CC BY
28
УДК 577.218:582.951.4
АНАЛИЗ XPOMOCOMHOЙ ОРГАНИЗАЦИИ TY1-COPIA-ПOДOБHЫX РЕТРОТРАНСПОЗОНОВ В ГЕНОМЕ XMEЛЯ ЯПОНСКОГО
О.С. АЛЕКСАНДРОВ, Н.А. ЯКОВИН, М.Г. ДИВАШУК, Г.И. КАРЛОВ (Центр молекуля рной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимиря зева)
С помощью флуоресцентной гибридизации in situ была установлена локализация Tyl-copia-подобных ретротранспозонов на хромосомах хмеля я понского. Было выявлено разреженное распределение сигналов Tyl-copia-подобных ретротранспозонов на половых хромосомах Yx и Y2.
Ключевые слова: хмель японский, FISH, половые хромосомы, Y-хромосомы, Ty1-copia-по добные ретротранспозоны.
Хмель японский (Humulus japonicus Б1еЪоЫ & Еиее.), семейство Cannabaceae — двудомное однолетнее лазающее растение с гетероморф-ными половыми хромосомами — обладает мультихромосомной половой системой [19]. Женские растения этого вида имеют 2п = 16 (14 + ХХ), а мужские — 2п = 17 (14 + ХУ1У2), что свидетельствует о схожести половой системы хмеля я понского с половой системой щавеля (Rumex acetosa) [8,
17, 18]. Цитогенетические данные об организации генома и особенно структуры половых хромосом для хмеля понского практически отсутствуют в отличие от щавеля, хмеля обыкновенного и конопли посевной, хорошо изученных благодар их хоз йствен-ному значению.
Большое значение в исследовании межгенных компонентов эукариотических геномов имеет картирование участков Ty1-copia-подобных ретротранспозонов. Ty1-copia-подобные
элементы обнаружены во всех изученных геномах растений [21]. Изу-
чение распределения ретротран-
спозонов по геному растений имеет важное значение для понимания структурно-функциональной орга-
низации хромосом, так как формирование структуры хромосом — это процесс, частью которого является транспозиция весьма распространённого семейства Ty1-copia-по добных ретроэлементов. Одним из наиболее эффективных инструментов физического картировани последовательностей ДНК является флуоресцентная in situ гибридизация [2]. In situ гибридизация фрагментов семейства Ty1-copia на метафазных хромосомах различных видов растений показала, что обычно они распределены по всей длине хромосомы, за исключением таких функционально важных частей, как теломеры, центромеры и сайты локализации рибосомальных генов [1, 15]. Установлено также, что Ty1-copia-подобные элементы или их части локализуютс в регионах, фланкирующих гены у многих растений [23]. Однако существуют и такие
виды, у ^TOphix выявлена неодно-poднocть pacпpеделения pетpoтpaн-спозонов вдоль xpoмocoмы. Так, для apaбидoпcиca, томата, свеклы и нута показана локализация pетpoтpaнcпo-зонов в основном в областях пpицен-тpoмеpнoгo гетеpoxpoмaтинa [1, 5]
или их отсутствие в блоках конститутивного интеpкaляpнoгo гетеpoxpo-матина у тюльпана [11].
В данной paбoте впеpвые пpед-ставлены pезyльтaты изучения xpo-мосомной opгaнизaции Ty1-copia-подобных pетpoтpaнcпoзoнoв у хме-л понского.
Материалы и методы
В качестве pacтительнoгo мате-pиaлa в paбoте использовали мужские и женские pacтения хмеля я понского copтa Caмypaй (фиpмa «Гaвpиш»).
ДНК выдел ли из молодых листьев pacтений согласно методике Bern atsky and Tanksley (1986) [4] с некoтopыми модификация ми.
Для амплификации пула фpaг-ментов гена oбpaтнoй тpaнcкpиптa-зы Ty1-copia-пo добных pетpoтpaн-спозонов paзмеpoм около 260 п.н. пpименяли пoлимеpaзнyю цепную pеaкцию (ПЦР) с использованием вьфожденных пpaймеpoв: PR1 5'-
ACNGCNTTYYTNCAYGG-3' и PR2 5'-CARATGGARGTNAARAC-3' [5].
