CC BY
39
НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 616.98:616.33-006.6] :579.835 АНАЛИЗ КАНЦЕРОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА HELICOBACTER PYLORI НА ОСНОВАНИИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ CagA-БЕЛКА БАКТЕРИИ
Е. В. Воропаев1, О. В. Осипкина1, О. Ю. Баранов1, А. А. Зятьков1, Н. А. Бонда2, Э. Н. Платошкин1, А. В. Воропаева1, В. Н. Беляковский1, С. Л. Ачинович3, А. C. Шафорост1, В. И. Зайцева4
Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет» г. Гомель, Республика Беларусь Государственное учреждение «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья»
г. Гомель, Республика Беларусь 3Учреждение здравоохранения «Гомельский областной клинический онкологический диспансер» г. Гомель, Республика Беларусь ^Учреждение здравоохранения «Гомельская городская клиническая больница № 2» г. Гомель, Республика Беларусь
Представлен разработанный молекулярно-генетический метод анализа канцерогенного потенциала Helicobacter pylori, основанный на определении степени фосфорилирования цитотоксин-ассоциированного белка бактерии (CagA). Степень фосфорилирования CagA-белка Helicobacter pylori оценивается по определению количества и вида так называемых EPIYA ^1и-Рш-11е-Туг-А1а)-мотивов в карбоксильном конце участка CagA-белка, с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования локуса CagA-гена. Предложенный метод может применяться для формирования групп пациентов, нуждающихся в дополнительном обследовании и диспансерном наблюдении с целью раннего прогнозирования патологических состояний, связанных с инфекционным процессом, вызванным доминирующими в Республике Беларусь штаммами Helicobacter pylori. Определение количества и типа EPIYA-мотивов может использоваться в качестве дополнительного критерия для определения групп риска по заболеваниям желудочно-кишечного тракта.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, ДНК, ПЦР, секвенирование, фосфорилирование белка, канцерогенный потенциал, EPIYA-мотивы, лабораторная диагностика.
The developed molecular and genetic method for analysis of the carcinogenic potential of Helicobacter pylori based on determining the degree of phosphorylation of the cytotoxin-associated protein of the bacterium (CagA) has been presented. The degree of phosphorylation of CagA protein of Helicobacter pylori is estimated by determining the number and type of so-called EPIYA (Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala) motifs at the carboxyl end of the CagA protein region using PCR (polymerase chain reaction) and sequencing of the CagA gene locus. The proposed method can be used to form groups of patients who need additional examination and follow-up observation for the purpose of early prediction of pathological conditions associated with the infectious process caused by Helicobacter pylori strains dominating in the Republic of Belarus. The determination of the number and type of EPIYA motifs can be used as an additional criterion for detection of risk groups for gastrointestinal diseases.
Key words: Helicobacter pylori, DNA, PCR, sequencing, protein phosphorylation, carcinogenic potential, EPIYA-motifs, laboratory diagnostics.
Problemy zdorov'ya i ekologii. 2018 Oct-Dec; Vol 58 (4): 86-93
Analysis of the Carcinogenic Potential of Helicobacter Pylori Based on Determination of the Degree of Phosphorylation of the Caga Protein Bacteria
E.V. Voropaev, O.V. Osipkina, O.Yu. Baranov, A.A. Zyatkov, N.A. Bonda, E.N. Platoshkin, A.V. Voropaeva, V.N. Belyakovsky, S.L. Achinovich, A.S. Shaforost, V.I. Zaitseva
Введение
К инфекционным агентам, обладающим канцерогенным потенциалом, относится патогенная грамотрицательная бактерия Helicobacter pylori — единственная бактерия, классифици-
рованная ВОЗ как канцероген I типа [1]. Helicobacter pylori — мелкая грамотрицательная бактерия изогнутой или слегка спиралевидной формы, колонизирующая слизистую оболочку желудка человека и вызывающая
хронический воспалительный процесс. Она избирательно колонизирует эпителий желудка и является этиологическим агентом MALT-лимфомы, язвы желудка, двенадцатиперстной кишки и рака желудка [2]. Распространенность Helicobacter pylori — инфекции в различных регионах мира существенно отличается и зависит от социально-экономических условий. Средний уровень распространенности Helicobacter pylori в мире составляет около 60 %. Наибольшая распространённость Helicobacter pylori отмечена в развивающихся странах, где может быть инфицировано до 80 % взрослого населения [3]. В настоящее время данный микроорганизм считается наиболее распространенным этиологическим инфекционным канцерогенным агентом и является по сути ответственным за 5,5 % глобального бремени рака, что делает изучение его канцерогенных аспектов весьма актуальной задачей [4]. Значительная часть инфицированных пожизненно является бессимптомными носителями, но при этом у большинства может развиваться хроническое воспаление [5]. Среди инфицированных приблизительно в 10 % случаев возникает язвенная болезнь желудка и/или 12-перстной кишки, у 1-3 % процесс может прогрессировать до рака желудка (в основном представленного аденокарциномой), а у очень небольшого количества пациентов — примерно у 0,1 % инфекционный процесс может закончиться развитием MALT-лимфомы [6]. Из различных заболеваний, этиологической причиной которых является Helicobater pylori, злокачественные новообразования ЖКТ являются самыми важными объектами для изучения, требующие широкомасштабных популяционных исследований. Понимание молекулярно-генетического механизма канцерогенеза, индуцированного Helicobater pylori, имеет очень важное значение для разработки новых стратегий борьбы с возникновением рака желудка. Частота рака желудка, причиной которого непосредственно является Helicobacter pylori, различается в различных популяциях, наибольшее количество (75 %) таких раков отмечают в Японии, а наименьшее (около 10 %) — в Европейских популяциях [7]. Следует отметить, что в настоящее время выявление рака желудка в 80 % случаев происходит на IV стадии, когда вероятность успешного лечения крайне мала, что делает разработку системы ранней диагностики рака желудка хеликобактер-ной этиологии очень важной.
