CC BY
105
УДК 575.113:616.248
АНАЛИЗ МУТАЦИИ Т3151 В ГЕНЕ ВСЯ-АВЫ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ МИЕЛОЛЕЙКОЗОМ ИЗ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН
О 2011 И.Р. Минниахметов1, Д.В. Исламгулов1, Н.Р. Рябчикова2, А.С. Карунас1,
Э.К. Хуснутдинова1
Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, г. Уфа 2ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет», г. Уфа
Поступила 07.07.2011
Провели скрининг мутации Т3151, приводящей к полной потере чувствительности при лечении больных хроническим миелолейкозом ингибиторами тирозинкиназ. Обнаружили 7 мутаций Т3151 методом прямого сек-венирования и подтвердили их последующим методом ПДРФ-анализа. Частота мутации ТЗ151 у больных из Республики Башкортостан составила 14%.
Ключевые слова: хронический миелолейкоз, ВСК-АВЬ, 3151, ингибиторы тирозинкиназ, мутации.
Хронический миелолейкоз (XMJI) - форма лейкоза, которая характеризуется усиленным и нерегулируемым ростом преимущественно миелоид-ных клеток в костном мозге с их накоплением в крови. Основной причиной XMJI является реци-прокная транслокация t(9;22),(q34;qll) с образованием филадельфийской хромосомы (Ph) [13], обнаруживаемой у 90-95% больных. В результате транслокации образуется химерный ген BCR-ABL1, продуктом которого является патологический белок, обладающий выраженной тирозинкиназной активностью. Именно белок BCR-ABL1 имеет ключевое значение в патогенезе XMJI [9].
XMJI характеризуется прогрессирующим течением, в соответствии с которым выделяют 3 стадии заболевания: хроническая фаза, характеризующаяся экспансией терминально дифференцированных нейтрофилов; фаза акселерации с последующим бластным кризом, характеризующиеся недифференцированными миелоидными или лимфоидными клетками-предшественниками. По данным исследователей заболеваемость XMJI в мире составляет 1-2 случая на 100 тыс. населения. В странах Европы и Северной Америки XMJI по частоте занимает 3 место среди лейкозов (после острых лейкозов и хронического лимфолейкоза), в азиатских странах, где заболеваемость хроническим лимфолейкозом очень низка, - 2 место [1]. В России XMJI страдают порядка 7 000 пациентов, ежегодно заболеваемость XMJI растет и составляет в нашей стране 1 -3 новых случая на 100 тыс. населения в год. Заболевание выявляется в основном у людей социально активного возраста, что серьезно усугубляет проблему и делает ее крайне актуальной [8].
В результате интенсивного разностороннего изучения патогенеза XMJI стало очевидным, что транслокация t(9;22)(q34;qll), приводящая кобра-
Минниахметов Плдар Рамилевич, e-mail:
Mimiialdmietov(a)gmail.com; Исламгулов Денис Владимирович, канд. мед. наук, e-mail: Islamgulov(S)gmail.com; Рябчикова Наира Рафаэлевна, e-mail: Naira_mail(a!bk.rii; Карунас Апександра Станиславовна, канд. мед. наук, e-mail:
Carunas(a)list.ru; Хуснутдинова Эльза Камилевна, докт. биол. наук, проф., e-mail: Ekkh(a!anrb.ru.
зованию тирозинкиназы BCR-ABL1 с повышенной активностью, является пусковым механизмом развития заболевания. С начала 1990-х гг. началась разработка препарата, ингибирующего эффект действия тирозинкиназы. В результате был создан препарат STI571 (signal trunsduction inhibitor), получивший название иматиниб. Появление препарата направленного патогенетического действия ознаменовало начало новой эры в терапии XMJI [2].
Иматиниб мезилат на сегодняшний день является самым эффективным лекарственным средством, применяемым в качестве препарата первой линии при хроническом миелоидном лейкозе. Исключительная эффективность таргетной терапии имати-нибом XMJI доказана в рандомизированном исследовании IRIS (International Randomized Study of IFN vs STI571), где за 5 лет наблюдений общая выживаемость пациентов, получавших иматиниб, составила 88%, а выживаемость без прогрессии в фазу акселерации и бластный криз - 93%. Однако у некоторых больных наблюдается резистентность к проводимой терапии, что приблизительно в 7% случаев приводит к прогрессии заболевания в фазу акселерации и бластного криза [6].