Пpaймеpы cинтезиpoвaны ЗАО “Син-тол”, Москва.
Флуоресцентна гибридизаци in situ (FISH). FISH осуществл ли по cтaндapтнoй методике [12] с некото-pыми модификация ми. Пpoбy создавали из очищенного с помощью гель-электpoфopезa пула ПЦP-фpaгментoв гена oбpaтнoй тpaнcкpиптaзы Ty1-copia-подобных pетpoтpанcпoзoнoв
paзмеpoм около 260 п.н. с последующим мечением биoтинилиpoвaнным (для женских pacтений) или DIG-dUTP (мужские pacтения) ПЦР в течение 30 циклов. Xpoмocoмы кон-тpoкpaшивaли пpoпидий-йoдидoм
или DAPI — 1 мг/мл. Визуализацию сигнала осуществл ли с использованием флyopеcцентнoгo микpocкoпa AxioZeiss Imager M1 с помощью соответствующего нaбopa фильтpoв.
Результат дoкyментиpoвaли на фото-кaмеpy AxioCam Mrm Zeiss с последующим кoнтpacтиpoвaнием изoбpa-жения в пpoгpaмме AxioVision.
Результаты и их обсуждение
После пpoведения ПЦР на ДНК хмеля японского с выpoжденными пpaймеpaми на фpaгмент гена об-paтнoй тpaнcкpиптaзы Ty1-copia-подобных pетpoтpaнcпoзoнoв были получены пpoдyкты paзмеpoм около 260 п.н. Флyopеcцентнyю гибpиди-зацию in situ Ty1-copia-пoдoбныx pетpoтpaнcпoзoнoв пpoвoдили с использованием меченого ПЦP-пpoдyк-та на цитологических пpепapaтax митотических метафазных xpoмocoм как мужских, так и женских pacтений хмеля я понского. Анализ метафазных пластинок женских pacтений показал, что зонды Ty1-copia-пoдoбныx pетpoтpaнcпoзoнoв гибpидизyютcя со всеми шестнадцатью xpoмocoмaми хмеля я понского фисунок, а). Данное pacпpеделение у хмеля я понского не является уникальным, поскольку в большинстве исследований показано, что pетpoтpaнcпoзoны обычно paвнo-меpнo pacпpеделены по всему геному [10].
Анализ метафазных пластинок мужских pacтений показал, что зонды Ty1-copia-пoдoбныx pетpoтpaн-спозонов гибpидизyютcя со всеми xpoмocoмaми хмеля японского. Однако xapaктеp pacпpеделения по xpo-мосомам paзличен. У 15 xpoмocoм из 17 флyopеcцентный сигнал был pac-пpеделен paвнoмеpнo по всей пpoтя-женности xpoмocoмы. А у двух xpoмo-сом из 17 наблюдалась paзpеженнaя локализаци сигнала с наибольшей интенсивностью в дистальных областях рисунок, б). Эти xpoмocoмы
Метафазные пластинки женского (а) и мужского (б) растений хмеля японского с сигналами зондов Ту1-еор1а-подобных ретротранспозонов (Х — половая хромосома Х; стрелками обозначены хромосомы У)
были самыми большими в наборе. Ранее было показано, что три самые длинные хромосомы генома хмеля японского — это половые хромосомы: X, и У2 [20]. На метафазных пла-
стинках женских растений наблюдалось равномерное распределение сигнала по всем хромосомам, включая две Х-хромосомы. Поэтому две хромосомы с разреженным сигналом на мужских растениях были нами идентифицированы как половые: и У2.
Неравномерна интенсивность сиг-
нала на этих хромосомах, возможно, св зана с низким количеством копий изучаемого класса ретротранспозо-нов. При этом нельз исключать и возможность того, что ДНК У! и У2-хромосом доступна дл гибридизации ДНК-зондов не на всей протяженности этих хромосом [13], так как они наход тс в компактизованном состоянии в течение всего клеточного цикла [9].
Таким образом, нами были выявлены различия в локализации Ty1-copia-подобных ретротранспозонов
между половыми хромосомами у хме-л понского. Данный факт открывает широкое поле дл новых дискуссий об эволюции половых хромосом у двудомных растений.