В соседних с Беларусью странах инфици-рованность среди взрослых находится на уровне 70,3 % и составляет от 5,4 до 65,4 % среди детей до 18 лет в Польше. В России (Нижний Новгород, Владивосток) уровень ин-фицированности взрослых составляет 82,9 % и
58,9 % — детей, в то время как уровень инфи-цированности детей в Санкт-Петербурге — 75,7 % [8]. Инфицированность Helicobacter pylori составляет 74,6 % у взрослых и 66,7 % у детей, по данным других белорусских исследователей при наличии гастроэнтерологической симптоматики инфицированность составляет от 60 до 94 % [9], а при дуоденальной язве близка к абсолютной, тогда как у детей до 18 лет находится в пределах 52 % [10].
Патогенетические механизмы Helicobacter pylori реализуются посредством факторов вирулентности и патогенности, одним из которых является белок СаgА. CagA-белок Helicobacter pylori и систему секреции IV типа Cag (T4SS) кодируют несколько генов, расположенных на островке патогенности (cagPAI) [11], одним из которых является CagA. CagA-ген (цитоток-син-ассоциированный ген А) — иммунодоми-нантный антиген Helicobacter pylori, имеющий наибольшее значение в патогенезе заболеваний, связанных с данной бактерией [11]. Патогенетический потенциал CagA-гена реализуется системой T4SS, вводящей его в клетки хозяина и тем самым стимулируя канцерогенный ангиогенез [12]. После переноса в цитоплазму клетки-хозяина, CagA может связываться с внутренней поверхностью клеточной мембраны и подвергаться фосфорилированию тиро-зинкиназами семейства Src на EPIYA-мотивах (глутамат-пролин-изолейцин-тирозин-аланин). Эти мотивы определяются как EPIYA-A, -B, -C и -D в соответствии с аминокислотной последовательностью, окружающей последовательность EPIYA [13]. Фосфорилированный таким образом CagA-белок индуцирует изменения сигнальной клетки-хозяина, повышающие про-лиферативную способность клеток желудочного эпителия, что приводит к резкому удлинению клеток, называемому «фенотипом колибри», и напрямую зависит от количества мотивов EPIYA в вариабельной области [13]. Исходя из вышеизложенного, увеличение количества EPIYA-мотивов может служить оценкой степени канцерогенного потенциала Helicobac-ter pylori и прогностическим фактором развития рака желудка [14]. Ранее проведенные исследования показали, что западные типы СаgA-белка почти всегда содержат EPIYA -A, -B и -C-мотивы (может присутствовать до 5 EPIYA-С-мотивов), а восточно-азиатские типы — EPIYA -A, -B, и -D. Увеличение числа EPIYA-C-мотивов повышает риск развития рака желудка в западных штаммах Helicobacter pylori [15], а EPIYA-D — в восточных [16].
В основе апробированного метода лежит молекулярно-генетическая оценка степени фос-форилирования CagA-белка Helicobacter pylori, ответственного за патогенный потенциал бак-
терии с помощью определения EPIYA-мотивов, различающихся по количеству и виду A, B, C или D-повторов в карбоксильном конце.
Штаммы, имеющие одновременно EPIYA-A и В-мотивы или содержащие один EPIYA-C-мотив, обусловливают более чем семикратное увеличение риска развития рака желудка по сравнению с CagA-негативными штаммами [15]. Штаммы, содержащие два или более EPIYA-C-мотивов, обусловливают более чем 30-кратное повышение риска [17]. Большее число EPIYA-C или D-мотивов ассоциируется с увеличением риска кишечной метаплазии, предзлокачественных изменений [18].
Цель работы
Оценить канцерогенный потенциал Heli-cobacter pylori по степени фосфорилирования CagA-белка бактерии, используя анализ полиморфных белковых мотивов EPIYA.