Возникновение устойчивости к иматинибу является следствием взаимодействия многих факторов. Эти факторы включают в себя схему лечения, фар-макодинамику ингибиторов тирозинкиназ (ИТК), генетические изменения, мутации В CR-ABL ки-назного домена или комбинацию из этих факторов [11].
Частота мутаций в гене BCR-ABL1 у больных, резистентных к иматинибу, колеблется от 15% до 90% и зависит от критериев определения резистентности, методов обнаружения мутаций и фазы течения XMJI [7]. Эти мутации делают тирозинки-назу нечувствительной к действию иматиниба, при этом сохраняя трансформирующую активность фермента. На сегодняшний день разработаны ингибиторы тирозинкиназ 2-го поколения, более эффективные по сравнению с иматинибом, два из ко-
торых уже зарегистрированы в России в начале 2008 г. - нилотиниб и дазатиниб.
Применение ингибиторов тирозинкиназ 2-го поколения позволяет преодолеть проблемы с резистентностью и непереносимостью иматиниба у ряда больных, однако в некоторых случаях даже применение новых препаратов не приводит к улучшению ответа на лечение, и является неэффективным [1]. Наиболее распространенной мутацией, вызывающей резистентность ко всем известным ингибиторам тирозинкиназ, является замена треонина в положении 315 на изолейцин (ТЗ151), возникающая в результате замены цитозина на тимин в 944 позиции. Резистентность при этой мутации гена ВСЯ-АВЬ невозможно преодолеть увеличением дозы иматиниба, так же как и терапией ингибиторами тирозинкиназ II поколения, поэтому при наличии совместимого донора пациентам с мутацией ТЗ 151 показана аллогенная трансплантация костного мозга [4]. Своевременное выявление этой мутации позволяет откорректировать тактику лечения пациентов с ХМ Л.
Целью нашего исследования являлся поиск и анализ частоты встречаемости мутации ТЗ 151 в гене ВСЯ-АВЫ у больных хроническим миелолейко-зом из Республики Башкортостан (РБ).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Материалом исследования послужили образцы РНК и кДНК, выделенные из периферической крови 50 больных, с клинически и цито генетически установленным диагнозом «Хронический миело-лейкоз», проходивших обследование в Республиканской клинической больнице им. Куватова. Все больные дали информированное согласие на уча-
Таблица. Праймеры для ПЦР
стие в исследовании в соответствии со стандартами биоэтического комитета, разработанных в рамках Хельсинской декларации. Все включенные в исследование больные получали лечение препаратом ингибитором тирозинкиназ (НТК) иматинибом в дозе 400, 600 или 800 мг/сут согласно рекомендациям Европейского общества по лечению лейкозов ELN [5].
Тотальную РНК выделяли из 5-7 мл венозной крови реагентом TriZol (Invitrogene) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Эффективность выделения мРНК определяли с использованием спектрофотометра NanoDrop. Качество препаратов РНК оценивали по соотношению оптических плотностей А260/А280 и электрофорезом в 1%-ном ага-розном геле по соотношению количества 28S и 18S рРНК. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой I, свободной от РНКазы ("Sigma")- Наличие в образце РНК примесей ДНК определяли с помощью поли-меразной цепной реакции (ПЦР) со специфическими праймерами к гену домашнего хозяйства GAPDH (Fermentas).
Обратная транскрипция проводилась с использованием набора «RevertAid™ First Strand cDNA» (Fermentas) с использованием гекса- и дексанукле-отидных праймеров, руководствуясь рекомендациями производителя.
ПЦР-реакция проводилась в 2 этапа, с целью амплификации мутантного транскрипта ABL, согласно рекомендациям Soverini et al. [15]. На 1-м этапе амплифицировали участок гена BCR-ABL, длиной в 1,2 т.п.о. (тысяч пар оснований), с использованием следующих праймеров: F-BCR-A и R-ABL-A (табл.).
Название прапмера Последовательность, 5'—3' Позиция Длина ампликона
F-BCR-A GAG CAG CAG AAG AAG TGT TTC BCR А 1475 п.о. (Ь3а2) или 1401 п.о.
AGA (3075-3098) (Ь2а2)
R-ABL-A СТС TAG CAG CTC ATA CAC CTG GG ABL
(1484-1506)
F-ABL-B CAT CAT TCA ACG TGT GCC GAC GG ABL (748-770) В (393 п.о.)
R-ABL-B GTT GCA CTC CCT CAG GTA GTC ABL
(1120-1140)
F-ABL-C GAA GAA ATA CAG CCT GAC GGT G ABL (930-951)
R-ABL-C CGT CGG ACT TGA TGG AGA A ABL С (482 п.о.)