В настоящее время основной теорией возникновени гетероморфизма половых хромосом я вля ется вырождение У-хромосомы. Однако вопрос о том, как происходит данный процесс, является в настоящее время крайне спорным и малоизученным. Так, некоторые авторы предполагают, что основным фактором дегенерации У-хромосомы может являться накопление повтор ющихс последовательностей, включая транспозоны [7]. По мнению многих авторов, подобный факт может иметь место на межгенных участках и интронах. И это может быть ранним шагом эволюции У-хромосомы (до того, как гены начнут дегенерировать), приводящим к снижению давления отбора против инсерций в нерекомбинирующих частях мужских половых хромосом [3,
6, 14]. Другие исследователи выдвигали гипотезы, что основным фактором вл етс эпигенетически регулируема конденсаци У-хромосом в интерфазных драх, в частности у щавеля и хмеля я понского, что приводило в дальнейшем к накоплению АТ-богатых последовательностей в У-хромосомах (специфично дл полиморфной системы половых хромосом (ХХ/ХУ1У2)) посредством пере-
хода цитозина в тимин путем метилирования, и уже затем — к деградации У-хромосомы именно благодар этим процессам [16, 17].
Полученные нами данные о разреженном сигнале Ty1-copia-подобных ретротранспозонов на У-хромосомах могут свидетельствовать о том, что либо в процессе формирования данных хромосом большую роль играли хромосомные перестройки, нежели транспозиции, либо транспозиции осуществл лась другими семействами ретротранспозонов. В то же время при изучении локализации всех се-
мейств ретротранспозонов и возможных транслокаций, за счет которых также могут формироваться половые хромосомы [22], полученные нами данные могут свидетельствовать и в пользу эпигенетической модели деградации У-хромосом у хмеля я пон-ского. Однако эти вопросы остаютс дискуссионными и требуют дальнейших исследований.
Работа выполнена при финансовой поддержке ФЦП “Научные и научнопедагогические кадры инновационной России”, ГК № П1164.
Библиографический список
1. Карлов Г.И., Фесенко И.А., Андреева Г.Н., Хрусталева Л.И. Хромосомная организация Tyl-copia-подобных ретротранспозонов в геноме томата // Генетика, 2010. Т. 46. № 6. 769-773.
2. Хрусталева Л.И. Молекул рна цитогенетика в селекции растений // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии,2007. № 1. С. 45-55.
3. Armstrong S.J., Filatov D.A. A cytogenetic view of sex chromosome evolution in plants // Cytogenet Genome Res., 2008. 120, 241-246.
4. Bernatsky R., Tanksley S.D. Toward a saturated linkage map of tomato based on isozymes and random cDNA sequences // Genetics, 1986. 120, 1095-1103.
5. Branders A., Heslop-Harrison J.S., Kamm A. et al. Comparative analysis of the chromosomal and genomic organization of Tyl-copia-like retrotransposons in pteridophytes, gymnosperms and angiosperms // Plant Molec. Biology, 1997. 33, 11-21.
6. Charlesworth D. Plant sex chromosomes, in Volff J-N (ed): Plant Genomes, Genome Dynamics, 2008. 83-94 (Karger, Basel).
7. Grabowska-Joachimiak A., Joachimiak A. C-banded karyotypes of two Silene species with heteromorphic sex chromosomes // Genome, 2002. 45, 243-252.
8. Grabowska-Joachimiak A., Sliwinska E., Pigula M., Skomra U., Joachimiak A.J. Genome size in Humulus lupulus L. and H. japonicus Siebold & Zucc. (Can-nabaceae) // Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 2006. 75, 207-214.
9. Grabowska-Joachimiak A., Mosiolek M., Lech A., Gyralski G. C-Banding/ DAPI and in situ Hybridization Reflect Karyotype Structure and Sex Chromosome Differentiation in Humulus japonicus Siebold & Zucc // Cytogenet Genome Res., 2010, 1-9. DOI: 10.1159/000321584
10. Heslop-Harrison J.S. Comparative genome organization in plants: from sequence and markers to chromatin and chromosomes. // Plant Cell., 2000. 12, 617-635.
