CC BY
18DOI: 10.12731/2658-6649-2021-13-2-185-201 УДК 581.1:581.19
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ARABIDOPSIS THALIANA С ПОНИЖЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА NDB2
И.В. Федосеева, А.И. Катышев, А.В. Федяева, А.В. Степанов, Г.Б. Боровский
Обоснование. Альтернативный путь дыхания митохондрий растений не связан с синтезом АТФ и, следовательно, не контролируется непосредственно энергетическим статусом клетки. Альтернативный дыхательный путь включает в себя ротенон нечувствительные NAD(Р)Н дегидрогеназы II типа, расположенные как на внешней, так и на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий, убихинон и альтернативную оксидазу (AOX). Предполагается, что альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы имеют функции, сходные с функциями AOX, среди которых термогенез, предотвращение образования АФК, окисление избытка восстановителей для продолжения метаболических путей и др. Публикаций об успешном подавлении экспрессии NDB2 пока недостаточно. Например, показано, что растения арабидопсиса, лишенные и AOXla и NDB2 были более чувствительны к комбинированной засухе и повышенному освещению, в то время как растения, гиперэкспрессирующие эти гены, демонстрировали повышенную устойчивость и способность к постстрессовому восстановлению.
Цель. Целью данной работы являлось изучить, как подавление экспрессии NDB2 в гетеротрофных клетках суспензионной культуры арабидопсиса повлияет на экспрессию других генов альтернативного пути дыхания, разобщающих белков, а также генов белков теплового шока в не стрессовых условиях.
Материалы и методы. Для выделения РНК отбирали по 5 мл клеток суспензионных культур. РНК выделяли с помощью реактивов из набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Литва), согласно инструкции производителя.
Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов Thermo Scientific (Литва), согласно рекомендациям фирмы производителя.
ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFXManager (Bio-Rad, Германия).
Все эксперименты проводились в двух аналитических и трех биологических повторностях. В качестве референсного гена использовали ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу - GAPD.
Результаты. Количество мРНК гена NDB2 в клетках суспензионной культуры линии AS5 было снижено в 8,2раза по сравнению с контролем Col-0. Подавление экспрессии гена NDB2 в клетках суспензионной культуры арабидопсиса линии AS5 приводило к увеличению количества транскриптов не только гена NDB4, но и NDB1, а также NDA2 и NDC1; в то же время экспрессия генов NDB3 и NDA1 снижалась по сравнению с клетками Col-0. Мы не обнаружили изменения уровней экспрессии генов AOXla, AOXlb и AOXld в клетках линии AS5 по сравнению с контролем, однако количество транскриптов гена AOXlc несколько увеличивалось. При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих разобщающие белки, было обнаружено увеличение экспрессии гена UCP1 в клетках линии AS5. В клетках суспензионной культуры линии AS5 повышались уровни экспрессии всех исследуемых нами генов БТШ, кроме HSP17.7.
Заключение. Таким образом, полученные результаты предполагают, что подавление экспрессии гена NDB2 в гетеротрофных клетках арабидопсиса в отсутствие стресса изменяет редокс-статус клетки, что, в свою очередь, приводит к изменениям уровней накопления транскриптов других генов NAD(P)H дегидрогеназ и увеличению экспрессии генов БТШ, при этом экспрессия ключевых генов AOX не изменяется.