(1393-1411)
На 2-м этапе проводили реамплификацию, используя в качестве матрицы амплификат от первого этапа, с использованием двух пар внутренних праймеров Р-АВЬ-ВЖ-АВЬ-В и Р-АВЬ-С/Я-АВЬ-С, которые разделяли изучаемый фрагмент на участки длиной 393 п.н. и 482 п.н., соответственно.
Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 25 мкл, содержащую 2,5 мкл
10xTaq-буфера, 0,5 единиц Taq полимеразы, смесь dNTP (с1АТР, dGTP, dCTP, dTTP по 200 мкМ каждого), 2,5тМ МёС12 и по 5 пМ каждого праймера. В реакцию брали 1-Змкг кДНК.
Использовали следующие условия ПЦР: для первого раунда, после денатурации (94°С, 5 мин) проводили 30 циклов амплификации в режиме 94°С/40с; 60°С/60с; 72°С/60с; финальная достройка
72°С/7 мин. Реамплификация проводилась при следующих условиях: после первичной денатурации (94°С, 5 мин) проводили 35 циклов амплификации в режиме 94°С/30с; 55°С/40с; 72°С/40с; финальная достройка 72°С/7 мин.
Реакция секвенирования фрагмента гена ABL осуществлялась с использованием комплекта «BigDye terminator sequencing kit» («Applied Biosystems», США) согласно протоколу производителя. Определение нуклеотидной последовательности выполнялось с помощью автоматического секвена-тора ABI PRISM модель 310 («Applied Biosystems») с использованием набора для флюоресцентного мечения DYEnamic ET, согласно протоколу фирмы производителя («Amersham Pharmacia Biotech» DYEnamic™ ET Terminator Cycle Sequencing Kit).
Наличие мутации подтверждалось ПДРФ-анализом: фрагменты гена ABL подвергались рестрикции специфической эндонуклеазой Ddel. Реакцию проводили согласно протоколу фирмы-производителя (Fermentas). Продукты реакции и рестрикции анализировали в 7% полиакриламид-ном геле с последующей окраской в растворе бромистого этидия (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете при длине волны 312 нм.
У больных с выявленными при секвенировании изменениями последовательности нуклеотидов для подтверждения наличия мутации проводился рест-рикционный анализ с помощью эндонуклеазы Dde I (рис. 2, А, В). Мутация T315I выявлялась при потере одного из сайтов рестрикции для эндонуклеазы DdeI. Анализ проводился после амплификации фрагмента кДНК длиной 482 п.о. и сравнивался с контрольным образцом без мутации. В норме этот фрагмент содержит 4 сайта рестрикции для эндонуклеазы DdeI, который гидролизует кДНК на фрагменты длиной 35, 55, 114, 116, 162 п.о. При возникновении замены цитозина на тимин теряется один из сайтов рестрикции (отмечен звездочкой на рис. 2В) и мутантный вариант ABL транскрипта образует не гидролизованный фрагмент в 197 п.о.
Таким образом, под действием эндонуклеазы DdeI мутантные образцы гидролизируются с образованием 4 фрагментов, длиной 55, 114, 116 и 197 п.о. Наличие в образцах с мутацией полос длиной в 162 и 35 п.о. свидетельствует о клоновом характере
Статистическая обработка данных осуществлялась с использованием программы Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Критерием к началу мутационного анализа является появление резистентности к терапии, выражающееся появлением гематологической или цито-генетической ремиссии, а также увеличение уровня транскриптов BCR-ABL при анализе уровня экспрессии у больных ХМЛ в 10 раз (1 log). В соответствии с этими требованиями в нашем исследовании мы сформировали группу из 50 больных ХМЛ, отобранных из общей выборки после определения уровня экспрессии химерного гена с помощью набора «ОНКОСКРИН-1 -1-Q» (ООО «ГеноТехноло-гия»), являющегося информативным объективным методом определения эффективности действия иматиниба.
С целью идентификации мутации T315I в гене BCR-ABL1 у 50 пациентов с ХМЛ из РБ проведен анализ изменений нуклеотидной последовательности тирозинкиназного домена гена BCR-ABL путем прямого секвенирования кДНК (рис. 1).
G *
мутаций, т.е. мутантные образцы представлены разным соотношением транскриптов дикого и му-тантного типов В. Рестрикционная карта фрагмента кДНК длиной 482 п.о. для эндонуклеазы DdeI. Сайты рестрикции показаны стрелками. При мутации T315I теряется один из сайтов узнавания для рест-риктазы DdeI (отмечен звездочкой), с образованием фрагмента в 197 п.о.
