CC BY
177
in a mice model of atopic dermatitis. J. Nanobiotech. 2016; 14: 1483—93.
4. Cataldo F. Solubility of fullerenes in fatty acids esters: a new way to deliver in vivo fullerenes. Theoretical calculations and experimental results. Carbon Mater. Chemistry and Physics. 2008; 1: 317—35.
5. Yizhak M., Smith A.L., Korobov M.V. et al. Solubility of C60 Fuller-ene. J. Phys. Chem. 2001; 105 (13): 2499—506.
6. Mchedlov-Petrossyan N.O. Fullerenes in liquid media: an unsettling intrusion into the solution chemistry. Chem. Rev. 2013; 113 (7): 5149—93.
REVIEWS
7. Pycke B.F., Benn T.M., Herckes P. et al. Strategies for quantifying С (60) fullerenes in environmental and biological samples and implications for studies in environmental health and ecotoxicology. Trends Analyt. Chem. 2011; 30 (1): 44—57.
8. Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A., Andreev I. et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by novel dialysis method. Simple way to fullerene aqueous solution. Fullerenes Nanotubes and Carbon Nanostructures. 2015; 23 (9): 792—800.
Поступила 01.08.16 Принята в печать 16.08.16
ОБЗОРЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.112.94.017.1.08
Израельсон М.12, Касацкая С.1-2, Погорелый М.1, Киргизова В.1, Путинцева Е.1, Егоров Е.С.12, Британова О.В12, Чудаков Д.М.1 2
АНАЛИЗ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ РЕПЕРТУАРОВ Т-КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ
1«Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова», 117997, г Москва;
2«Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН», 117997, г. Москва
Все должно быть настолько простым, насколько возможно, но не проще.
Альберт Эйнштейн
Каждый Т-лимфоцит несет на своей поверхности молекулы Т-клеточного рецептора (T-cell receptor, TCR), способные распознать чужеродный антиген и защитить организм от инфекции или онкологического заболевания. Разнообразие репертуара TCR во многом определяет эффективность иммунной защиты и диапазон распознаваемых антигенов. Более того, индивидуальный репертуар TCR содержит в себе потенциально читаемую информацию об эффективности прошедшей вакцинации, о последствиях проведенной иммунотерапии, а также о наличии и динамике заболеваний. Мы расскажем о том, чем современные технологии массированного секвенирования репертуа-ров TCR могут быть полезны сегодня — для фундаментальной иммунологии и биомедицинских исследований, и завтра — для клинической практики.
Ключевые слова: адаптивный иммунитет; репертуар Т-клеточных рецепторов; высокопроизводительное сек-венирование; анализ данных.
Для цитирования. Израельсон М., Касацкая С., Погорелый М., Киргизова В., Путинцева, Е., Егоров Е.С., Британова О.В., Чудаков Д.М. Анализ индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов. Иммунология. 2016; 37(6): 347352. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-347-352
Izrael'son M.1,2*, Kasatskaya S.1,2*, Pogorelyy M1*, Kirgizova V.1, Putintseva E.1, Egorov E.S.1,2, Britanova O.V.1,2, Chudakov D.M.1,2
ANALYSIS OF INDIVIDUAL REPERTOIRES OF T CELL RECEPTORS
'Russian national research medical University named after N. And. Pirogov, 117997, Moscow; 2Institute of Bioorganic chemistry. M.M. Shemyakin and Yu.A. Ovchinnikov RAS, 117997, Moscow
Each of the T-lymphocyte carries on its surface molecules of T-cell receptor (T cell receptor, TCR) that can recognize foreign antigens and protect the body from infection or cancer. The diversity of the TCR repertoire largely determines the effectiveness of immune protection and the range of recognized antigens. Moreover, individual TCR repertoire contains a potentially human-readable information about the effectiveness of previous vaccination, the implications of immunotherapy, as well as the presence and dynamics of diseases. We will talk about how modern technologies of massive sequencing of TCR repertoires may be useful today — for fundamental immunology and biomedical research, and tomorrow — for the clinical practice.
Keywords: adaptive immunity; the repertoire of T-cell receptors; high-throughput sequencing; data analysis.
For citation: Izrael'sonM., Kasatskaya S., PogorelyyM., Kirgizova V., Putintseva, E., EgorovE.S., Britanova O.V., Chudakov D.M. Analysis of individual repertoires of t cell receptors. Immunologiya.2016; 37(6): 347-352. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-347-352
Для корреспонденции: Чудаков Дмитрий Михайлович, д-р мед. наук, проф., E-mail: [email protected]
ОБЗОРЫ
For correspondence: Chudakov Dmitriy Mikhaylovich, Dr. med. Sci., Professor, E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgments. The work was supported by the Russian science Foundation, grant No. 14-14-00533. Catherine V. Putintseva supported by an individual
grant of RFBR № 16-34-60178.