Ключевые слова: Arabidopsis thaliana (экотип Columbia); NAD(P)H деги-дрогеназы II типа; экспрессия генов
Для цитирования. Федосеева И.В., Катышев А.И., Федяева А.В., Степанов А.В., Боровский Г.Б. Анализ экспрессии генов в клетках суспензионной культуры Arabidopsis thaliana с пониженной экспрессией гена NDB2 // Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture. 2021. Т. 13, № 2. C. 185-201. DOI: 10.12731/2658-6649-2021-13-2-185-201
ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN ARABIDOPSIS THALIANA SUSPENSION CULTURE CELLS WITH REDUCED NDB2 GENE EXPRESSION
I. V. Fedoseeva, A.I. Katyshev, A. V Fedyaeva, A.V. Stepanov, G.B. Borovskii
Background. The alternative respiratory pathway of plant mitochondria is not linked to ATP synthesis and, therefore, is not directly controlled by the energy status of the cell. This alternative pathway includes rotenone insensitive NAD(P)H type
II dehydrogenases located on both the outer and inner surfaces of the inner mito-chondrial membrane, ubiquinone, and alternative oxidase (AOX). It is supposed that alternative NAD(P)H dehydrogenases have functions similar to those of AOX, including thermogenesis, prevention of ROS formation, oxidation of overage reducing agents for the metabolic pathways maintenance, etc. Publications on the successful NDB2 suppression expression are still insufficient. For example, Arabidopsis plants lacking both AOX1a and NDB2 were shown to be more sensitive to combined drought and high light treatment, while plants overexpressing these genes showed increased tolerance and ability to post-stress recovery.
Purpose. The aim of this work was to study how the suppression of NDB2 expression in the heterotrophic cells of Arabidopsis suspension culture will affect the expression of other alternative respiratory pathway genes, uncoupling proteins, as well as genes of heat shock proteins under non-stress conditions.
Materials and methods. For RNA isolation, 5 ml of suspension culture cells were collected. RNA was isolated using reagents from the GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Lithuania) according to the manufacturer's instructions.
The first strand of cDNA was synthesized using the Thermo Scientific reagent kit (Lithuania), according to the manufacturer's recommendations. RT-PCR was carried out on the CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, the USA), using a qPCR mix-HS SYBR reagent kit (Evrogen, Russia) according to the manufacturer's instructions. The analysis of RT-PCR data was performed using the SFX Manager software (Bio-Rad, USA). All experiments were carried out in two analytical and three biological replicates. A gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPD, was used as a reference gene.
Results. The amount of NDB2 mRNA in the AS5 suspension culture cells was reduced by 8.2 times compared to the control, Col-0. Suppression of the NDB2 expression in AS5 Arabidopsis suspension culture cells resulted in an increase of transcripts amount not only NDB4 gene, but also NDB1, as well as NDA2 andNDC1; at the same time, the NDB3 and NDA1 expression genes decreased in comparison with Col-0 cells. We did not find any changes in the AOX1a, AOX1b, and AOX1d expression levels genes in AS5 cells compared to the control, but the quantity of AOX1c gene transcripts increased slightly. During analyzing the expression levels of the genes encoding the uncoupling proteins, UCP1 gene expression was increased in AS5 cells. In the cells of the AS5 line suspension culture, the expression levels of all the HSPs genes studied by us, except for HSP17.7, increased.
Conclusion. Therefore, the results obtained suggest that the suppression of NDB2 gene expression in Arabidopsis heterotrophic cells in the absence of stress alters redox status of cells, which in turn leads to changes in the level of accumulation of
other NAD(P)H dehydrogenases genes transcripts and the increase of HSPs gene expression, while the key AOX genes expression does not change.
Keywords: Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia); type IINAD(P)Hdehydrogenases; genes expression
For citation. Fedoseeva I.V., Katyshev A.I., Fedyaeva A.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B. Analysis of gene expression in Arabidopsis thaliana suspension culture cells with reduced NDB2 gene expression. Siberian Journal of Life Sciences and Agriculture, 2021, vol. 13, no. 2, pp. 185-201. DOI: 10.12731/2658-6649-2021-13-2-185-201
Введение
Альтернативный путь дыхания митохондрий растений не связан с синтезом АТФ и, следовательно, не контролируется непосредственно энергетическим статусом клетки [14]. В классической электрон-транспортной цепи окисление митохондриального NADH происходит через ротенон чувствительный комплекс I и цитохром с оксидазу, одновременно генерируя протонный градиент и приводя к синтезу АТФ через АТФ синтазу. Альтернативный дыхательный путь включает в себя ротенон нечувствительные NAD^^ дегидрогеназы II типа, расположенные как на внешней, так и на внутренней поверхности внутренней мембраны митохондрий, убихи-нон и альтернативную оксидазу (AOX) [12, 16, 23]. Альтернативный путь присутствует во всех исследованных на сегодняшний день высших растениях. У многих растений экспрессия компонентов альтернативного пути увеличивается при воздействии химических или экологических стрессов [5, 16, 17, 23]. В арабидопсисе (Arabidopsis thaliana) найдены семь генов NAD(P)H дегидрогеназ II типа (ND II) [13] (NDB1-4, NDA1-2 и NDC1) и пять генов AOX (AOX1a-dиAOX2) [15]. NDB 1-4 локализованы на внешней поверхности внутренней митохондриальной мембраны, в то время как NDA 1 и 2, а также NDC1 были определены как внутренние (обращены к митохондриальному матриксу) [10].