В результате проведенного нами исследования у пациентов с высокой экспрессией гена BCR-ABL1 из РБ мутация T315I была обнаружена у 7 больных из 50 (14%).
Впервые эта мутация была описана в работе Gorre et al., в которой было установлено, что наличие у пациентов данной мутации приводит к развитию резистентности к лечению иматинибом. Треонин в положении 315 находится на периферии нук-леотид связывающего сайта ABL1 и формирует ключевое взаимодействие через водородную связь с иматинибом [10]. Мутация T315I разрывает это взаимодействие, ослабляет связывание иматиниба
Рис. 1. Секвенирование двух образцов кДНК с мутацией ТЗ151.
и приводит к полной нечувствительности к имати- на пролиферативную активность по сравнению с нибу. Чувствительность к препарату снижается бо- чувствительностью к иматинибу АВЬ-лее чем в 200 раз по данным биохимического теста тирозинкиназы дикого типа [4]. фосфорилирующей активности изолированной АВЬ-киназы и более чем в 33 раза по данным теста
1 2 3 4 5 6 7
Рис. 2. А. Электрофореграмма ПДРФ-анализа гена ВСЯ-АВЫ с помощью эндонуклеазы рестрикции Б(1е1. Дорожка 1 - маркер молекулярного веса риС19/А/5£>1; 2 - контрольный образец, не обработанный рестриктазой; 3, 4, 5, 7 - образцы кДНК с мутацией ТЗ151; 6- образец кДНК без мутации ТЗ151.
По современным данным, частота мутаций в гене BCR-ABL1 в разных групп больных колеблется от 15% до 90% и зависит от критериев определения резистентности, методов обнаружения мутаций и фазы течения XMJI [7].
Частоты мутаций, приводящих к резистентности при лечении иматинибом, варьируют в разных популяциях и зависят от фазы заболевания. В исследованиях группы GIMEMA (Italian Group for Hematologic Malignancies of the Adult) [14] было обнаружено, что частота мутаций у пациентов с первичной и вторичной резистентностью составляет 43%. Мутации встречались у 27% больных в хронической фазе, у 52% - в фазе акселерации, у 75% - в фазе миелоидного бластного криза и у 82% - с лимфоидным бластным кризом [3, 14].
Различные мутации встречаются у резистентных к иматинибу пациентов с неодинаковой частотой. Чаще всего у резистентных пациентов с XMJI и Ph-позитивным острым лимфобластным лейкозом обнаруживают мутации E255K/V, М351Т и ТЗ 151. По данным S. Soverini и соавт., мутации M244V, G250E, Y253F/H, E255K/V, T315I, М351Т и F359V составляют 85 % всех мутаций, ассоциированных с резистентностью к иматинибу [14].
Частота мутации ТЗ 151, приводящей к резистентности к ингибиторам тирозинкиназ различается в разных популяциях. Так, в упомянутом выше исследовании итальянской группы GIMEMA, частота данной мутации составила 12%, что коррелирует с результатами исследований в нашей популяции.
В другом, менее репрезентативном исследовании Catherine Roche-Lestienne, в выборке больных XMJI из Франции частота мутации T315I составила 12,5% [12]. При исследовании мутаций у больных из России (г. Ростов) было обнаружено, что частота мутации ТЗ 151 составляет 4%. Низкий процент частоты этой мутации, возможно, связан с тем, что в исследование были отобраны только больные, проявляющие первичную резистентность к иматинибу (рефрактерность) [3].
Таким образом, в результате проведенного анализа впервые установлено, что мутация T315I в гене BCR-ABL1, приводящая к резистентности к терапии ингибиторами тирозинкиназ, встречается у больных с хроническим миелолейкозом из РБ с достаточно высокой частотой 14%, что свидетельствует о необходимости проведения скрининга данной мутации у пациентов с XMJI из РБ.
Раннее и своевременное обнаружение мутации T315I позволит своевременно начать поиск подходящих доноров и назначить трансплантацию костного мозга.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Виноградова О.Ю., Туркина А.Г., Хорошко Н.Д. Организация терапии хронического миелолейкоза. Первый общероссийский регистр больных хроническим миелолейкозом: анализ и перспективы // Гематология и трансфу-зиология. 2008. Т. 53. № 5. С. 54-58.
2. Волкова М.А. Гливек - революция в терапии хронического миелолейкоза // Фарматека. 2003. Т. 77. № 14. С. 39-47.