Материалы и методы
В исследовании был использован биологический банк образцов, хранящихся в научно-исследовательской лаборатории учреждения образования «Гомельский государственный медицинский университет», обследованы пациенты учреждений здравоохранения «Гомельская городская клиническая больница № 2» и «Гомельский областной клинический онкологический диспансер». Всем пациентам была выполнена гастроскопия с забором биопсийно-го материала желудка. Общая выборка включала 135 образцов биоптатов слизистой оболочки желудка пациентов с патологией ЖКТ.
Методами исследования являлись: поли-меразная цепная реакция (ПЦР) с электрофо-ретической детекцией, секвенирование ДНК по Сэнжеру с использованием автоматического секвенатора ABI PRISM 310 (Thermo Fisher Scientific, США), которые выполнялись на базе научно-исследовательской лаборатории УО «Гомельский государственный медицинский университет». Геномное секвенирование проводилось с использованием генетического анализатора нового поколения ION TORRENT (Thermo Fisher Scientific, США) на базе лаборатории института леса НАН Беларуси. Для проведения исследований использованы ком-
Программа амплификации: денатурация 1 цикл — 95 °С, 3 мин; 35 циклов (95 °С — 30 с, 63 °С — 60 с, 72 °С — 60 с); финальная элонгация 1 цикл — 72 °С, 2 мин.
мерческие реагенты и расходные материалы согласно инструкциям производителей. Для оценки полученных результатов использованы программное обеспечение: Sequencing Analysis software version 5.1.1. (Thermo Fisher Scientific, США), CLC Sequence Viewer version 8.0.0 (QI-AGEN Bioinformatics, США), UGENE 1.31.1 (УНИПРО, Новосибирский центр информационных технологий, Россия) и возможности международного генного банка NCBI. Проведен анализ образцов нуклеотидных последовательностей, зарегистрированных в международном генном банке NCBI и находящихся в свободном доступе в сети Интернет https://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
В качестве биологического материала использованы биоптаты слизистой оболочки желудка пациентов, взятые во время проведения фиброгастродуоденоскопии с прицельной биопсией слизистой оболочки антрального отдела и тела желудка. Полученный материал (кусочки ткани объемом не более 5 мм3) вносили в стерильные полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл типа «Eppendorf», содержащие 200 мкл стерильного физиологического раствора. Пробирки с пробами плотно закрывали, маркировали и транспортировали в лабораторию. Культивирование Helicobacter pylori, проводили используя коммерческие реагенты фирмы Биомерье (bioMerieux, Франция) на базе государственного учреждения «Гомельский областной центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья».
Выделение ДНК проводили адсорбционным методом в центрифужных колонках, полностью удаляя ингибиторы ПЦР. Концентрацию и чистоту препаратов ДНК определяли с помощью безкюветного спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, США).
Выявление ДНК Helicobacter pylori в образцах биоптатов слизистой оболочки желудка (антральный отдел и тело) проводили методом ПЦР, используя праймеры для амплификации фрагмента гена 16S рРНК Helicobacter pylori. Праймеры синтезированы ОДО «Праймтех» (Беларусь). Структура праймеров для проведения ПЦР приведена в таблице 1.
В результате ПЦР в образцах был ампли-фицирован специфический фрагмент размером 763 п.н. гена 16S рРНК Helicobacter pylori. В качестве положительного контроля (к+) ис-
Таблица 1 — Структура праймеров для проведения ПЦР с целью выявления ДНК Helicobacter pylori
Название праймера Нуклеотидная последовательность 5'-3'
16S-НР-прямой GGCTATGACGGGTATCCGGC
16S-НР-обратный GCCGTGCAGCACCTGTTTTC
пользовали имеющиеся в лаборатории стандарты ДНК Helicobacter pylori. Соответствие амплифицированных зон фрагменту гена 16S рРНК Helicobacter pylori проводили методом секвенирования ДНК по Сэнжеру.
Структура праймеров для проведения ПЦР с целью выявления фрагмента гена CagA Helicobacter pylori приведена в таблице 2.
Программа апмлификации: денатурация 1 цикл — 95 °С, 3 мин; 42 цикла (95 °С — 20 с, 55 °С — 20 с, 72 °С — 20 с); финальная элонгация 1 цикл — 72 °С, 2 мин.
В результате ПЦР в образцах амплифициру-ется специфический фрагмент размером 349 п.н. гена CagA Helicobacter pylori. Соответствие ампли-фицированных зон фрагменту гена CagA Helico-bacterpylori проводили методом секвенирования.
При выявлении CagA-гена Helicobacter pylori определяли EPIYA-содержащие зоны методом ПЦР, структура праймеров для проведения ПЦР приведена в таблице 3.
Учитывая важность выявления количества EPIYA-C-повторов на основании генетических последовательностей CagA-положительных
образцов, последовательность обратного EPIYA-праймера AGC(A/G)TAAATGGGTTC была разработана нами специально и затем проведено тестирование.