Разобщающие белки (UCPs) образуют подсемейство в семействе ми-тохондриальных белков-носителей и катализируют жирнокислотную рециркуляцию протонов, тем самым модулируя степень связи между мито-хондриальным переносом электронов и синтезом АТФ [20]. UCP действуют только в присутствии АФК, по-видимому, контролируя и модулируя окислительно-восстановительный статус цепи переноса электронов [7, 9, 20].
Предполагается, что альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы имеют функции, сходные с функциями AOX, среди которых термогенез, предотвращение образования АФК, окисление избытка восстановителей для
поддержания работы метаболических путей и др. [16]. Продукция мито-хондриальных АФК увеличивается под воздействием внешних стимулов и может активировать запуск либо защитных механизмов (например, белков теплового шока, БТШ), либо приводить к гибели [4]. Поскольку альтернативные NAD(P)H дегидрогеназы растений содержат в качестве кофактора ФАД, исследователи не исключают, что они могут быть потенциальными сайтами генерации АФК у растений [3]. Показано, что делеция гена NDB4, кодирующего внешнюю NADH дегидрогеназу A. thaliana, приводила к снижению уровня генерации АФК [21]. Другие авторы [24, 25] показали, что снижение количества белков NDA1 и NDA2 в результате подавления экспрессии соответствующих генов приводило к замедлению роста и повышению уровня лактата. Снижение количества белка NDB1 нарушало рост растений, но никак не влияло на дыхательную активность. В то же время, недостаток NDB1 значительно влиял на экспрессию генов, участвующих в белковом синтезе, а также в функционировании сигнальных систем растений [25]. Растения нокаут-мутантов арабидопсиса по гену NDC1, кодирующего фермент, участвующий в синтезе витамина К в хло-ропластах, были очень чувствительны к свету [11]. В растениях арабидопсиса, у которых с помощью РНК интерференции был уменьшен синтез NDB4, значительно увеличивался синтез NDB2 и AOX1a, что привело к уменьшению образования АФК клетками, увеличению солеустойчивости, а также некоторым изменениям в скорости развития и фенотипе растений [21]. Публикаций об успешном подавлении экспрессии NDB2 пока недостаточно. В одной из работ показано, что растения арабидопсиса, лишенные и AOXla и NDB2 были более чувствительны к комбинированной засухе и повышенному освещению, в то время как растения, гиперэкс-прессирующие эти гены, демонстрировали повышенную устойчивость и способность к постстрессовому восстановлению [22]. Поэтому целью данной работы являлось изучить, как подавление экспрессии NDB2 в гетеротрофных клетках суспензионной культуры арабидопсиса повлияет на экспрессию других генов альтернативного пути дыхания, разобщающих белков, а также генов белков теплового шока в не стрессовых условиях.
Материалы и методы
Для получения растений со сниженной экспрессией гена NDB2 ара-бидопсиса A. thaliana (экотип Columbia, Col-0) кДНК, соответствующая транслируемой последовательности мРНК этого гена клонировали в антисмысловой ориентации в составе плазмиды pBI121 под контролем 35S
промотора [2] в клетках Agrobacterium tumefaciens, штамм C58c1. Агро-бактериальную трансформацию растений арабидопсиса генетической конструкцией проводили методом окунания цветков [6]. Полученные трансгенные растения отбирали с помощью селекции на канамицине (50 мкг/мл), наличие встройки целевого гена подтверждали с помощью ПЦР.
Суспензионные культуры клеток Col-0 и линии со сниженной экспрессией гена NDB2 получали и культивировали, как описано ранее [19].
