CC BY
30о. в. демешко1, А. П. домарев2, в. н. ковалев1, с. в. ковалев1, в. Л. дубоносов2, Л. в. кричковская2, в. в. Погребняк1
анализ перспективных лекарственных растений для создания антиоксидантного лечебно-профилактического
фитосбора
Национальный фармацевтический университет, г. Харьков, украина Национальный технический университет «Харьковский политехнический
институт», г. Харьков, украина
Лекарственные растения являются источником различных биологически активных соединений. Полифенолы, витамин С, а также макро- и микроэлементы выполняют важную функцию в защите организма человека от активных форм кислорода при развитии оксидативного стресса. Изучена антиоксидантная активность, микро- и ма-кроэлементный состав листьев: иван-чая, смородины черной, земляники садовой, ежевики сизой, вистерии китайской. Антиоксидантная активность фитосбора составила 116,5 мг/г. Методами атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией вещества (спектрометр IСЕ 3500) и атомно-эмиссионной спектроскопии (спектрограф ДФС - 8) в листьях изучаемых лекарственных растений определены следующие элементы: Mg, Р, К, Са, Сг, Мп, Fe, Си, Se, Zn, Si, А1, Мо, N1, ^, Sr. Содержание основных групп биологически активных соединений в фитосборе составляет: аскорбиновой кислоты - 1,60 %, флавоноидов - 10,68 %, оксикоричных кислот - 2,39 %, свободных органических кислот - 12,59 %, дубильных веществ - 12,47 %.
ключевые слова: аскорбиновая кислота, флавоноиды, оксикоричные кислоты, органические кислоты, дубильные вещества, антиоксидантная активность, макро-и микроэлементы, фитосбор.
введение
Эндогенные антиоксидантные системы не всегда могут защитить человека от развития оксидативного стресса. Следовательно, необходимо найти активаторы, которые обладают положительным влиянием на окислительно-восстановительные реакции в клетке, то есть обеспечивают эквивалентами атомов водорода дыхательную цепь митохондрий, а также включают механизмы, направленные на поддержание физиологических параметров гоме-остаза [1, 2]. В этом плане заслуживают внимания лекарственные растения, содержащие различные биологически активные вещества (фенолокислоты, флавоноиды, антоцианы, дубильные вещества, полифенолы и др.), обладающие высокой анти-оксидантной активностью и отсутствием побочных эффектов. В настоящее время накоплен значительный экспериментальный материал, который свидетельствует о взаимосвязи антиоксидантной активности (АОА) фенольных соединений с их структурой, а также способности флаво-ноидов связывать ионы тяжелых металлов с образованием стойких комплексов или
взаимодействовать с высокоактивными свободными радикалами, выступать донорами атомов водорода, останавливать цепь окислительных реакций и проявлять антирадикальную активность [3-5].
Фенольные антиоксиданты растений обладают противовоспалительным, антирадикальным, гепатопротекторным действием, что делает их применение эффективным при лечении сердечно-сосудистых, эндокринных и других заболеваний [6, 7].
Важным компонентом для повышения резистентности организма человека, кроме фенольных антиоксидантов, являются микро- и макроэлементы, которые, связываясь с ферментами, витаминами, гормонами, аминокислотами, принимают участие в окислительно-восстановительных реакциях, а такие элементы как Fe, Си, Zn, Р, К, Mg, Мп, Са регулируют кислотно-щелочной баланс, обеспечивают постоянство осмотического давления и нормализуют работу желудочно-кишечного тракта [1]. Mg и К незаменимы для нормальной работы сердечной мышцы, Са принимает участие в передаче нервных импульсов и в регулировании функции эндокринной и
сердечно-сосудистои систем, а комплекс минеральных элементов Mg, Cr, Mn, Zn, Se необходим для процесса выработки поджелудочноИ железоИ инсулина. Mn выполняет роль кофактора для ферментов, принимающих участие в реакциях фос-форилирования, препятствует свободно-радикальному окислению, обеспечивает стабильность структур клеточных мембран, участвует в обмене витаминов С, Е и группы В.