11. Karlov G.I., Andreeva G.N., Fesenko I.A., Khrustaleva L.I. Characterization and chromosome location of Tyl-copia group retrotransposons in some Alliaceae, Lili-aceae and Iridaceae species // Cytogenetics and Cell Genetics, 1999. 85, 135.
12. Karlov G.I., Khrustaleva L.I., Lim K.B., Van Tuyl J.M. Homoeologous recombination in 2n-gametes producing interspecific hybrids of Lilium (Liliaceae) studied by genomic in situ hybridization (GISH) // Genome, 1999. 42, 681.
13. Kazama Y., Sugiyama R., Suto Y., Uchida W., Kawano S. The clustering of four subfamilies of satellite DNA at individual chromosome ends in Silene latifolia // Genome, 2006. 49, 520-530.
14. Kejnovsky E., Hobza R., Cermak T., Kubat Z., Vyskot B. The role of repetitive DNA in structure and evolution of sex chromosomes in plants // Heredity, 2009. 102, 533-541.
15. Kumar A., Pearce S.R., McLean K. The Tyl-copia group of retrotranspo-sons in plants: genomic organisation, evolution, and use as molecular markers // Genetica, 1997. 100, 205-217.
16. Mosiolek M., Pasierbek P., Malarz J., Mos M., Joachimiak A.J. Rumex aceto-sa Y chromosomes: constitutive or facultative heterochromatin? // Folia Histochem Cytobiol., 2005. 43, 161-167.
17. Parker J.S. & Clark M.S. Dosage sex-chromosome systems in plants. Plant Science, 1991. 80, 79-92.
18. Shephard H.L., Parker J.S., Darby P. & Ainsworth C.C. Sexual development and sex chromosomes in hop // New Pythol., 2000. 148, 397-411.
19. Small E. A numerical and nomenclatural analysis of morpho-geographic taxa of Humulus. Syst Bot., 1978. 3, 37-76.
20. Soo-Young Kim, Chan-Soo Kim, Joongku Lee and Jae-Wook Bang Karyotype Analysis and Physical Mapping Using Two rRNA Genes in Dioecious Plant, Humulus japonicus Sieboid & Zucc // Korean J Genetics, 2008. 30 (2), 157-161.
21. Voytas D.F., Cummings M.P., Konieczny A. et al. Copia-like retrotranspo-sons are ubiquitous among plants // Proa Natl Acad. Sci. USA, 1992. 89, 7124-7128.
22. Watanabe K. , Yahara T., Denda T. , Kosuge K. Chromosomal evolution in the genus Brachyscome (Asteraceae, Astereae): statistical tests regarding correlation between changes in karyotype and habit using phylogenetic information // J. Plant Res, 1999. 112, 145-161.
23. White S.E., Habera L.F., Wessler S.R. Retrotransposons in the flanking regions of normal plant genes: A role for copia-like elements in the evolution of gene structure and expression // Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1994. 91, 11792-11796.
Рецензент — д. б. н. Л.Н. Хрусталева
SUMMARY
Japanese Hop (Humulus japonicus Siebold & Zucc.), Cannabaceae family -a dioecious plant with heteromorphous reproductive chromosomes and having multi-chromosomal system with a number 2n = 16 (14 + XX) for pistillate plants, and 2n = 17 (14 + XY1Y2) for male plants. By means of fluorescent hybridization in situ Tyl-copia-like retrotransposons localization on Japanese Hop chromosomes is determined. Rarefield distribution of Tyl-copia-like retrotransposons signals on reproductive chromosomes Y1 and Y2 has been detected.
Key words: Japanese Hop, FISH, reproductive chromosomes, Y-chromosomes, Tyl-copia-like retrotransposons.
Александров Олег Сергеевич — асп. Центра молекулярной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева. Тел. (499) 977-70-06.
Яковин Николай Анатольевич — асп. Центра молекулярной биотехнологии РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева.
Дивашук Михаил Георгиевич — к. б. н.
Карлов Геннадий Ильич — к. б. н. Эл. почта: [email protected]