3. Куцее СЛ., Вельченко М.В., Морданое C.B. Роль мутаций гена BCR-ABL в развитии рефракгерности к имати-
нибу у пациентов с хроническим миелолейкозом // Клиническая онкогематология. 2008. Т. 1. №4. С. 303-309.
4. Куцее С.И., Вельченко М.В. Значение анализа мутаций гена BCR-ABL в оптимизации таргетной терапии хронического миелолейкоза // Клиническая онкогематология. 2008. Т. 1. № 3. С. 190-199.
5. Baccarani М, Saglio G., Goldman J. et al. Evolving concepts in the management of chronic myeloid leukemia. Recommendations from an expert panel on behalf of the European LeukemiaNet//Blood. 2006. V. 108. P. 1809-1820.
6. Jones D., Kamel-Reid S., Bahler D. et al. Laboratory practice guidelines for detecting and reporting BCR-ABL drug resistance mutations in chronic myelogenous leukemia and acute lymphoblastic leukemia: a report of the Association for Molecular Pathology // J. Mol. Diagn. 2009. V. 11(1). P. 4-11.
7. Hochhaus A., Kreil S., Corbin AS. et al. Molecular and chromosomal mechanisms of resistance to imatinib (STI571) therapy // Leukemia. 2002. V. 16. № 11. P. 21902196.
8. http://remedium.ru/news/detail.php?ID=44694&sphrase_id =461141
9. Kurzrock R., Kantarjian H., Druker В., Talpaz M. Philadelphia chromosome-positive leukemias: from basic mechanisms to molecular therapeutics // Ann. Intern. Medicine. 2003. V. 138. P. 819-830.
10. NagarB., Bornmann W.G., Pellicena P. et al. Crystal structures of the kinase domain of c-Abl in complex with the small molecule inhibitors PD173955 and imatinib (STI-571) // Cancer Res. 2002. V. 62. № 15. P. 4236-4243.
11. Quintas-Cardama A., Kantarjian H., Cortes J. Mechanisms of Primary and Secondary Resistance to Imatinib in Chronic Myeloid Leukemia // Cancer Control. 2009. V. 16. № 2. P. 122-131.
12. Roche-Lestienne C., Soenen-Cornu V., Grardel-Duflos N. at al. Several types of mutations of the Abl gene can be found in chronic myeloid leukemia patients resistant to STI571, and they can pre-exist to the onset of treatment // Blood. 2002. V. 100. P. 1014-1018.
13. Savona M., Talpaz M. Getting to the stem of chronic myeloid leukaemia//Nat. Rev. Cancer. 2008. V. 8. P. 341-350.
14. Soverini S., Colarossi S., Gnan A. et al. Contribution of ABL Kinase DomainMutations to Imatinib Resistance in Different Subsets of Philadelphia-Positive Patients: By the GIMEMAWorking Party on Chronic Myeloid Leukemia // Clin. Cancer Res. 2006. V. 12 (24). P. 7374-7379.
15. Soverini S, Martinelli G, Amabile M. et al. Denaturing-HPLC-based assay for detection of ABL mutations in chronic myeloid leukemia patients resistant to Imatinib // Clin. Chem. 2004. V. 50. P. 1205-1213.
ANALYSIS OF T315I MUTATION IN CHRONIC MYELOID LEUKEMIA PATIENTS
FROM REPUBLIC OF BASHKORTOSTAN
© 20111.R. Minniakhmetov1, D.V. Islamgulov1, N.R. Ryabchikova2, A.S. Karunas1,
E.K. Khusnutdinova1
institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Sci. Centre of RAS, Ufa; 2Bashkir State Medical University, Ufa
In this article, we conducted a screening T315I mutation, which is the cause of resistance of patients during treatment with tyrosine kinase inhibitors (TKI). We found seven T315I mutations by direct sequencing and confirmed them by RFLP analysis. The frequency of T315I mutation in CML patients from Bashkortostan was 14%.
Key words: chronic myeloid leukemia, BCR-ABL, T315I, tyrosine kinase inhibitors, mutations.
Minniakhmetov Ildar Ramilevich, e-mail:
[email protected]; Islamgulov Denis Vladimirovich, Candidate of Medicine, e-mail: [email protected]; Ryabchikova Naira Rafaelevna, e-mail: [email protected]; Karunas Alexandra Stanislavovna, Candidate of Medicine, email: [email protected]; Khusnutdinova Elza Kamilevna, Doctor of Biology, Professor, e-mail: [email protected]