Актуальной задачеИ является исследование лекарственных растений с достаточно обеспеченной сырьевой базой и обладающих антиоксидантноИ активностью.
Цель работы - определение состава эс-сенциальных макро- и микроэлементов и интегрального значения антиоксидантной активности травы иван-чая (Chamaener-ion angustifolium L), листьев смородины черной (Ribes nigrum L.), земляники садовой (Fragaria vesca Duchs), ежевики сизой (Rubus caesius L.), вистерии китайской (Wisteria sinensis Sweet) для создания на их основе антиоксидантного фитосбора.
МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследуемый фитосбор состоит из 5 видов лекарственного растительного сырья: травы иван-чая (Chamaenerion angustifolium L.), листьев смородины черной (Ribes nigrum L.), земляники садовой (Fragaria vesca Duchs), ежевики сизой (Rubus caesius L.), вистерии китайской (Wisteria sinensis Sweet), кусочки которых проходят сквозь сито 3-5 мм. Фрагменты листьев имеют цвет от светло-зеленого до зеленого и темно-зеленого, также встречаются кусочки оранжевого цвета. Части травы иван-чая - светло-зеленые, венчики - сине-фиолетового цвета. Сбор имеет специфический запах. Вкус - горьковато-вяжущий.
Образцы сырья собраны в Крыму и на территории ботанического сада НФаУ (Харьков). Для оценки антиоксидант-ной активности (АОА) использовали 1,0 г сухого сырья каждого компонента фитосбора. Фенольные вещества из лекарственного сырья извлекали водой, объем экстрагента 30 см3, время экстракции 30 мин, в колбе с обратным холодильником на кипящей водяной бане. Антиоксидант-ную активность экстрактов, полученных
из сырья, определяли потенциометриче-ским методом [8] с применением медиа-торной системы К3^е(СК)]/К4^е(СК)]6 в электрохимической ячейке с платиновым электродом (ЭПЛ-02) и хлоридсеребря-ным электродом (ЭВЛ-1М4), вольтметр В2-34. Электрохимическая ячейка - это стеклянная ячейка объемом 20 см3, в которой находится К, ^-буферный раствор (рН = 7,40), а также медиаторная система - растворы К3^е(СК)]6 и К4^е(СК)]6, раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки. Анализируемый объем экстракта помещают в электрохимическую ячейку и с помощью вольтметра контролируют изменение потенциала восстановления для реакции Fe3+^Fe2+, то есть изменение аналитического сигнала (Е, мВ). Величина аналитического сигнала пропорциональна содержанию био-флаваноидов (Сх), которые могут отдать атомы водорода (е-, Н+), необходимые для реакции восстановления Fe3+^Fe2+. Количественную оценку АОА выполняют с применением стандартного образца (галловая кислота), интервал концентраций 1,7-0,021 мг/см3, заданная концентрация стандартов необходима для построения градуировочной прямой и определения значения С (рисунок 1).
Рисунок 1. - График изменения потенциала восстановления (Е, мВ) для калибровочных растворов галловой кислоты (С, мг/см3)
Интегральное значение АОА (мг/г) определяют по формуле (1):
АОА=Ул «С -У/У-т-1 , (1)
А х 1 А 5 4 у
где УА - объем образца для анализа, см3; Сх - значение АОА по градуировоч-ной прямой, мг/см3; У1 - общий объем
анализируемого образца, см3; V1/VA - разбавление; т - масса анализируемого образца, г.
В антиоксидантном лечебно-профилактическом фитосборе определяли количественное содержание аскорбиновой кислоты и свободных органических кислот титриметрическим методом (ГФ XI) [9], дубильных веществ в пересчете на пирогаллол, флавоноидов в пересчете на рутин, оксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту по методикам Государственной фармакопеи Украины (ГФУ) [10].
