CC BY
252017, том 20, №3
УДК 618.19-006.03-089-074:616-002
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРА ПРОЛИФЕРАЦИИ KI-67 В ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ УЗЛОВЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВЫРАЖЕННОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ В ЕЁ ТКАНЯХ
Усманова Т. Э.
Кафедра хирургии № 2, Медицинская академия имени С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им.
В. И. Вернадского», 295051, бульвар Ленина, 5/7, Симферополь, Россия
Для корреспонденции: Усманова Тамила Эскандеровна, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры хирургии № 2
Медицинской академии им. С. И. Георгиевского ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет им. В. И. Вернадского», е-mail:
For correspondence: Tamila Usmanova, PhD, Assistent of the Department of surgery № 2, at the Medical Academy named after S. I.
Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia, e-mail: [email protected]
Information about authors:
Usmanova T. E. http://orcid.org/0000-0001-5050-9487
РЕЗЮМЕ
На основании анализа экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 в трепан-биоптатах доброкачественных узловых образований молочных желез 38 больных репродуктивного возраста выделено 2 клинические группы: 1 группа (n=23) - доброкачественные узловые образования молочных желез с воспалением (экспрессия CD45+ клеток (134,3±8,4) %), 2 группа (n=15) - доброкачественные узловые образования молочных желез без воспалительной реакции в тканях (экспрессия CD45+ позитивных клеток (9,5±1,5) %). На фоне высокой экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 отметили повышение пролиферативной активности эпителия - рост индекса пролиферации Ki-67 до уровня (24,6±1,6) % позитивных клеток, что в 3,3 раза превышало его значение в тканях доброкачественных узловых образований молочных желез с низким уровнем воспалительной реакции.
Ключевые слова: молочные железы, доброкачественные узловые образования молочной железы, иммуногистохимия, воспалительная реакция, трепан-биоптат.
ANALYSIS OF EXPRESSION MARKERS OF PROLIFERATION KI-67 IN BENIGNE BREST TUMORS IN RELATION TO SEVERITY OF INFLAMMATORY REACTIONS IN ITS TISSUES
Usmanova T. E.
Medical Academy named after S. I. Georgievsky of Vernadsky CFU, Simferopol, Russia
SUMMARY
Based on the analysis of the expression of total leukocyte antigen CD45 in trephine - biopsies of benign breast tumors in 38 patients of reproductive age allocated 2 clinical groups: group 1 (n=23) - benign breast tumors with inflammation (expression CD45+ cells (134.3± 8.4)%), group 2 (n=15) - benign breast tumors without inflammatory response in tissues (expression of positive CD45+ cells (9,5 ± 1,5)%). On the background of high expression of the common leukocyte antigen CD45 noted an increase in the proliferative activity of the epithelium - proliferation index Ki-67 growth to the level (24,6 ± 1,6)% of positive cells, which is 3.3 times higher than its value in the tissues of benign breast tumors with low inflammatory response.
Key words: brest, benign breast tumors, immunohistochemistry, inflammatory response, trephine-biopsy.
В настоящее время иммуногистохимический (ИГХ) метод широко распространен в онкологической практике. Разработан целый арсенал ИГХ маркеров для рака молочной железы (РМЖ), которые отражают разные стороны и уровни функционирования опухолевой клетки, дают возможность определять прогноз заболевания, предполагать и оценивать эффективность лечебных мероприятий. Одним из таких маркеров является индекс пролиферации Ю-67. Установлено, что экспрессия К1-67 меняется в пределах всего клеточного цикла, а именно возрастает к митозу, значительно снижается в анафазе и телофазе. Это доказывает тот
факт, что белок является точным маркером роста клеточной фракции. Таким образом, рост экспрессии маркера пролиферации Ю-67 свидетельствует о высоком проценте клеток опухоли, находящихся в стадии пролиферации, и, как следствие, о плохом прогнозе при раке молочной железы [1, 2].
К сожалению, вопросы по исследованию ИГХ маркеров при предопухолевых заболеваниях молочных желез (МЖ) для оценки риска их возможной малигнизации до сих пор остаются недостаточно изученными. Многими авторами установлено, что риск малигнизации при умеренной пролиферации в дисгормональных дисплазиях МЖ
составляет 2,34 %, достигая при резко выраженной пролиферации 31,4 % [3-6].