Программа апмлификации: денатурация 1 цикл — 95 °С, 3 мин; 42 цикла (95 °С — 30 с, 38 °С — 45 с, 72 °С — 45 с); финальная элонгация 1 цикл — 72 °С, 2 мин.
Классификация EPIYA-мотивов приведена в таблице 4.
Результаты и обсуждение
При проведении исследований с помощью ПЦР, у 79 пациентов из 135 (58,5 % случаев) была выявлена ДНК Helicobacter pylori. Положительный CagA-статус, также определенный методом ПЦР, отмечен в 66 образцах (83,5 %). Затем для выявления количества и видов EPIYA-мотивов CagA в этих образцах проводили ПЦР с дальнейшим анализом фореграмм и верификацией методом секвенирования ДНК по Сэнжеру.
Результат электрофоретической детекции амплифицированных EPIYA-содержащих фрагментов CagA-белка Helicobacter pylori в качестве примера представлен на рисунке 1.
Таблица 2 — Структура праймеров для проведения ПЦР с целью выявления фрагмента гена CagA Helicobacter pylori
Название праймера Нуклеотидная последовательность, 5'-3' Размер амплифицируемого фрагмента
CagA-прямой GATAACAGGCAAGCTTTTGAGGGA 349 пар нуклеотидов (п.н.)
CagA-обратный CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA
Таблица 3 — Структура праймеров для проведения ПЦР с целью выявления EPIYA-мотивов гена CagA Helicobacter pylori
Название праймера Нуклеотидная последовательность, 5'-3' Размер амплифицируемого фрагмента
EPIYA-прямой GGAACCCTAGTCGGTAATG 147 - 567 п.н.
EPIYA-обратный AGC(A/G)TAAAATGGGTTC
Таблица 4 — Классификация EPIYA-мотивов [18]
Аминокислотная последовательность Вид EPIYA-мотивов
EPIYA KVNKKK(A/T/V/S)GQ; EPIYA-A
E(S/P)IY(A/T) (Q/K)VAKKVNAKI; EPIYA-B
EPIYA TIDDLG EPIYA-C
EPIYA TIDFDEANQAG. EPIYA-D
Рисунок 1 — Электрофоретическая детекция с целью выявления количества и видов EPIYA-мотивов CagA-белка Helicobacter pylori
Как видно на рисунке 1, образцы № 1, 2, 3 визуализируются как зона размером 147 п.н., соответственно содержат EPIYA-мотивы AB. Образец № 4 визуализируется в виде двух зон 147 п.н. и 366 п.н., образец № 5 — в виде зоны 366 п.н., что соответствует наличию 3 EPIYA-мотивов ABC. Образец №6 представлен тремя зонами 147 п.н., 366 п.н., 468 п.н, что соответствует 4 EPIYA-мотивам ABCC.
Полученная нуклеотидная последовательность затем была транслирована в аминокислотную с помощью программы CLC Sequence Viewer version 8.0. (рисунок 2).
Как видно на рисунке 2, при амплификации зоны длиной 468 п.н. в аминокислотной по-
следовательности обнаружены 4 ЕРГСА-мотива: EPIYAKVN, ЕРтШАК. ЕРГУАТТОРЬ. EPIYA, которые согласно общепринятой классификации оцениваются как виды А. В. С. а также четвертый неизвестный вид ЕР^А.
Для уточнения вида ЕР^А и. соответственно. для увеличения зоны фрагмента гена CagA были использованы возможности геномного секвенирования. фрагмент данных которого представлен на рисунке 3.
Как видно на рисунке 3. четвертый ЕР^А-мотив является видом С. Таким образом. в исследуемом образце выявлено 4 ЕР^А-мотива: ЕР^АКт ЕР^АОУАК. ЕРГСАТЮРЬ. ЕР^АТЮРЬ — АВСС..
Рисунок 2 — Аминокислотная последовательность фрагмента белка CagA Helicobacter pylori одного из исследуемых образцов
Рисунок 3 — Фрагмент аминокислотной последовательности белка CagA Helicobacter pylori одного из исследуемых образцов (получен с использованием геномного секвенирования)
Виртуальный анализ степени комплемен-тарности праймеров к ДНК-мишени представлен на рисунке 4. В качестве ДНК-мишени использован фрагмент нуклеотидной последова-
тельности, полученной при секвенировании ДНК культуры Helicobacter pylori, культивированной из образца пациента с диагнозом: «Хронический атрофический гастрит».
