N. V. Barulin // Aktualny stan i ochrona naturalnych populacji ryb jesiotrowatych Acipenseridae. - Olsztyn. 250 p. - P. 197-202.
6. B a r u l i n, N. V. Effect of Polarization and Coherence of Optical Radiation on Sturgeon Sperm Motility / N. V. Barulin, V. Y. Plavskii // International Journal of Biological, Veterinary, Agricultural and Food Engineering. - Vol:6. - No: 7, 2014. - P. 86-90.
7. D z y u b a, B. Spontaneous activation of spermatozoa motility by routine freeze-thawing in different fish species / B. Dzyuba, S. Boryshpolets, M. Rodina // J. Appl. Ichthyol. -No: 26. - P. - 720-725.
8. Effect of 655-nm diode laser on dog sperm motility / M. I. Corral-Baques [et al.] // Lasers Med Sci. - 2005. - Vol. 20. - №2 1. - P. 28-34.
9. Factors affecting sperm motility. III. Influence of visible light and other electromagnetic radiations on human sperm velocity and survival / A. Makler [et al.] // Fertil Steril. - 1980. -Vol. 33, № 4. - P. 439-444.
10. F a u v e l, C. Evaluation of fish sperm quality / C. Fauvel, M. Suquet, J. Cosson // Journal of Applied Ichthyology. - 2010. - Vol. 26, Iss. 5. - P. 636-643.
11. G l a n t z, S. A. Primer of Biostatistics. / S. A. Glantz. - McGraw-Hill: New York., 2011. - 320 p.
12. H i l l, T. Statistics: Methods and Applications / T. Hill, P. Lewicki. - StatSoft, Inc., 2005. - 800 p.
13. Improvement of stored turkey semen quality as a result of He-Ne laser irradiation / N. Iaffaldano [et al.] // Anim Reprod Sci. - 2005. - Vol. 85, № 3-4. - P. 317-325.
14. Influence of Visible Light and Ultraviolet Irradiation on Motility and Fertility of Mammalian and Fish Sperm / T. Zan-Bar [et al.] // Photomedicine and Laser Surgery. -2005. - Vol. 23, № 6. - P. 549-555.
15. K o s to us ov, V. G. Development of industrial fish culture in Belarus / V. G. Kostousov, N. V. Barulin // Recirculation technologies in indoor and outdoor systems. HANDBOOK. Research Institute for Fisheries, Aquaculture and Irrigation - Szarvas, 2013. -P. 44-48.
16. Low energy narrow band non-coherent infrared illumination of human semen and isolated sperm / R. Singer [et al.] // Andrologia. - 1991. - Vol. 23, № 2. - P. 181-184.
17. N i e l s e n, P. Feasibility case study in Belarus on the feasibility of Danish recirculation technology/ P. Nielsen, M. Naukkarinen, A. Roze // Helsinki, Finnish Game and Fisheries Research Institute. - 2014. P. 95.
18. P l a v s k i i, V. Y. Regulatory action of laser radiation of red and near infrared spectral regions on the zooplankton Artemia salina L. / V. Y. Plavskii, N. V. Barulin // Advances in Optics Photonics Sectroscopy & Applications VII. - P. 774-777.
19. Radiation exposure exerts its adverse effects on sperm maturation through estrogen-induced hypothalamohypophyseal axis inhibition in rats / M. J. Makinta [et al.] // African Zoology. - 2005. - Vol. 40, № 2. - P. 243-251.
20. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Fifth edition. World Health Organization. - 2010. - 271 p.