Received 01.06.16 Accepted 07.06.16
введение
В организме взрослого человека насчитывается до триллиона Т-лимфоцитов, задача которых — защитить нас от инфекционных и онкологических заболеваний. Разнообразие потенциальных антигенов чрезвычайно велико, и заложить в организм защитную реакцию к каждому из них было бы невозможно с учетом высокой гетерогенности и быстрой эволюции многих вирусных и бактериальных инфекций.
Адаптивный иммунитет решает эту задачу наиболее изящным способом — генерирует разнообразие случайных последовательностей, кодирующих антитела и Т-клеточные рецепторы (T-cell receptors, TcR), уникальные (точнее, почти уникальные, см. ниже) для каждого клона B- и Т-клеток соответственно. В течение жизни в нашем организме образуется огромное разнообразие клонов Т-лимфоцитов с различными TcR, каждый из которых потенциально способен распознать определенную молекулу антигена (точнее, ряд сходных молекул) в составе комплекса MHc (major histocompatibility complex), презентирующего этот антиген на поверхности зараженных или опухолевых клеток для Т-киллеров либо на поверхности антигенпрезентирующих клеток для Т-хелперных клеток (рис. 1 на обложке).
По современным оценкам, разнообразие репертуара TcR наивных Т-лимфоцитов для одного человека может составлять более 100 млн уникальных вариантов. Большая часть TcR остается незадействованной на протяжении всей жизни. Однако именно большое разнообразие служит залогом того, что для новой инфекции или опухоли найдутся варианты Т-лимфоцитов, специфично распознающие антигены, характерные для данного патогена или патологических клеток. Чем больше вариантов TcR организма, тем выше его шансы выработать эффективный иммунный ответ, а также посредством регуляторных функций Т-лимфоцитов обеспечить сбалансированную и адекватную работу всей иммунной системы.
Наивные Т-лимфоциты, распознавшие свой антиген, активно размножаются и атакуют зараженные или злокачественные клетки, а также инструктируют другие клетки иммунной системы. В то же время Т-клетки памяти — клоны эффекторных Т-лимфоцитов, участвовавших в каждом иммунном ответе, сохраняют высокую численность на многие годы и даже десятки лет. Они защищают нас от повторного заболевания наряду и во взаимодействии с B-лимфоцитами, производящими антиген-специфичные антитела и также образующими клональные популяции клеток памяти.
Таким образом, текущий индивидуальный репертуар TcR определяет эффективность иммунной защиты, диапазон распознаваемых антигенов, а также особенности патологических состояний иммунитета. Более того, репертуар TcR подобно библиотеке содержит в себе потенциально читаемую информацию о многих заболеваниях человека, а также об эффективности прошедшей вакцинации и последствиях проведенной терапии [1, 2].
Сегодня с помощью технологий массированного секвени-рования мы научились читать «книги» в этой библиотеке — идентифицировать геномные последовательности для сотен тысяч и даже миллионов вариантов TcR в образце крови или исследуемой ткани [3—5] (рис. 2 на обложке).
Антигенная специфичность абсолютного большинства вариантов TcR остается неизвестна. Однако технологии
идентификации антиген-специфичных TCR активно развиваются; копится и систематизируется информация о таких рецепторах, в том числе относительно часто встречающихся у разных людей. Таким образом, в будущем станет возможным использовать информацию, содержащуюся в индивидуальных репертуарах TCR, для диагностики многих инфекционных, а возможно, также и онкологических и аутоиммунных заболеваний.
Кроме того, уже сегодня мы получили возможность детально исследовать «структуру текста» — проводить сравнительный анализ репертуаров TCR по широкому спектру параметров, таких как меры разнообразия репертуаров, частоты использования генных сегментов TCR, кластерный анализ близости репертуаров с использованием визуализации в виде дендрограмм и многомерного пространства, сравнение средней длины гипервариабельного участка (CDR3), количества случайно добавленных «п» нуклеотидов, конвергенции (количества нуклеотидных вариантов, кодирующих одну и ту же аминокислотную последовательность), относительной силы взаимодействия и других биофизических параметров аминокислот в составе CDR3.
Стало возможным исследовать, как структура иммунного репертуара меняется с возрастом в ответ на проводимую терапию, после иммуносупрессии, трансплантации клеток крови, вакцинации; как различается состав и структура репертуара TCR для различных функциональных субпопуляций Т-лимфоцитов. Уже сегодня этот подход может рассказать нам очень многое о фундаментальной природе адаптивного иммунитета и находит все большее применение в клинических исследованиях и практических медицинских приложениях.
Здесь мы остановимся на основных фундаментальных находках и практических приложениях, ставших возможными благодаря анализу репертуаров TCR.