G G AAA CATAGTCGG TAAT GGGTTATCTGAAGCAGAAGCCACAAC ТСТТ ТСТ АА АААС ТТТТ С G G AC ATCAAG АА AGA GTTG ААТ GC A AAATTTGG AAATTTCAAC ААСА ATAACAATA ATG G АСТСАА 147 П.Н. А А А С G А АСС С ATTTATG CTAAAGTTA AT AAA AAG AAAG CAGGACAAGCAG CTAG CCCTGAAGA G CCTATTTATGCTC A AGTTGCTAAAAAGGTG AATGCA AAAATTG ACCG ACTCA ATCA AATAG CA AGTG G TTTG GGTGGTGTAGGGCAAGCAGCGGG CTAC CCTTTG AA AAG GC ATG ATA AAGTTG AT G ATCTC AGTAAGGTAGGG CTTTCAGCTAGCC CTGAACCCATTTATGCrAC AATTG AT G АТС TCG G CG G AC CTTTC CCTTTG AA AAGG С ATG ATA AAGTTG ATG ATCljcAGTA AGG T AGG G CTTTCAG CT AGCCCTGAACCCATTTATGCT
366 п.н.
468 п.н.
Рисунок 4 — Виртуальный анализ степени комплементарности праймеров к ДНК-мишени
(фрагмент нуклеотидной последовательности, полученной при секвенировании ДНК культуры Helicobacter pylori)
Как видно на рисунке 4. в результате виртуальной ПЦР образуются ампликоны размером 147-366-468 п.н.. что соответствует данным реальной ПЦР. представленным на элек-трофореграмме (рисунок 1. образец № 6).
Кроме реальных образцов. полученных от белорусских пациентов. нами был проведен анализ эталонных виртуальных образцов из
международного генного банка NCBI. С использованием электронного ресурса NCBI осуществлен сравнительный анализ нуклео-тидных и аминокислотных последовательностей эталонных образцов Helicobacter pylori, зарегистрированных в международном генном банке. Результаты анализа эталонных образцов из генного банка представлены в таблице 5.
Таблица 5 — Количество и виды EPIYA-мотивов CagA-белка Helicobacter pylori эталонных образцов из генного банка
№ образца NCBI Количество EPIYA Аминокислотная последовательность Виды EPIYA Зоны на фореграмме
AB015416.1 2 EPIYAKVNKKKAGQ EPIYAQVAKKVNAKI AB 147-204
KU516680.1 3 EPIYAEVNKKKTGQ EPIYTQVAKKVKAKI EPIYATIDDLG ABC 147-204-363
KR154746.1 3 EPIYAKVNKKKTGQ EPIYAQVAKKVSAKI EPIYATIDFDEANQAG ABD 209-374
AF222807.1 4 EPIYAKVNKKKTQGQ EPIYAQVAKKVNAKI EPIYASIDDLGGPFPLK EPIYATIDDLGGPFPLK ABCC 153-213-375-477
AB017921.1 4 EPIYAQVNKKKTGQ EPIYAQVARKVSAKI EPIYAQVARKVSAKI EPIYATIDFDEANQ ABBC 153-209-375-537
AB003397.1 5 EPIYAKVNKKKTGQ EPIYAQVAKKVNAKI EPIYATIDDLG EPIYATIDDLG EPIYATIDDLG ABCCC 147-363-465-567
AB090102.1 6 EPIYAQVNKKKTGQ EPIYAQVAKKVSAKI EPIYATIDFDEANQAG EPIYAQVNKKKTGQ EPIYAQVAKKVSAKI EPIYATIDFDEANQAGFP ABDABD 372-867
В таблице 5 показаны возможные варианты размеров фрагментов, амплифицированных и визуализируемых на фореграмме, и соответствующие им количество и тип ЕРГУА-мотивов.
На рисунке 5 показан виртуальный анализ степени комплементарности праймеров к ДНК-мишени, в качестве которой использован фрагмент нуклеотидной последовательности CagA-
гена Helicobacter pylori образца из международного генного банка NCBI (AB003397.1).
Как видно на рисунке 5, виртуальная ПЦР приводит к образованию 4 ампликонов размером 147-363-465-567 п.н., анализ соответствующей аминокислотной последовательности показал наличие 5 EPIYA-мотивов — ABCCC (таблица 5).
G G А А СССТА G TCG GTAATG G GTTATCTG G AATAG A GGCCACAG CTCTCG С С A A A A AT TTTTCG G АТАТС A AG АА AG AATTG AATG AG А ААТ ТТАА АА АТТ TCAATAACAATAACAATAATGGACTCGAAAACGAACCCATTTATGCTAAAG 147 ITA АТАА АА AG AAAACAGGACAAGTAGCTAGCCCTGAAGAAC ССАТТТАС G CTCAAGTTGCTAAA AAG GTG AATGCAAA A ATTG ACCG АСТСААТСА AG CAGCAAGTGGTTTGGGTGGTGTAGGGCAAGCGGGCTTCCCTTTGAAAA G G С ATG ATA AAGTTG ATG АТСТС AGTA AG GTAG G G CG АТС AGTTAG С С CT 363 пл. GAACCCATTTATG CTACG ATTG ATG ATCTCGGGGGACCTTTCCCTTCGAAA AGGCATGATA AAGTTG ATG ATCTCAGTAAG GTAG G GCG АТС AGTTAG CCC 465 п.н. TG А А С С С ATTTATG CTACG ATTG ATG ATCTCG GCGGACCTTTCCCTTTGAA AAG GCATG ATAAAGTTG ATG ATCTCAGTAAG GTAG GG CG АТС AGTTAG CC CTG А А С CC ATTTATG CT t
567 u.it.