Качественный состав и количественное содержание микро- и макроэлементов в исследуемых образцах определяли на спектрографе ДФС-8 методом атомно-аб-сорбционной спектроскопии (ААС) при испарении пробы из кратера электрода в разряде дуги переменного тока (дуга переменного тока 16 А, и = 220 В, экспозиция 60 с, атомизатор ИВС - 28) [11]. Регистрацию излучения проводили в области 240 -347 нм, измерение интенсивности спектральных линий выполнено на микрофотометре МФ-4, для определения элементов применяли стандартные образцы С111-14 (ГСО 2820 - 83). Согласно результатам фотометрического анализа стандартных образцов строили градуировочную кривую I = f (С) для каждого определяемого элемента. Массу сухого образца для анализа методом АаС - 1,0 г, минерализацию образца определяли при температуре 500 0С согласно статье 2.4.14 ГФУ [10].
Определение селена ^е) в фитосборе проводили методом атомно-абсорбцион-ной спектрометрии с электротермической атомизацией пробы и применением Зее-мановской коррекции фона на спектрометре ЮЕ 3500 с электротермическим атомизатором GF95Z [12]. Условия атом-но-абсорбционного определения селена: аналитическая линия 196,0 нм, ширина щели 0,5 нм, ток лампы 80 %. Режим тем-пературно-временной программы работы электротермического анализатора при градуировке и анализе образца фитосбора (температура - время): высушивание -110 0С, 30 с; озоление - 1000 0С, 25 с; ато-мизация - 2500 0С, 3 с; очистка 2600 0С, 3 с. Измеряется изменение интенсивности излучения линии внешнего источника, что обусловлено поглощением атомов селена. Прибор, согласно заданному алгоритму
анализа, проводит измерения холостого раствора, раствора пробы без добавки определяемого элемента, раствора пробы с добавками определяемого элемента ^е) и строит градуировочную прямую по методу добавок, градуировочный диапазон 2-15 мкг/л. Содержание селена в анализируемом образце определяли по формуле (2):
Х (ррт) = V • С* N т • 1000, (2)
где С - концентрация Se (мкг/л) в исследуемом растворе; V - объем исходного раствора (мл); N - разведение; т - масса образца (г).
Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методам, доверительный интервал вычисляли с применением коэффициента Стьюдента [13].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты анализа АОА экстрактов листьев смородины черной, ежевики сизой, земляники садовой, вистерии китайской и травы иван-чая приведены в таблице 1. Наибольшую антиоксидантную активность проявили экстракты из листьев ежевики сизой и земляники садовой -65,84 ± 0,93 и 61,23 ± 0,34 мг/г соответственно. АОА для экстрактов листьев смородины черной составила 43,15 ± 0,79 мг/г, травы иван-чая 53,68 ± 0,92 мг/г, меньшая активность выявлена для экстракта листьев вистерии китайской - 6,0 ± 0,79 мг/г. Антиоксидантная активность фитосбора составила 116,47 ± 0,36 мг/г.
Фенольные соединения растений, в частности флавоноиды, оказывают огромное влияние на редокс-статус биологической системы, так как способны изменять метаболизм клеток и их функциональное
Таблица 1. - Антиоксидантная активность экстрактов листьев, травы и фитокомплекса, мг/г
Сырье АОА, мг/г
Смородина черная 43,15 ± 0,79
Иван-чай 53,68 ± 0,92
Ежевика сизая 65,84 ± 0,93
Земляника садовая 61,23 ± 0,34
Вистерия китайская 6,0 ± 0,79
Антиоксидантный фитосбор 116,47 ± 0,36
состояние в процессе развития оксидатив-ного стресса [14]. В связи с этим было дополнительно определено количественное содержание основных групп биологически активных веществ (БАВ) в фитосборе (таблица 2). Основную группу БАВ фитосбора представляют флавоноиды и дубильные вещества - 10,68 ± 0,25 % и 12,47 ± 0,33 % соответственно. Содержится значительное количество свободных органических кислот - 12,59 ± 0,31 %. Содержание оксико-ричных кислот - 2,39 ± 0,06 %, аскорбиновой кислоты - 1,60 ± 0,03 %.