Формирование исходного репертуара TCR на этапе рекомбинации. Огромное разнообразие вариантов Т-клеточных рецепторов, как и разнообразие антител, формируется в результате относительно случайной «сборки» — событий рекомбинации, в ходе которых из имеющегося в геноме набора так называемых V, D и J сегментов выбирается по одному варианту.
Относительно произвольная комбинация этих сегментов собирается в новый ген, причем до сшивания двуцепочечных разрывов ДНК на стыке сегментов происходит дополнительное случайное удаление и добавление нуклеотидов. На стыке V- и J-сегментов альфа- и гамма-цепей TCR и на протяжении участка от конца У-сегмента до начала J-сегмента, включая D-сегмент между ними для бета- и дельта-цепей TCR, формируется наиболее вариабельный регион — CDR3. Именно из CDR3 альфа-цепи и бета-цепи TCR (или гамма- и дельта-цепей) формируется поверхность, распознающая эпитоп антигена в бороздке молекулы МНС.
Однако после первичной сборки TСR большая часть (95—98%) Т-лимфоцитов погибает в тимусе в результате позитивной и негативной селекции, направленной на то, чтобы отобрать из множества случайно генерируемых последовательностей TСR работоспособные и безопасные для организма варианты. Эту жесткую селекцию пройдут только те TСR, которые, с одной стороны, принципиально способны распознавать антигены в контексте МНС, а с другой — не проявля-
ют сильного взаимодействия с MHC, несущими собственные пептиды организма. Такой отбор необходим для того, чтобы избежать аутоиммунных реакций — атаки Т-клеток на собственные клетки хозяина.
Интересно, что существенная часть зрелых Т-лимфоцитов помимо функциональных TCR несет на второй, гомологичной, хромосоме также и нефункциональные цепи TCR, со сбитой рамкой считывания либо стоп-кодоном, нарушающими синтез белка. Такие TCR не экспрессируются на поверхности клеток, а значит, и не проходят позитивную и негативную селекцию в тимусе. Таким образом, эти на первый взгляд бесполезные последовательности могут нам многое рассказать о процессе рекомбинационных событий, в ходе которых рождается преселекционный репертуар TCR [6—10]. Сюда можно отнести и частоты используемых генных сегментов, из которых происходит не вполне случайная сборка TcR, число случайно добавленных и удаленных нуклеотидов в местах соединения сегментов и некоторые другие характеристики, определяющие исходную структуру репертуара TcR для каждого человека и в популяции.
На основе данных по репертуарам нефункциональных вариантов TcR была построена вероятностная модель сборки [9] и установлено нуклеотидное разнообразие уже для рабочих, функциональных вариантов преселекционного репертуара бета-цепей TCR, составившее у людей (в целом как популяции) порядка 1013, что существенно ниже, чем предсказания более простых моделей, считающие процессы выбора сегментов и каждый случайно вставленный нуклеотид независимыми событиями [6] (рис. 3). Создание такой модели позволяет исследователям генерировать искусственные репертуары TcR на компьютере, практически точно копируя поведение реальной рекомбинационной машинерии в тимо-цитах человека.
Интересно, что преселекционный репертуар TCR однояйцевых (генетически идентичных) близнецов характеризуется практически идентичными частотами выбора генных сегментов [10], что указывает на решающее влияние индивидуальных генетических особенностей на статистику событий рекомбинации. В то же время, например, в парах мама/ свой ребенок основные характеристики преселекционного репертуара TcR не ближе, чем таковые для пар мама/чужой ребенок [8].
Селекция Т-клеточного репертуара в тимусе. Сравнение репертуаров нефункциональных и функциональных TcR наивных Т-лимфоцитов позволяет достаточно точно определить последствия давления отбора в тимусе. Такие исследования показывают, что тимусная селекция сопровождается выраженным изменением частот встречаемости генных сегментов, из которых собраны TCR. Однако в отличие от событий рекомбинации направленность этих изменений в целом сходна как у близнецов и родственных индивидуумов, так и у неродственных, указывая на то, что общепопуляционные эволюционные факторы доминируют здесь над изменчивостью MHC [8, 9].
Подтверждая предыдущие работы [11, 12], такой анализ показывает, что селекция в тимусе преимущественно оставляет более короткие варианты TcR с низким числом случайно встроенных нуклеотидов [6, 8, 9] и демонстрирует определенные аминокислотные предпочтения в специфических позициях [9], что в целом приводит к существенному упрощению пост-селекционного репертуара. Тем не менее оставшееся разнообразие достаточно велико, чтобы охватить практически весь спектр возможных угроз.
Индивидуальное разнообразие репертуаров функциональных TCR. В 1998—1999 гг. на основании экстраполяции данных клонирования и секвенирования буквально нескольких десятков последовательностей TCR [13], а также с использованием метода предельного разбавления [14] индивидуальное разнообразие бета-цепей TcR в одном взрослом
REVIEWS
человеке было с удивительной точностью оценено в не менее чем 106—107 вариантов.