Рисунок 5 — Виртуальный анализ степени комплементарности праймеров к ДНК-мишени
(фрагмент нуклеотидной последовательности эталонного образца АВ003397.1 из генного банка NCBI)
С помощью секвенирования показано, что увеличение количества EPIYA-мотивов сопровождается увеличением размера амплифици-рованного фрагмента. Клинический анализ изученных штаммов показал, что имеются образцы, отличающиеся по количеству EPIYA-мотивов, характеризующиеся различными диагнозами. При исследовании биологических образцов, полученных от белорусских пациентов, определено от 2 до 4 EPIYA-мотивов.
С помощью данного метода обследования 2 EPIYA-мотива выявлено в 12 образцах (18 %), из которых 8 образцов получено от пациентов с диагнозом: «Хронический поверхностный гастрит» и 4 образца — с диагнозом: «Язва желудка»; 3 EPIYA-мотива — в 44 образцах (67 %), из которых 24 образца получено от пациентов с диагнозом: «Хронический поверхностный гастрит», 8 образцов — с диагнозом: «Язва желудка» и 12 образцов — с диагнозом «Рак желудка»; 4 EPIYA-мотива — в 10 образцах (15 %), из которых 2 образца от пациентов с диагнозом: «Хронический атрофический гастрит» и 8 образцов — с диагнозом: «Рак желудка».
Выводы
ДНК Helicobacter pylori выявлена у 58,5 % пациентов (79 из 135), из которых у 83,5 % выявлен CagA-ген (66 из 79). 2 EPIYA-мотива CagA-белка (AB) выявлялись при хроническом поверхностном гастрите в 25 % случаев (8 из 32), при язве желудка — в 33,3 % случаев (4 из 12); 3 EPIYA-мотива (ABC) выявлялись при хроническом поверхностном гастрите в 75 % случаев (24 пациента из 32), при язве желудка — в 66,7 % случаев (8 пациентов из 12) и при раке желудка — в 60 % случаев (12 из 20); 4 EPIYA-мотива (ABCC) выявлялись только при хроническом атрофическом гастрите у 2 пациентов и при раке желудка — в 40 % случаев (8 из 20). Как видно из представленных данных, в популяции белорусских пациентов встречались только A-, B- и C-мотивы и количество EPIYA-мотивов связано с усилением тяжести течения заболеваний ЖКТ, что в целом согласуется с литературными данными [15].
Таким образом, предложенный диагностический алгоритм позволяет оценить канцерогенный потенциал Helicobacter pylori при помощи выявления количества и видов полиморфных EPIYA-мотивов, отражающих степень фосфорилирования CagA-белка, и может использоваться как дополнительный метод для формирования групп пациентов, имеющих повышенный риск развития рака желудка, связанного с Helicobacter pylori.
ЛИТЕРАТУРА
1. Kusters JG, van Vliet AHM, Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection. Clin Microbiol Rev. 2006;19(3):449-90. doi: 10.1128/CMR.00054-05.
2. Wroblewski LE, Peek RM, Wilson KT. Helicobacter pylori and gastric cancer: factors that modulate disease risk. Clin Microbiol Rev. 2010;23(4):713-39. doi: 10.1128/CMR.00011-10.
3. Wang AY, Peura DA. The prevalence and incidence of Heli-cobacter pylori-associated peptic ulcer disease and upper gastrointestinal bleeding throughout the world. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2011;21(4):613-35. doi: 10.1016/j.giec.2011.07.011.
4. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin. 2005;55(2):74-108.
5. Warren JR. Gastric pathology associated with Helicobacter pylori. Gastroenterol Clin North Am. 2000;29(3):705-51.
6. Noto JM, Peek RM. Helicobacter pylori: an overview. Methods Mol Biol Clifton NJ. 2012;921:7-10. doi: 10.1007/978-1-62703-005-2_2.
7. Nagini S. Carcinoma of the stomach: A review of epidemiology, pathogenesis, molecular genetics and chemoprevention. World J Gastrointest Oncol. 2012;4(7):156-69. doi: 10.4251/wjgo.v4.i7.156.
8. Климанская ЕВ, Возжаева ФС, Новикова АВ. Клинико-эпидемиологическое наблюдение при хроническом гастродуоде-ните у детей, проживающих в условиях мегаполиса. Рос Журн Гастроэнтерологии Гепатологии и Колопроктологии. 1997; VII(5, приложение 4):30.