Не менее важное значение в прогрессии патологии может играть и степень воспалительных изменений в тканях МЖ при её доброкачественных узловых образованиях. Так, в последнее десятилетие активно изучается вопрос патогенетической роли воспаления в канцерогенезе. Большинство авторов указывает на то, что воспаление, ассоциированное с опухолевым ростом, является фактором промоции и прогрессии патологии, фактором риска, предрасполагающим к малигнизации [7-15]. Это объясняется тем, что при длительном характере воспалительных изменений, наряду с нарушением иммунного контроля клеток, продолжает повреждаться клеточная микросреда, что в дальнейшем приводит к изменению степени генетической стабильности клеток с повышением риска активации онкогенов [16-22]. Параллельное изучение воспалительной реакции и маркера пролиферации Ki-67 может позволить уточнить прогноз риска малигнизации, рецидивирования и прогрессиро-вания патологии при доброкачественных узловых образованиях молочных желез (ДУОМЖ) [20].
В связи с этим целью нашего исследования стало изучение особенностей экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в ДУОМЖ в зависимости от наличия воспалительной реакции в их тканях.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Обследовано 38 больных репродуктивного возраста с ДУОМЖ (фиброаденома, узловая фиброз-но-кистозная мастопатия).
Критерии включения в исследование были следующие: репродуктивный возраст больных -от 15 до 49 лет (в соответствии с критериями ВОЗ, 1990); клинические признаки доброкачественного узлового образования в МЖ, подтвержденного на дооперационном этапе результатами ультразвукового исследования (УЗИ), маммографии, цитологического и гистологического исследования; установление диагноза ДУОМЖ согласно гистологической (ВОЗ, 2003 г.) и клинико-морфологической классификации Рожковой (1985 г.).
Критерии невключения в исследование: возраст больных младше 15 и старше 49 лет; клинические признаки РМЖ на дооперационном этапе по результатам УЗИ, маммографии, цитологического исследования; одновременное участие в другом клиническом исследовании.
Во всех случаях выполнена трепан-биопсия с 5-го по 10-й день менструального цикла с использованием толстой иглы под ультразвуковой навигацией с помощью биопсийного пистолета Bard Magnum для забора тканевого материала. В качестве контроля использован аутопсийный матери-
ал, взятый у женщин репродуктивного возраста (n=10), умерших от другой патологии.
ИГХ исследование в трепан-биоптатах ДУОМЖ проводили по стандартизованной методике с использованием серийных парафиновых срезов толщиной 4-5 мкм, помещенных на адгезивные стёкла, покрытые полизином («Menzel-Glaser», Германия) [21]. ИГХ исследование осуществлялось с помощью системы визуализации EnVision™ FLEX +, High pH (Dako Autostainer/Autostainer Plus), Code K8024, предназначенной для работы на автостей-нере (Dako Autostainer Instruments). Демаскировку антигенов выполняли в камере Паскаля в течение 3-х минут с нарастающей температурой до 115 °С и последующим постепенным снижением температуры. Автостейнер обеспечивает стандартизацию в постановке ИГХ метода исследования и получение препаратов высокого качества для последующей корректной диагностики.
С целью идентификации клеток лимфоидного ряда проводили ИГХ исследование с использованием мышиного моноклонального антитела к рецепторам общего лейкоцитарного антигена CD45 (Clone 2B11 + PD7/26), согласно протоколу исследования фирмы Dako. Результаты ИГХ оценивали с учётом распределения и количества клеток с трансмембранной экспрессией позитивных CD45+ клеток в строме МЖ. В качестве позитивного контроля использовали ткань миндалин, в качестве негативного контроля - ткань мозга.
Пролиферативную активность изучали с помощью моноклональных антител Ki-67 (клон MIB-1), которые идентифицируют ядерный антиген, присутствующий у большинства пролиферативных клеток. Антиген Ki-67 - короткоживущий протеин, разрушающийся на протяжении 1-1,5 часов, выявляется только в клетках, которые делятся, так как не успевает накапливаться и не остается в спокойных клетках [2, 22].