В 2009 г. индивидуальное разнообразие вариантов бета-цепей TcR впервые оценили на основании данных массированного секвенирования. Нижняя оценка составила ~3 • 106 нуклеотидных вариантов [3], позднее эта цифра была увеличена до ~9 • 106 [15]. Наша текущая оценка достигает 1,2 • 107 для здоровых детей и, возможно, еще вырастет с использованием более глубокого секвенирования репертуаров TcR.
Теоретически, учитывая, что общее число Т-клеток в индивидууме достигает триллиона, а также учитывая клональ-ность наивных лимфоцитов ввиду их экспансии в тимусе, верхнюю границу возможного разнообразия бета-цепей TCR можно оценить как ~108 нуклеотидных вариантов (см. рис. 3). Однако каждый вариант бета-цепи TcR может сочетаться с несколькими вариантами альфа-цепи [13] при образовании функционального TcR в силу того, что независимая рекомбинация альфа-цепи проходит после нескольких раундов деления тимоцита, удачно завершившего перестройку бета-TCR. Таким образом, максимальное индивидуальное нуклеотидное разнообразие альфа-бета TCR может составлять порядка ~109.
При анализе данных массированного секвенирования репертуаров TcR, как и вообще при анализе данных массированного секвенирования, следует учитывать реальный размер анализируемого образца и ограничения в точности ПЦР и самого секвенирования [16]. Действительно, если исходная последовательность нуклеотидов TCR будет прочитана при секвенировании с ошибками, мы увидим вместо одного исходного клона несколько похожих друг на друга. В то же время высокогомологичные варианты TcR действительно присутствуют в реальных образцах. Таким образом, для точной оценки разнообразия нужно уметь видеть и исправлять ошибки ПЦР и секвенирования, при этом сохраняя реальное разнообразие библиотеки. В противном случае мы рискуем либо во много раз переоценить реальное разнообразие, либо, напротив, потерять реально существующие варианты последовательностей TCR [16, 17].
Кроме того, технически возможно провести анализ репертуара TcR лишь для нескольких миллионов Т-лимфоцитов [15], а это только вершина айсберга из триллиона Т-клеток человека. В результате оказывается изученным только «топ» репертуара Т-лимфоцитов, разнообразие наиболее вероятных по событиям сборки и селекции TcR. Таким образом, характеристики анализируемой части репертуара не вполне точно отражают характеристики полного репертуара Т-лимфоцитов, как будет видно из следующего раздела.
Пересечения между индивидуальными репертуарами TCR. Казалось бы, если мы случайно зачерпнем два раза по 108 вариантов бета-цепей TCR из общего теоретического объема вариантов ~3 • 1011 [9], отобранные репертуары не будут значительно пересекаться между этими двумя воображаемыми людьми. Однако сравнение полученных высокопроизводительным секвенированием реальных репертуаров TcR доноров обнаружило одинаковые варианты определенных TcR Т-клеток памяти, встречающиеся у многих людей в популяции [18—20]. Вдобавок обнаружилось неожиданное сходство репертуаров TcR наивных Т-клеток неродственных людей [6, 8, 21].
Подобные «общественные», или публичные (public), варианты TcR возникают в репертуарах в результате часто повторяющихся или конвергентных (разных по природе, но ведущих к той же нуклеотидной последовательности TcR) событий рекомбинации. Определенные варианты TcR генерируются, проходят селекцию в тимусе и встречаются в анализируемом репертуаре с большей вероятностью, чем остальные [3, 9, 22, 23]. Таким образом, репертуары TcR имеют выраженную иерархическую структуру: есть варианты TCR, которые встречаются у большинства, если не у всех, людей, бывают варианты,
ОБЗОРЫ
Математически предсказанное разнообразие ß-цепей TCR в людях: >10"
вероятно, присутствующих у большинства людей
Рис. 3. Популяционное и индивидуальное разнообразие ß-цепей TCR человека.
распространенные в популяции, есть редкие варианты, и наконец, существуют уникальные рецепторы, присущие, возможно, только одному конкретному человеку.
Кроме того, конвергентная рекомбинация также продуцирует варианты TСR с разными нуклеотидными последовательностями, но с одинаковой последовательностью аминокислот [20, 22]. Это существенно сокращает функциональное разнообразие репертуара TСR и увеличивает межиндивидуальное пересечение репертуаров на аминокислотном уровне. Непосредственно наблюдаемое пересечение аминокислотных репертуаров бета-цепей TСR между двумя индивидуумами уже превысило 105 общих вариантов [21]. Более того, экстраполяция данных глубокого секвенирования на общее разнообразие рецепторов предполагает примерно в 40% совпадение общих аминокислотных репертуаров бета-цепей TСR между двумя неродственными людьми [21].