9. Мараховский КЮ, Мараховский ЮХ. Гастродуоденаль-ная патология, ассоциированная с Helicobacter pylori, в детском возрасте. Рос Журн Гастроэнтерологии Гепатологии и Колопроктологии. 1997;VII(3):62-3.
10. Жебрун АБ. Инфекция Helicobacter pylori-глобальная проблема здравоохранения. Биосфера. 2015;7(2):227-37.
11. Müller A. Multistep activation of the Helicobacter pylori effector CagA. J Clin Invest. 2012;122(4):1192-5. doi: 10.1172/JCI61578.
12. Boyanova L. Role of Helicobacter pylori virulence factors for iron acquisition from gastric epithelial cells of the host and impact on bacterial colonization. Future Microbiol. 2011;6(8):843-6. doi: 10.2217/fmb.11.75.
13. Chang C-C, Kuo W-S, Chen Y-C, Perng C-L, Lin H-J, Ou Y-H. Fragmentation of CagA Reduces Hummingbird Phenotype Induction by Helicobactor pylori. PLoS ONE. 2016;2;11(3). [cited 15 Nov 2018] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ arti-cles/PMC4775065/.
14. Fischer W, Prassl S, Haas R. Virulence mechanisms and persistence strategies of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Curr Top Microbiol Immunol. 2009;337:129-71. doi: 10.1007/978-3-642-01846-6_5.
15. Batista SA, Rocha GA, Rocha AM, Saraiva IE, Cabral MM, Oliveira RC, et al. Higher number of Helicobacter pylori CagA EPIYA C phosphorylation sites increases the risk of gastric cancer, but not duodenal ulcer. BMC Microbiol. 2011 Mar 24;11:61. doi: 10.1186/1471-2180-11-61.
16. Vilar e Silva A, Junior MR da S, Vinagre RMDF, Santos KN, da Costa RAA, Fecury AA, et al. Evaluation of the Pattern of EPIYA Motifs in the Helicobacter pylori cagA Gene of Patients with Gastritis and Gastric Adenocarcinoma from the Brazilian Amazon Region. Int J Bacteriol. 2014;2014:1-6. doi: 10.1155/2014/418063.
17. Correa P, Houghton J. Carcinogenesis of Helicobacter pylori. Gastroenterology. 2007;133(2):659-72. doi: 10.1053/j.gastro.2007.06.026.
18. Hatakeyama M. Structure and function of Helicobacter pylori CagA, the first-identified bacterial protein involved in human cancer. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2017;93(4):196-219. doi: 10.2183/pjab.93.013.
REFERENCES
1. Kusters JG, van Vliet AHM, Kuipers EJ. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection. Clin Microbiol Rev. 2006;19(3):449-90. doi: 10.1128/CMR.00054-05.
2. Wroblewski LE, Peek RM, Wilson KT. Helicobacter pylori and gastric cancer: factors that modulate disease risk. Clin Microbiol Rev. 2010;23(4):713-39. doi: 10.1128/CMR.00011-10.
3. Wang AY, Peura DA. The prevalence and incidence of Heli-cobacter pylori-associated peptic ulcer disease and upper gastrointestinal bleeding throughout the world. Gastrointest Endosc Clin N Am. 2011;21(4):613-35. doi: 10.1016/j.giec.2011.07.011.
4. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin. 2005;55(2):74-108.
5. Warren JR. Gastric pathology associated with Helicobacter pylori. Gastroenterol Clin North Am. 2000;29(3):705-51.
6. Noto JM, Peek RM. Helicobacter pylori: an overview. Methods Mol Biol Clifton NJ. 2012;921:7-10. doi: 10.1007/978-162703-005-2 2.
7. Nagini S. Carcinoma of the stomach: A review of epidemiology, pathogenesis, molecular genetics and chemoprevention. World J Gastrointest Oncol. 2012;4(7):156-69. doi: 10.4251/wjgo.v4.i7.156.
8. Klimanskaya EV, Vozzhaeva FS, Novikova AV. Kliniko-ehpidemiologicheskoe nablyudenie pri hronicheskom gastroduode-nite u detej, prozhivayushchih v usloviyah megapolisa. Ros Zhurn Gastroehnterologii Gepatologii i Koloproktologii. 1997;VII(5, prilozhenie 4):30. (in Russ.).
9. Marahovskij KYU, Marahovskij YUH. Gastroduodenal'naya patologiya, associirovannaya s Helicobacter pylori, v detskom voz-raste. Ros Zhurn Gastroehnterologii Gepatologii i Koloproktologii. 1997;VII(3):62-3. (in Russ.).
10. ZHebrun AB. Infekciya Helicobacter pylori - global'naya problema zdravoohraneniya. Biosfera. 2015;7(2):227-37. (in Russ.).
11. Müller A. Multistep activation of the Helicobacter pylori effector CagA. J Clin Invest. 2012;122(4):1192-5. doi: 10.1172/JCI61578.