Количественный анализ результатов ИГХ реакций проводили в 10 полях зрения при увеличении х200 в очагах с преобладающими диагностическими проявлениями. Оценку уровня внутриядерной экспрессии Ki-67 проводили с учетом интенсивности окраски и распределения в эпителии в процентном эквиваленте на 100 клеток в 10 случайно выбранных полях зрения микроскопа гистологических срезов при увеличении х200 [2].
Все полученные результаты были подвергнуты статистической обработке для параметрических и непараметрических критериев. При анализе проверки распределения на нормальность использовали Хи-квадрат и критерий W Шапиро - Уилка, сравнение центральных тенденций двух независимых выборок с использованием W-критерия Вилкоксона, сравнение средних двух независимых выборок по критерию Стьюдента.
2017, том 20, №3
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты гистологического исследования оценивались нами на основании критериев, рекомендованных ВОЗ в 2003 году. Морфологическую оценку ткани МЖ при ДУОМЖ проводили, учитывая соотношение структурных компонентов, таких как дольки, протоки, фиброзная и жировая ткани. Также обращали внимание на наличие воспалительной реакции, пролиферативной активности эпителия протоков.
Однако по данным гистологического исследования сложно судить не только о степени выраженности хронического воспаления, но и о зависимости воспалительного процесса от степени гиперпластических изменений в ткани МЖ. В связи с этим нами выполнено ИГХ исследование в трепан-биоптатах МЖ экспрессии общего лейкоцитарного антигена СБ45. На основании анализа результатов изучения экспрессии общего лейкоцитарного антигена СБ45 в трепан-биоптатах МЖ было выделено 2 клинические группы: 1 группа (п=23) - ДУОМЖ с воспалением, характеризовалась наличием позитивной реакции общего лейкоцитарного антигена СБ45, экспрессия которого визуализировалась в клетках воспалительного инфильтрата - лейкоцитах и лимфоцитах. Воспалительный инфильтрат в большей степени располагался вокруг железистых структур и в строме (рис. 1). Экспрессия СБ45+ клеток составила (134,3±8,4) % клеток лимфоидного ряда в исследуемых полях зрения при увеличении микроскопа 200 (табл. 1).
клеток в железистой ткани МЖ составил (2,0±0,3) % (табл. 1).
В выделенных группах исследования изучили особенности экспрессии маркера пролиферации Ю-67, что позволило определить зависимость выраженности пролиферативных изменений в ДУ-ОМЖ от уровня воспалительной реакции в тканях.
ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе внутриядерной экспрессии индекса пролиферации Ю-67 в группах исследования выявлено, что пролиферативная активность в многорядном эпителии протоков была выше именно в группе с выраженным воспалительным компонентом в тканях ДУОМЖ. Так, позитивная реакция с Ю-67 в 1-й группе варьировала в пределах от 16 до 37 на 100 эпителиальных клеток, что составило в среднем (24,6±1,6) % позитивных клеток (рис. 2, табл. 1). Во 2-й группе позитивная реакция с Ю-67 определялась в эпителии протоков с уплощенным, одно- и двухрядном эпителии кист в небольшом количестве и варьировала в пределах от 3 до 10 позитивных клеток на 100 эпителиальных клеток, составив (7,4±1,0) %.
Достоверность различий показателей индекса пролиферации Ю-67 была установлена между группами и относительно группы контроля (р<0,05) (рис. 3, табл. 1).
Рис. 2. Группа 1. ДУОМЖ с воспалением. Экспрессия Ю-67. ИГХ. Система визуализации EnV¡sюn™ FLEX+ Ув. Х 400
Рис. 1. Группа 1. Выраженная экспрессия CD45+ клеток в строме и вокруг железистых структур.