Наиболее распространены те последовательности TСR, которые близки к структуре исходно используемых генных сегментов (характеризуются минимальным числом случайно удаленных и добавленных нуклеотидов). Вероятно, такие TСR являют собой эволюционно выработанные варианты, важные для эффективного ответа иммунной системы против наиболее распространенных инфекций, а также, возможно, выполнения определенных регуляторных функций [24]. Этот же эволюционный механизм, по всей видимости, определяет низкое разнообразие репертуаров TСR у N0 и МА1Т клеток, находящихся функционально где-то между врожденным и адаптивным иммунитетом [25, 26].
Как ни странно, общее пересечение репертуаров TСR практически не различается у неродственных людей, гаплои-дентичных и НЬА-индентичных родственников [6], в парах мама/родной ребенок [8] и между генетически идентичными близнецами [10]. Это показывает, что влияние наследственных факторов на формирование репертуаров TСR наивных Т-лимфоцитов не выходит далеко за рамки использования схожих частот генных сегментов в ходе рекомбинации.
Получается, что иммуном (так можно обозначить совокупность генов TСR и антител человека) гораздо более индивидуален, чем геном или транскриптом. Действительно, геномы и транксриптомы близнецов идентичны, а репертуар TСR индивидуален.
И тем не менее, если посмотреть на самую вершину айсберга, несколько тысяч самых часто встречаемых в периферической крови вариантов TCR, окажется, что пересечение этой части репертуаров для однояйцевых близнецов значительно выше, чем для неродственных индивидуумов [10]. Наиболее вероятным объяснением этого служит частая анти-гензависимая селекция Т-лимфоцитов, несущих идентичные варианты TCR, в одинаковых генетических, инфекционных и внешних условиях.
Пересечения репертуаров между функциональными субпопуляциями Т-лимфоцитов. В зависимости от выполняемых функций и молекулярных маркеров Т-лимфоциты подразделяют на большое количество субпопуляций. Несмотря на ключевую роль в формировании иммунного ответа и развитии патологических состояний, взаимодействие этих субпопуляций, степень их родства, а также способности Т-лимфоцитов к временному или необратимому переходу из одной функциональной субпопуляции в другую до сих пор плохо изучены.
Современное программное обеспечение для анализа данных секвенирования репертуаров TCR позволяет проводить сравнение интересующих функциональных или тканеспеци-фичных субпопуляций Т-лимфоцитов по широкому спектру характеристик [27, 28]. Такие факторы, как относительное разнообразие репертуара TCR и клональность, то есть объем, занятый в субпопуляции пролиферировавшими крупными клонами, может отражать статус и степень вовлеченности субпопуляции в активный иммунный ответ. В то же время пересечения репертуаров Т-клеточных рецепторов позволяют количественно оценить возможные пути перехода клонов Т-лимфоцитов между функциональными субпопуляциями, этиологическую близость субпопуляций, влияние внешних и генетических факторов на формирование разнообразия TCR внутри субпопуляций.
Этот подход уже был использован в целом ряде работ [29—33] и позволил ответить на множество запутанных вопросов. Однако, по большому счету, его потенциал остается практически не раскрытым современной иммунологией. В ближайшие годы можно ожидать появления значительного числа работ, в которых анализ репертуара TCR будет использован как основной инструмент выявления взаимосвязей и характеристических изменений в функциональных субпопуляциях Т-лимфоцитов.
Анализ репертуаров TCR в медицине. Массированное секвенирование репертуаров TCR и антител уже применяют для детекции злокачественного клона (минимальной остаточной болезни, МОБ) после проведенной противоопухолевой терапии у пациентов с лимфоидными опухолями. Здесь уникальную последовательность гена иммунного рецептора используют в качестве генетического маркера лейкемии или лимфомы [34—38]. Измерение уровня МОБ позволяет определить эффективность воздействия химиотерапии и прогноза вероятности рецидива и, значит, важно для выбора стратегии дальнейшей терапии [38—41], такой как аллоген-ная (от другого донора) трансплантация гематопоэтических стволовых клеток (ТГСК). Первый диагностический набор для оценки минимальной остаточной болезни в качестве прогностического маркера при множественной миеломе должен получить одобрение Food and Drug Association (организации, обеспечивающей в том числе контроль и надзор за качеством лекарственных средств и медицинских приборов в США) уже в 2016 г
Оценка последствий аллогенной ТГСК, с точки зрения динамики последующего восстановления Т-клеточного иммунитета и возможных реакций «трансплантат против хозяина», также очень важна для рационального совершенствования терапевтических протоколов [42] и в ближайшем будущем может начать применяться для индивидуального мониторинга лечения каждого пациента.