12. Boyanova L. Role of Helicobacter pylori virulence factors for iron acquisition from gastric epithelial cells of the host and impact on bacterial colonization. Future Microbiol. 2011;6(8):843-6. doi: 10.2217/fmb.11.75.
13. Chang C-C, Kuo W-S, Chen Y-C, Perng C-L, Lin H-J, Ou Y-H. Fragmentation of CagA Reduces Hummingbird Phenotype Induction by Helicobactor pylori. PLoS ONE. 2016;2;11(3). [cited 15
Nov 2018] Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ arti-cles/PMC4775065.
14. Fischer W, Prassl S, Haas R. Virulence mechanisms and persistence strategies of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. Curr Top Microbiol Immunol. 2009;337:129-71. doi: 10.1007/978-3-642-01846-6_5.
15. Batista SA, Rocha GA, Rocha AM, Saraiva IE, Cabral MM, Oliveira RC, et al. Higher number of Helicobacter pylori CagA EPIYA C phosphorylation sites increases the risk of gastric cancer, but not duodenal ulcer. BMC Microbiol. 2011 Mar 24;11:61. doi: 10.1186/1471-2180-11-61.
16. Vilar e Silva A, Junior MR da S, Vinagre RMDF, Santos KN, da Costa RAA, Fecury AA, et al. Evaluation of the Pattern of EPIYA Motifs in the Helicobacter pylori cagA Gene of Patients with Gastritis and Gastric Adenocarcinoma from the Brazilian Amazon Region. Int JBacteriol. 2014;2014:1-6. doi: 10.1155/2014/418063.
17. Correa P, Houghton J. Carcinogenesis of Helicobacter pylori. Gastroenterology. 2007;133(2):659-72. doi: 10.1053/j.gastro. 2007.06.026.
18. Hatakeyama M. Structure and function of Helicobacter pylori CagA, the first-identified bacterial protein involved in human cancer. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2017;93(4):196-219. doi: 10.2183/pjab.93.013.
Поступила 16.11.2018
УДК 616.66:616.13-089
СПОСОБ МОБИЛИЗАЦИИ НИЖНЕЙ НАДЧРЕВНОЙ АРТЕРИИ ДЛЯ РЕВАСКУЛЯРИЗИЗУЮЩИХ BYPASS ОПЕРАЦИЙ ПОЛОВОГО ЧЛЕНА
Э. А. Повелица1, А. М. Шестерня1, Е. Е. Анашкина2, О. В. Пархоменко1
Государственное учреждение «Республиканский научно-практический центр радиационной медицины и экологии человека» г. Гомель, Республика Беларусь 2Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет» г. Гомель, Республика Беларусь
Эффективность микрохирургических реваскуляризирующих операций, выполненных по показаниям, составляет от 85,3 % на протяжении первых трех лет наблюдения и до 65,5 % - при пятилетнем наблюдении. Эти данные являются важным подтверждением необходимости совершенствования как показаний к подобного рода операциям, так и техники самих операций. Выполнено пять реваскуляризирующих операций по методике Virag II и Michal II в модификации Sharlip с удовлетворительным результатом. У одного пациента была выполнена комбинированная двухэтапная реваскуляризация, включавшая первым этапом ангиопластику и установку стента в общую подвздошную артерию и вторым этапом - открытую реваскуляризацю полового члена. Во всех случаях в качестве донорской артерии для bypass эпигастрико-пенильного анастомоза использовалась нижняя надчревная артерия (a. epigastrica inferior).
В статье обсуждаются вопросы мобилизации указанной артерии для использования в качестве донорского шунта, а также способы профилактики и диагностики артериального тромбоза в ней в послеоперационном периоде с использованием дуплексного и ангиографического исследования.
Ключевые слова: эпигастрико-пенильный анастомоз, эректильная дисфункция.
The effectiveness of microsurgical revascularization performed according to indications ranges from 85.3% within the first three years of observation and up to 65.5 % during a five-year follow-up. These data are significant evidence of the necessity to rationalize both the indications for this kind of surgery and the surgical techniques. Five revascularization operations were performed using the Virag II and Michal II technique in the Sharlip modification with a satisfactory result. Two-stage combined revascularization, including angioplasty and stent placement in the common iliac artery as the first stage and open penile revascularization surgery as the second stage was performed in one patient. In all the cases, the lower epigastric artery (epigastrica inferior) was used as a donor artery for bypass epigastric-penile anastomosis. The article discusses issues of the mobilization of the above artery for its use as a donor shunt, as well as methods of prevention and diagnosis of arterial thrombosis in it in the postoperative period with the use of duplex ultrasound and angiography.
Key words: epigastric-penile anastomosis, erectile dysfunction. Problemy zdorov'ya i ekologii. 2018 Oct-Dec; Vol 58 (4): 93-98
A Method of Mobilization of the Lower Epigastric Artery for Bypass Penile Revascularization Surgery E.A. Povelitsa, A.M. Shesternya, E.E. Anashkina, O.V. Parhomenko