ИГХ. Система визуализации EnVision™ FLEX+ Ув. Х 100
Во 2-й группе (п=15) - ДУОМЖ без воспаления, определялись единичные клетки воспалительного ряда, что составило (9,5±1,5) % СБ45+ клеток. В группе контроля уровень экспрессии СБ45+
Таким образом, при проведении анализа результатов ИГХ исследования в тканях ДУОМЖ нами установлена прямая пропорциональная связь между уровнем экспрессии общего лейкоцитарного антигена СБ45 и индекса пролиферации Ю-67. Это позволяет предположить, что воспаление в тканях МЖ при её доброкачественной узловой патологии является одним из возможных местных патогенетических факторов риска формирования
Таблица 1
Уровень экспрессии общего лейкоцитарного антигена CD45 и индекса пролиферации №-67 в группах
исследования (M±m), (%)
№ Группа больных CD45 Ki-67
1 ДУОМЖ с воспалением (n=23) 134,3±8,4 */** 24,6±1,6*/**
2 ДУОМЖ без воспаления (n=15) 9,5±1,5* 7,4±1,0*
3 Контроль (n=10) 2,0±0,3 3,9±0,7
Примечание: * - достоверность различий по отношению к контролю; ** - между группами (р < 0,05)
Рис. 3. Показатели индекса пролиферации Ki-67 в исследуемых группах
патологии и усиления пролиферативной активности эпителия. Рост уровня экспрессии индекса пролиферации К1-67 и, соответственно, прогрес-сирование пролиферативных изменений в тканях МЖ свидетельствуют о повышении степени риска возможной малигнизации ДУОМЖ. Следовательно, одним из важных направлений в разработке оптимальных лечебно-диагностических программ является диагностика воспалительных изменений в тканях МЖ и применение направленной на местные патогенетические факторы формирования патологии консервативной терапии, которая будет неотъемлемой частью хирургического лечения больных с пролиферативными формами ДУОМЖ.
ВЫВОДЫ
1. Повышение экспрессии общего лейкоцитарного антигена СБ45 в тканях ДУОМЖ сопровождается параллельным ростом уровня экспрессии индекса пролиферации Ю-67.
2. Прямая пропорциональная зависимость уровня индекса пролиферации Ю-67 от выраженности экспрессии общего лейкоцитарного антигена СБ45 свидетельствует о патогенетическом значении воспаления в тканях ДУОМЖ в прогрессиро-вании патологии, повышении риска малигнизации.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Шайкина А. С., Рыжавский Б. Я., Беков С. В., Буробин И. Н., Кудянов Е. Г. Иммуногистохими-ческий анализ рецепторов эстрогенов и прогестерона, Ю-67 в молочной железе в норме, при раке
и доброкачественных опухолях. Дальневосточный медицинский журнал. 2011; 1:34-37.
2. Jamaica D. Cass, Sonal Varma, Andrew G. Day, Waheed Sangrar, Ashish B. Rajput, Leda H. Raptis, Jeremy Squire, Yolanda Madarnas, Sandip K. SenGupta, Bruce E. Elliott. Automated Quantitative Analysis of p53, Cyclin D1, Ki67 and pERK Expression in Brest Carcinoma Does Not Differ from Expert Pathologist Scoring and Correlates with Clinico-Pathological Characteristics. Cancers. 2012; 4:725-742. D01:10.3390/cancers4030725
3. Дубшша В. Г., Заволока О. В., Шпак И. В. Досвщ удосконалення роботи щодо профшактики та раннього виявлення захворювань молочно! за-лози серед жшочого населення Одеси. Одеський медичний журнал. 2013; 2:72-76.
4. Дубшша В. Г., Четверков С. Г., Заволока О. В., Лукьянчук О. В., Морозюк О. Н. Оптимiзацiя алгоритму дiагностики доброяюсних вузлових новоутворень молочних залоз. Хiрургiя Украши. 2013; 4:88-91.
5. Тагиева Т. Т. Факторы риска развития заболеваний молочных желез. Вестник РОНЦ им Н. Н. Блохина РАМН. 2007; 3:68-72.
6. Zavoloka A. V. Benigne brest tumors diagnosis: recent advances. Journal of health Sciences. 2013; 3(10):665-674.
7. Маянский А. Н., Маянский Н. А., Заславская М. И. Нуклеарный фактор-KB и воспаление. Цито-кины и воспаление. 2007; 6(2):3-9.