Другой тип трансплантации гематопоэтических стволовых клеток — аутологичная пересадка (небольшой части предварительно забранных собственных клеток пациента) — используют в сочетании с химиотерапией для лечения тяжелых аутоиммунных заболеваний [43, 44]. В этой области большой интерес представляет посттрансплантационная судьба клональных популяций Т-лимфоцитов [45]. Неожиданно для исследователей анализ репертуаров TCR показал, что очень большое число клонов Т-лимфоцитов (как минимум сотни тысяч) переживает процедуру трансплантации, но происходят выраженные изменения в их относительной представленности [46, 47]. При этом популяция CD4 (так называемые Т-хелперы) все же существенно обновляется, а вот популяция CD8 (так называемые Т-киллеры) преимущественно формируется из активно размножающихся клонов памяти, детектируемых до терапии [48]. На основании этих данных исследователи сегодня ведут усовершенствование методов трансплантационной терапии аутоиммунных заболеваний и заболеваний крови.
Еще одним практическим применением анализа иммунных репертуаров служит количественное определение клональности и состава проникающих в солидную опухоль Т-лимфоцитов (Tumor infiltrating lymphocytes, TlLs). Так, недавние исследования показали, что репертуары TIL относительно гомогенны, если сравнивать первичные и метастиче-ские опухоли, но при этом они отличаются от репертуаров периферической крови [49]. Такой анализ также потенциально позволяет предсказать ответ на иммунотерапию. Предварительные данные для различных типов рака, включая колоректальный рак, рак яичников и глиобластому, показывают, что выраженное присутствие размноженных клонов Т-лимфоцитов в опухоли может коррелировать с лучшим прогнозом для пациента.
Мониторинг изменений Т-клеточного репертуара в периферической крови также представляет интерес с точки зрения иммунологии опухолей. Так, исследования, отслеживающие изменения репертуара TCR, вызванные анти-С^А-4 терапией, показали, что лучший прогноз реакции на терапию связан со стабильностью репертуара [50].
Важно, что последовательности антиген-специфичных TCR часто совпадают у разных людей. TCR предпочтительно распознают определенные мотивы [51, 52], и в контексте ограниченного разнообразия иммуногенных пептидов это ведет к возможности использования анализа индивидуальных репертуаров TcR для диагностических целей. По мере накопления информации о специфичности различных TcR и встречаемости конкретных вариантов TCR («слов») и их паттернов («предложений») при различных заболеваниях возможности для диагностического использования информации о последовательностях TCR при инфекционных, онкологических и аутоиммунных болезнях должны существенно расшириться.
Накопленные сведения об антигенной специфичности конкретных TCR (а в перспективе, возможно, и алгоритмы предсказания их специфичности in silico) также могут быть применены для терапии аутологичными T-клетками или генной терапии с использованием TcR для лечения онкологических [53—55] и инфекционных [56] заболеваний. В то же время слежение за судьбой введенных клонов Т-лимфоцитов с помощью анализа репертуаров TcR может помочь в разработке более эффективных терапевтических протоколов.
Потенциально интересный подход к лечению аутоиммунных заболеваний может быть основан на том, что идентифицированные по последовательности аутоиммунные клоны Т-клеток могут оказаться избирательно элиминированы наряду с —1/30 общего количества Т-клеток с использованием антител, специфичных с конкретному сегменту TcR, либо с использованием генноспецифичных подходов, таких как морфолины или CRISPR-технологии. Анализ репертуаров
REVIEWS
TcR также, возможно, станет полезен для разработки и усовершенствования методов вакцинации, а также для диагностической оценки эффективности ранее проведенной вакцинации — с использованием мониторинга динамики индуцированного Т-клеточного ответа.
Наконец, анализ репертуаров TCR позволяет точно оценить степень старения адаптивного иммунитета [15], последствия проведенной химиотерапии, полученного облучения, воздействия факторов окружающей среды, влияния медикаментов (в том числе иммуномодуляторов и иммуностимуляторов). Такой анализ важен для системной оценки применяемых методов лечения, разработки более эффективных и щадящих для адаптивного иммунитета вариантов терапии и медикаментов, а также методов поддержания функции адаптивного иммунитета в пожилом возрасте.
Современные методы массированного анализа репертуа-ров TCR, а также антител [57] формируют новое направление в исследованиях адаптивного иммунитета. Уже сейчас видны потенциальные клинические приложения, и, возможно, в ближайшие 5—10 лет мы станем свидетелями вхождения массированного секвенирования репертуаров TCR в ежедневную медицинскую практику.
Финансирование. Работа поддержана Российским научным фондом, грант № 14-14-00533. Е.В. Путинцева поддержана индивидуальным грантом РФФИ № 16-34-60178.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература (references)
1. Venturi V., Rudd B.D., Davenport M.P. Specificity, promiscuity, and precursor frequency in immunoreceptors. Curr. OpinImmunol. 2013; 25: 639—45.
2. Woodsworth D.J., Castellarin M., Hol R.A. Sequence analysis of T-cell repertoires in health and disease. Genome Med. 2013; 5: 98.