Аскорбиновая кислота, как известно, -гидрофильный антиоксидант, который обладает высокой активностью в нейтрализации радикалов кислорода в организме человека. Биологическую эффективность аскорбиновой кислоты можно объяснить образованием комплекса в виде аскорбиновой кислоты, полугидроаскорбиновой кислоты и дегидроаскорбиновой кислоты в присутствии глутатиона. Этот комплекс выполняет роль редокс-буфера, функцией
которого является нейтрализация радикалов кислорода [15, 16]. Необходимо также отметить, что флавоноиды (PhOH) антиок-сидантного фитосбора могут участвовать в реакциях регенерации дегидроаскорбата (А) и аскорбат анион-радикала (Л*1), образовавшихся из аскорбиновой кислоты (АН2) [17]:
Л + PhOI^ PhO•+ Л*1 Л*1 + PhOI + 2Н+^ PhO• + ЛН2
Это указывает на синергизм действия флавоноидов и АН2 [18, 19] при регулировании окислительно-восстановительных процессов.
Лекарственные растения являются одним из основных природных источников макро- и микроэлементов, которые жизненно необходимы человеку. Изучен качественный и количественный состав минеральных элементов в листьях исследуемых растений и фитосборе. Результаты приведены в таблице 3.
Таблица 2. - Количественное содержание основных групп БАВ в антиоксидантном фитосборе
Флавоноиды, % Оксикоричные кислоты, % Свободные органические кислоты, % Дубильные вещества, % Аскорбиновая кислота, %
10,68 ± 0,25 2,39 ± 0,06 12,59 ± 0,31 12,47 ± 0,33 1,60 ± 0,03
Таблица 3. - Содержание элементов в листьях и траве исследуемых растений и фитосборе, мг/100г
Элементы Смородина черная Земляника Ежевика Иван-чай Вистерия китайская Антиокси-дантный фитосбор
Fe 22,4 26,4 22,5 8,6 19,7 18,9
Si 170 200 150 38 235 190
Р 190 120 110 81 100 190
Mg 335 230 260 145 235 400
Са 1000 530 560 360 670 945
№ 50 52 30 33 55 125
К 2800 1650 1875 1345 1975 3780
2п 6,7 5,3 4,5 2,9 7,1 6,3
Мп 0,45 4,0 5,6 8,4 27,6 0,44
Sr 3,3 0,66 1,9 0,7 1,6 1,3
Си 0,33 0,26 0,37 0,21 0,59 0,56
Ni 0,056 0,0066 0,11 0,086 0,16 0,063
Л1 39,2 16,5 22,5 8,6 9,5 44,1
Мо 0,056 0,0066 0,037 <0,03 0,039 0,063
РЬ 0,11 < 0,03 <0,03 <0,03 0,39 0,12
Потери, прокаливание, масс. % * 88,79 93,43 92,49 95,18 92,09 87,42
Примечание: * - потери органического компонента после прокаливания приведены в масс.% от первоначальной массы образца.
Выявлено наличие 16 элементов, 7 из них относятся к макро- (Fe, Si, P, Mg, Ca, Na, K), 7 микро- (Zn, Mn, Sr, Cu, Ni, Al, Mo) и 2 ультрамикроэлемента (Se, Pb). Содержание тяжелых металлов находится в пределах нормы, а уровень токсических и редкоземельных элементов ниже предела обнаружения [20].
Селен в растительном сырье находится в форме селенометионина и, согласно результатам анализа, его содержание в фитосборе составляет 0,03 ррт. Биологическая функция селена в организме человека связана с его участием в функционировании основных антиокси-дантных систем глутатионпероксидазы, цитохрома С и глицинредуктазы. Дефицит селена ведет к снижению иммунитета [14, 21].