8. Ancrile B., Lim K. H., Counter C. M. Oncogenic Ras-induced secretion of IL6 is required for tumorigenesis. Genes Dev. 2007; 21:1714-1719. D0I:10.1101/gad.154940
2017, том 20, №3
9. Mantovani A., Allavena P., Sica A., Balkwill F. Cancer-related inflammation. Nature. 2008; 454:436444. D01:10.1038/nature07205
10. DeNardo D. G., Johansson M., Coussens L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev. 2008; 27:11-18. D0I:10.1007/ s10555-007-9100-0
11. Greten F. R., Karin М. NF-kB: Linking Inflammation and Immunity to Cancer Development and Progression. Nature Reviews Immunology. 2005; 5:749-759. D0I:10.1038/nri1703
12. Grivennikov S., Karin М. Dangerous liasons: STAT 3 and NF-kB collaboration and crosstalk in cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21 (1):11-19. D0I:10.1016/j.cytogfr.2009.11.005
13. Grivennikov S. I., Karin М. Inflammation and oncogenesis: a vicious connection. Curr. Opin. Genet. Dev. 2010; 20(1):65. D0I:10.1016/j.gde.2009.11.004
14. Karin M. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. Nature. 2006; 441:431436. D0I:10.1038/nature04870
15. Yu H., Kortylewski H. Yu. M., Pardoll D. Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT 3 in the tumor microenvironment. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7:41-51. D0I:10.1038/nri1995
16. Литвинова С. В., Коваленко Е. П., Фомоч-кина И. И., Кубышкин А. В. Сравнительная эффективность использования протеиназ и цитокинов для определения выраженности воспалительного процесса при гиперплазиях эндометрия. Таврический медико-биологический вестник. 2012; 15(3), Ч. 2(59):153-157.
17. Bourboulia D., Stetler-Stevenson W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): Positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin Cancer Biol. 2010; 20(3):161-168. D0I:10.1016/j. semcancer.2010.05.002
18. Drake C. G., Jaffee Е., Pardoll D. M. Mechanisms of immune evasion by tumors. Adv. Immunol. 2006; 90:51-81. D0I:10.1016/S0065-2776(06)90002-9
19. Noemi Eiro, Francisco J. Vizoso Inflammation and cancer. World J. Gastrointest Surg. 2012; 4(3):62-72. D0I:10.4240/wjgs.v4.i3.62
20. Усманова Т. Э., Филатов А. С., Ильченко Ф. Н., Филоненко Т. Г., Бойко Т. А. Комплексное морфологическое и иммуногистохимическое исследование доброкачественных узловых образований молочной железы с оценкой воспалительной реакции в её тканях. Таврический медико-биологический вестник. 2015; 18(4) (72):58-61.
21. Dabbs D. J. Diagnostic immunohistochemistry. London: Churchill Livingstone; 2006.
22. Семиглазов В. Ф., Семиглазов В. В., Дашян Г., Бессонова А., Палтуев Р., Пеньков К., Манихас А., Васильев А. Опухолевые маркеры при раке молочной железы. Врач. 2011; 12:2-7.
REFERENCES:
1. Shaykina A.S., Ryzhavsky B.Ya., Bekov S.V., Burobin I.N., Kudyanov E.G. Immunohistochemical analysis of estrogen and progesterone receptors, Ki-67 into healthy breast normal, in patients with brest cancer and benign tumor. Far Eastern Medical Journal. 2011; 1:34-37. (In Russ).
2. Jamaica D. Cass, Sonal Varma, Andrew G. Day, Waheed Sangrar, Ashish B. Rajput, Leda H. Raptis, Jeremy Squire, Yolanda Madarnas, Sandip K. SenGupta, Bruce E. Elliott. Automated Quantitative Analysis of p53, Cyclin D1, Ki67 and pERK Expression in Brest Carcinoma Does Not Differ from Expert Pathologist Scoring and Correlates with Clinico-Pathological Characteristics. Cancers. 2012; 4:725-742. D01:10.3390/cancers4030725
3. Dubinina V. G., Zavoloka A.V., Shpak I.V. The experience of the improvement of prevention and early diagnosis of breast diseases amongst the women population of Odessa. Odessa Medical Journal. 2013; 2:72-76. (In Russ).