3. Robins H.S. et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor beta-chain diversity in alphabeta T cells. Blood. 2009; 114: 4099—107.
4. Freeman J.D., Warren R.L., Webb J.R., Nelson B.H., Holt R.A. Profiling the T-cell receptor beta-chain repertoire by massively parallel sequencing. Genome Res. 2009; 19: 1817—24.
5. Mamedov I.Z. et al. Preparing unbiased T-cell receptor and antibody cDNA libraries for the deep next generation sequencing profiling. Front. Immunol. 2013; 4: 456.
6. Robins H.S. et al. Overlap and effective size of the human CD8 + T cell receptor repertoire. Sci. Transl. Med. 2010; 47(2): 64.
7. Murugan A., Mora T., Walczak A.M., Callan C.G., Jr. Statistical inference of the generation probability of T-cell receptors from sequence repertoires. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109: 16161—6.
8. Putintseva E.V. et al. Mother and child t cell receptor repertoires: deep profiling study. Front. Iimmunol. 2013; 4: 463.
9. Elhanati Y., Murugan A., Callan C.G., Jr., Mora T., Walczak A.M. Quantifying selection in immune receptor repertoires. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111: 9875—80.
10. Zvyagin I.V. et al. Distinctive properties of identical twins' TCR repertoires revealed by high-throughput sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2014; 111: 5980—5.
11. Yassai M., Gorski J. Thymocyte maturation: selection for in-frame TCR alpha-chain rearrangement is followed by selection for shorter TCR beta-chain complementarity-determining region 3. J. Immunol. 2000; 165: 3706—12.
12. Nishio J., Suzuki M., Nanki T., Miyasaka N., Kohsaka H. Development of TCRB CDR3 length repertoire of human T lymphocytes. Int. Immunol. 2004; 16: 423—31.
13. Arstila T.P. et al. A direct estimate of the human alphabeta T cell receptor diversity. Science. 1999; 286: 958—61.
14. Wagner U.G., Koetz K., Weyand C.M., Goronzy J.J. Perturbation of the T cell repertoire in rheumatoid arthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95: 14447—52.
15. Britanova O.V. et al. Age-related decrease in TCR repertoire diversity measured with deep and normalized sequence profiling. J. Immunol. 2014; 192: 2689—98.
ОБЗОРЫ
16. Bolotin D.A. et al. Next generation sequencing for TCR repertoire profiling: platform-specific features and correction algorithms. Eur. J. Immunol. 2012; 42: 3073—83.
17. Shugay M. et al. Towards error-free profiling of immune repertoires. NatureMeth. 2014; 11: 653—5.
18. Turner S.J., Doherty P.C., McCluskey J., Rossjohn J. Structural determinants of T-cell receptor bias in immunity. Nature Rev. Immunol. 2006; 6: 883—94.
19. Venturi V. et al. Sharing of T cell receptors in antigen-specific responses is driven by convergent recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103: 18691—6.
20. Venturi V., Price D.A., Douek D.C., Davenpor, M.P. The molecular basis for public T-cell responses? Nature Rev. Immunol. 2008; 8: 231—8.
21. Shugay M. et al. Huge Overlap of Individual TCR Beta Repertoires. Front, Immunol 2013; 4: 466.
22. Quigley M.F. et al. Convergent recombination shapes the clonotypic landscape of the naive T-cell repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107: 19414—9.
23. Li H. et al. Recombinatorial biases and convergent recombination determine interindividual TCRbeta sharing in murine thymocytes. J. Immunol. 2012; 18: 2404—13.
24. Wallace M.E. et al. Junctional biases in the naive TCR repertoire control the CTL response to an immunodominant determinant of HSV-1. Immunity. 2000; 12: 547—56.
25. Greenaway H.Y. et al. NKT and MAIT invariant TCRalpha sequences can be produced efficiently by VJ gene recombination. Immunobiology. 2013; 218: 213—24.
26. Lepore M. et al. Parallel T-cell cloning and deep sequencing of human MAIT cells reveal stable oligoclonal TCRbeta repertoire. Nature Communicat. 2014; 5: 3866.
27. Shugay M. et al. VDJtools: unifying post-analysis of T cell receptor repertoires. PLOS Comp. Biol. 2015; (11): 1004503.
28. Nazarov V.I. et al. tcR: an R package for T cell receptor repertoire advanced data analysis. BMCBioinformat. 2015; 16: 175.
29. Venturi V. et al. A mechanism for TCR sharing between T cell subsets and individuals revealed by pyrosequencing. J. Immunol. 2011; 186: 4285—94.
30. Henderson L.A. et al. A119: deep sequencing analysis of the T regulatory and T effector repertoire in juvenile idiopathic arthritis. Arthr. and rheum. 2014; 66(Suppl. 11): 156.