Длительные депрессии и оксидатив-ный стресс ведут к нарушению внутриклеточного гомеостаза, метаболизма и антиоксидантного баланса. Согласно результатам исследования разработанного фитосбора, проведенного in vivo на модели глюкокортикоидного индуцированного оксидативного стресса, фитосбор обладает гепатопротекторным эффектом, который реализуется через антиоксидантный механизм действия [15].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Анализ результатов исследования антиоксидантной активности травы иван-чая, листьев смородины черной, земляники садовой, ежевики сизой и вистерии китайской показал, что на их основе можно создать лечебно-профилактический фитосбор.
Установлено содержание основных биологически активных веществ фитосбора: аскорбиновой кислоты - 1,60 %, фла-воноидов - 10,68 %, оксикоричных кислот
- 2,39 %, свободных органических кислот
- 12,59 %, дубильных веществ - 12,47 %. Выявлено наличие 16 микро- и макроэлементов.
Фитосбор может служить основой для разработки новых эффективных лечебно-профилактических препаратов, необходимых для торможения оксидативного стресса.
Научные публикации SUMMARY
O. V. Demeshko, A. P. Domarev, V. N. Kovalev, S. V. Kovalev, V. L. Dubonosov, L. V. Krichkovskaya, V. V. Pogrebnyak ANALYSIS OF PROMISING MEDICINAL PLANTS FOR PREPARING ANTIOXIDANT THERAPEUTIC HERBAL SPECIES
Medicinal plants are a source of various biologically active compounds. Polyphenols, vitamin C as well as macro- and microelements perform an important function in protecting the human body from reactive oxygen intermediates during the development of oxidative stress. Antioxidant activity, micro- and macronutrient composition of leaves were studied: Chamaenerion angustifolium, Ribes nigrum, Fragaria vesca, Rubus caesius and Wisteria sinensis. Antioxidant activity of the herbal species was 116,5 mg/g. The following elements: Mg, P, K, Ca, Cr, Mn, Fe, Cu, Se, Zn, Si, Al, Mo, Na, Sr were determined in the leaves of the medicinal plants studied by the methods of atomic-absorption spec-troscopy with electrothermal atomization of the substance (spectrometer iCE 3500) and atomic emission spectroscopy (spectrograph DFS-8). The content of the main groups of biologically active compounds in herbal species is: ascorbic acid - 1,60 %, flavonoids - 10,68 %, hydroxy-cinnamic acids - 2,39 %, free organic acids - 12,59 %, tannins - 12,47 %.
Keywords: ascorbic acid, flavonoids, hy-droxyl-cinnamic acids, organic acids, tannins, antioxidant activity, macro- and micronutri-ents, herbal species.
ЛИТЕРАТУРА
1. Биохимия человека / Р. Марри [и др.]. - М.: Мир, 1993. - Т. 1 - 384 c., Т. 2 - 415 с.
2. Меньщикова, Е. Б. Фенольные анти-оксиданты в биологии и медицине / Е. Б. Меньщикова, В. З. Ланкин, Н. В. Канда-линцева. - LAP Lambert. - 2012. - 496 c.
3. Шульга, Л. I. Антиоксидантний профшь нового рослинного засобу, досль дження на модельних системах in vitro / Л. I. Шульга // Фармаком. - 2012. - № 4. -С. 77-80.
4. Hermes-Lima, М. Oxygen in Biology and Biochemistry: Role of Free Radicals Functional Metabolism / М. Hermes-Lima //
Regulation and Adaptation. - 2004. - Chapter 12. - P. 319-368.
5. Lee, J. Reactive Oxygen Species, Aging, and Antioxidative Nutraceuticals / J. Lee, N. Koo, D. Min // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. - 2004. -Vol. 3. - P. 21-33.
6. Brewer, M. S. Natural Antioxidants: Sources, Compounds, Mechanisms of Action, and Potential Applications / M. S. Brewer // Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. - 2011. - Vol. 10. - Р. 221-247.