4. Dubinina V.G., Chetverikov S.G., Zavoloka O.V., Lukyanchuk O.V., Morozyuk O.N. Benign brest tumors diagnostic algorithm optimization. Surgery Ukraine. 2013; 4:88-91. (In Russ).
5. Tagieva T.T. Risk factors of brest lesion development. Bulletin of RNTS named after N.N. Blokhin RAMS. 2007; 3:68-72. (In Russ).
6. Zavoloka A. V. Benigne brest tumors diagnosis: recent advances. Journal of health Sciences. 2013; 3(10):665-674.
7. Mayansky A.N., Mayansky N.A., Zaslavsky M. Nuclear factor-KappaB and inflammation. Cytokines and Inflammation. 2007; 6(2):3-9. (In Russ).
8. Ancrile B., Lim K. H., Counter C. M. Oncogenic Ras-induced secretion of IL6 is required for tumorigenesis. Genes Dev. 2007; 21:1714-1719. DOI:10.1101/gad.154940
9. Mantovani A., Allavena P., Sica A., Balkwill F. Cancer-related inflammation. Nature. 2008; 454:436444. DOI:10.1038/nature07205
10. DeNardo D. G., Johansson M., Coussens L. M. Immune cells as mediators of solid tumor metastasis. Cancer Metastasis Rev. 2008; 27:11-18. DOI:10.1007/ s10555-007-9100-0
11. Greten F. R., Karin M. NF-kB: Linking Inflammation and Immunity to Cancer Development and Progression. Nature Reviews Immunology. 2005; 5:749-759. DOI:10.1038/nri1703
12. Grivennikov S., Karin M. Dangerous liasons: STAT 3 and NF-kB collaboration and crosstalk in cancer. Cytokine Growth Factor Rev. 2010; 21 (1):11-19. DOI:10.1016/j.cytogfr.2009.11.005
13. Grivennikov S. I., Karin M. Inflammation and oncogenesis: a vicious connection. Curr. Opin. Genet. Dev. 2010; 20(1):65. DOI:10.1016/j.gde.2009.11.004
14. Karin M. Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. Nature. 2006; 441:431 — 436. D01:10.1038/nature04870
15. Yu H., Kortylewski H. Yu. M., Pardoll D. Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT 3 in the tumor microenvironment. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7:41-51. D0I:10.1038/nri1995
16. Litvinova S.V., Kovalenko E.P., Fomochkina I.I., Kubyshkin A.V. The comparative efficiency of the proteinase-inhibitor activity and cytokines for determination of inflammation's expression under endometrial hiperplasia. Tavrichesky mediko-biologichesky vestnik. 2012; 15(3):153-157. (In Russ).
17. Bourboulia D., Stetler-Stevenson W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): Positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin Cancer Biol. 2010; 20(3):161-168. D0I:10.1016/j.semcancer. 2010.05.002
18. Drake C. G., Jaffee E., Pardoll D. M. Mechanisms of immune evasion by tumors. Adv. Immunol. 2006; 90:51-81. D0I:10.1016/S0065-2776(06)90002-9
19. Noemi Eiro, Francisco J. Vizoso Inflammation and cancer. World J. Gastrointest Surg. 2012; 4(3):62-72. D0I:10.4240/wjgs.v4.i3.62
20. Usmanova T.E., Filatov A.S., Ilchenko F.N.. Filonenko T.G., Boyko T.A. Complex morphological and immunohistochemical investigation of benign breast tumors with the assesment of the inflammatory reaction in her tissue. Tavrichesky mediko-biologichesky vestnik. 2015; 18(4)(72):58-61. (In Russ).
21. Dabbs D. J. Diagnostic immunohistochemistry. London: Churchill Livingstone; 2006.
22. Semiglazov V.F., Semiglazov V.V., Dashyan G., Bessonova A., Paltoev R., Penkov K., Manihas A., Vasiliev A. Tumor markers for breast cancer. Doctor. 2011; 12:2-7. (In Russ).