31. Fohse L. et al. High TCR diversity ensures optimal function and homeostasis of Foxp3 + regulatory T cells. Eur. J. Immunol. 2011; 4: 3101—13.
32. Ye L. et al. TCR usage, gene expression and function of two distinct FOXP3 + Treg subsets within CD4CD25 T cells identified by expression of CD39 and CD45RO. Immunol. Cell. Biol. 2015; 15. doi: 10.1038/icb.2015.90.
33. Feng Y. et al. A mechanism for expansion of regulatory T cell repertoire and its role in self tolerance. Nature. 2015; 528: 132—6.
34. Faham M. et al. Deep-sequencing approach for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia. Blood. 2012; 120: 5173—80.
35. Wu D. et al. High-throughput sequencing detects minimal residual disease in acute T lymphoblastic leukemia. Sci. Transl. Med. 2012; 134(4): 163.
36. Martinez-Lopez J. et al. Prognostic value of deep sequencing method for minimal residual disease detection in multiple myeloma. Blood. 2014; 123: 3073—9.
37. Ladetto M. et al. Next-generation sequencing and real-time quantitative PCR for minimal residual disease detection in B-cell disorders. Leukemia. 2014; 28: 1299—1307.
38. Logan A.C. et al. Immunoglobulin and T cell receptor gene high-throughput sequencing quantifies minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia and predicts post-transplantation relapse and survival. Biol. BloodMarrow Transplant. 2014; 20(9): 1307—13.
39. Logan A.C. et al. High-throughput VDJ sequencing for quantification of minimal residual disease in chronic lymphocytic leukemia and immune reconstitution assessment. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108: 21194—9.
40. Weng W.K. et al. Minimal residual disease monitoring with high-throughput sequencing of T cell receptors in cutaneous T cell lymphoma. Sci. Transl. Med. 2013; 214(5): 171.
41. Logan A.C. et al. Minimal residual disease quantification using consensus primers and high-throughput IGH sequencing predicts post-transplant relapse in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia. 2013; 27: 1659—65.
42. van Heijst J.W. et al. Quantitative assessment of T cell repertoire recovery after hematopoietic stem cell transplantation. Nature Med. 2013; 19: 372—7.
43. Farge D. et al. Autologous hematopoietic stem cell transplantation for autoimmune diseases: an observational study on 12 years' experience from the European Group for Blood and Marrow Transplantation Working Party on Autoimmune Diseases. Haematologica. 2010; 95: 284—92.
44. Snowden J.A. et al. Haematopoietic SCT in severe autoimmune diseases: updated guidelines of the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Bone Marrow Transplant. 2012; 47: 770—90.
45. Muraro P.A., Douek D.C. Renewing the T cell repertoire to arrest autoimmune aggression. Trends Immunol. 2006; 27: 61—7.
46. Mamedov I.Z. et al. Quantitative tracking of T cell clones after haematopoietic stem cell transplantation. EMBO Mol. Med. 2011; 3: 201—7.
47. Britanova O.V. et al. First autologous hematopoietic SCT for ankylosing spondylitis: a case report and clues to understanding the therapy. Bone Marrow Transplant. 2012; 47: 1479—81.
48. Muraro P.A. et al. T cell repertoire following autologous stem cell transplantation for multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 2014; 124: 1168—72.
49. Emerson R.O. et al. High-throughput sequencing of T-cell receptors reveals a homogeneous repertoire of tumour-infiltrating lymphocytes in ovarian cancer. J. Pathol. 2013; 231: 433—40.
50. Cha E. et al. Improved survival with T cell clonotype stability after anti-CTLA-4 treatment in cancer patients. Sci. Transl. Med. 2014; 238(6): 270.
51. Wooldridge L. et al. A single autoimmune T cell receptor recognizes more than a million different peptides. J. Biol. Chem. 2012; 287: 1168—77.
52. Birnbaum M.E. et al. Deconstructing the peptide-MHC specificity of T cell recognition. Cell. 2014; 157: 1073—87.
53. Dudley M.E. et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science. 2002; 298: 850—4.
54. Linnemann C., Mezzadra R., Schumacher T.N. TCR repertoires of intratumoral T-cell subsets. Immunol. Rev. 2014; 257: 72—82.
55. Gros A. et al. PD-1 identifies the patient-specific CD8(+) tumor-reactive repertoire infiltrating human tumors. J. Clin. Invest. 2014; 124: 2246—59.
56. Lam S., Bollard C. T-cell therapies for HIV. Immunotherapy. 2013; 5: 407—14.
57. Boyd S.D., Joshi S.A. High-throughput DNA sequencing analysis of antibody repertoires. Microbiol. Spectrum. 2014; 2. doi: 10.1128/ microbiolspec.AID-0017-20.
Поступила 01.06.16 Принята в печать 07.06.16