7. Флавоноиды: биохимия, биофизика, медицина / Ю. С. Тараховский [и др.]. -Пущино: Synchrobook, 2013. - 310 с.
8. Шарафутдинова, Е. Н. Качество пищевых продуктов и антиоксидант-ная активность / Е. Н. Шарафутдинова, А. В. Иванова, А. И. Матерн. - Аналитика и контроль, 2011. - Т. 15. - № 3. -С. 281-282.
9. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. -11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1990. -400 с.
10. Державна Фармакопея Украши : в 3 т. / Державне тдприемство «Украшський науковий фармакопейний центр якосп лшарських засобiв». - 2-е вид. - Харюв: Державне тдприемство «Украш ський науковий фармакопейний центр якосп лшарських засобiв», 2015. - Т. 1. - 1128 с.
11. Спектральный анализ чистых веществ / Под редакцией Х. И. Зильберштей-на. - Л.: Химия. - 1971. - 461 с.
12. Optimization of high-resolution continuum source graphite furnance atomic absorption spectrometry for direct analysis of selected trace elements оп whole blood samples / М. Wojciak-Kosior [et al.] // Talanta. 2017. - V. 165. - P. 351-356.
13. Державна Фармакопея Украши / Державне тдприемство «Украшський науковий фармакопейний гонтрякост лшар-ських засобiв». - 1-е вид. - Доповнення 4. -Харюв: Державне тдприемство «Украшський науковий фармакопейний центр якосп лшарських засобiв», 2011. - 540 с.
14. Оксидативный стресс и воспаление: патогенетическое партнерство / Под
ред. О. Г. Хурцилавы, Н. Н. Плужникова, Я. А. Накатиса // Издательство СЗГМУ им. И. И. Мечникова, 2012. - 340 с.
15. Реактивацтя системи глутатюну фенольними антиоксидантами / А. Л. За-гайко ^a ш.] // Матерiали III Мiжнарод-но'1 науково-практично'1 конференцп «Ль ки-людит. Сучаст проблеми фармакоте-рапи, призначення лшарських засобiв». -НФаУ: Харюв, 2019. - Т. 1. - С. 68.
16. The reversibility of the vitamin C re-dox system: Electrochemical reasons and biological aspects / H. Sapper [et al.] // Z. Naturforsch. - 1982. - V. 37. - P. 942-946.
17. Червяковский, Е. М. Роль флава-ноидов в реакциях с переносом электронов. Труды БГУ / Е. М. Червяковский, В. П. Курченко, В. А. Костюк. - Минск, 2009. - Т. 4. - Ч. 1. - С. 9-26.
18. Cossins, Е. ESR studies of vitamin C regeneration, order of reactivity of natural source phytochemical preparations / Е. Cos-sins, R. Lee, L. Packer // Biochem. Mol. Biol. Int. - 1998. - Vol. 45. - № 3. - Р. 583-597.
19. Quercetin protects cutaneous tissue-associated cell types including sensory neurons from oxidative stress induced by gluta-thione depletion: cooperative effects of ascorbic acid / S. D. Skaper [et al.] // Free Radical Biology & Medicine, 1997. - Vol. 22. -No. 4. - P. 669-678.
20. Авцын, А. П. Микроэлементозы человека: этиология, классификация, ор-ганопатология / А. П. Авцын, А. А. Жаворонков, М. А. Риш. - М., Медицина, 1991. -496 с.
21. Бшецька, Е. М. Селен у довкшлг еколого-гшетчт аспекти проблеми / Е. М. Бшецька, Н. М. Онул. - ДЗ «Дншропетровська медична академiя МОЗ Украши» Дншропетровськ, 2013. - 291 c.
Адрес для корреспонденции:
61168, Украина,
г. Харьков, ул. Валентиновская, 4,
Национальный фармацевтический университет,
кафедра фармакогнозии,
тел. +38(0572)679208,
е-mail: [email protected],
Демешко О. В.
Поступила 07.12.2018 г.