Для выделения РНК отбирали по 5 мл клеток суспензионных культур. РНК выделяли с помощью реактивов из набора GeneJET Plant RNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific, Литва), согласно инструкции производителя.
Синтез первой цепи кДНК осуществляли с использованием набора реактивов Thermo Scientific (Литва), согласно рекомендациям фирмы производителя.
ПЦР-РВ проводили на приборе CFX96™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США), используя набор реактивов qPCR mix-HS SYBR (Евроген, Россия), согласно инструкции производителя. Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программного обеспечения SFX Manager (Bio-Rad, США). Все эксперименты проводились в двух аналитических и трех биологических повторностях. В качестве референсного гена использовали ген, кодирующий глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу -GAPD [8].
Последовательности использованных в работе олигонуклеотидов приведены в Таблице.
Таблица
Олигонуклеотиды, использованные в экспериментах по определению уровней экспрессии генов Л ¡¡шИипи с помощью ПЦР в реальном времени
Наименование олигонуклеотида Последовательность, 5'->3'
17.6A-RTL CTTGACTTTGTGTGTGTGTGTCTCTGA
17.6A-RTR CCAAATACACACATTTCTCCACCATA
17.6B-RTL TTTATCATCGGAGTTGCTTGTGTTT
17.6B-RTR CATCATAATTCATAGCTCAATCGGAGA
17.6C-RTL GGTAGTGAAATAATTGGTGTGTGATGTGT
17.6C-RTR CAAACAATCCGAGAGGCAGAAGTAT
17.6II-RTL GTTTTGTGATTGTGTGTTGGATTTATCT
17.6II-RTR CATCTTAGAACAAAACACCATATCCCT
17.7-RTL TTCTCTGTTCATATTTGTCTTTGTGTTCA
17.7-RTR GCATGGATGGTTCAAGAGAGCAA
Окончание табл.
Hsp101-RTL TCTCCTCCACCTGATGATATTCCA
Hsp101-RTR CTTGAGCACGACGAATGACCTTA
GAPD RTL GGCGAGAGTTTGTGTGTGGTTGA
GAPD RTR AAGCAGGGAAACATTAAGAGAAAGCAA
Ndb2 RTL CTCCAAGGCTCCAATACACATATCTCTC
Ndb2 RTR ATCTCTCCTCGTTACTTGTGGTCATTATTT
Ndb3 RTL TCAGGAACACTGACAATGAAAGAATTT
Ndb3 RTR GTTCGACAGACTTGTTGGAACCATT
Ndb4 RTL AAGACAGGTTCAATGGTTGTGGGA
Ndb4 RTR GCCAGTTTCTCTTTCCTTTGTGGAT
Aox1a RTL CGGCTGGACCACGTTTGTTCT
Aox1a RTR CCAATCGTCGGAGCTCTAGTCCATA
Aox1b RTL AATGATGATGAGTCGTCGCTATGGA
Aox1b RTR CCGCTAGATCCTTTCTCCTCCGTA
Aox1c RTL CACTACATTACTCCGTCGCTCTCTCCT
Aox1c RTR TTTCGCTGGAGCAAGTTGGTGA, 22-mer
Aox1d RTL GACATCTCATTAGCCACTTGCCCA
Aox1d RTR TTCCCACTTACCGGAGATGACGT
Ndb1 RTL TGCCTGCAACTGCTCAGGTC
Ndb1 RTR GATGCCCGCCAGTTCTGAAG
Nda1 RTL ATCCTACACTCTCTCGTCCCGTTTCT
Nda1 RTR CTCCAACGCATTAACTACATCCTCCTT
Nda2 RTL CACACACACAACGAAGAAGACGAAGA
Nda2 RTR CGAGAAGCGAGAGTGTATGATAATGATGA
Ndc1 RTL CCGTTCTCTCCTCTGTATCTTCTCTCA
Ndc1 RTR GCCACTGTTGTTTGTCACTGCTCT
Ucp1 RTL GCAGAGAGAGAGAGAGAGGGACGAT
Ucp1 RTR GGGACGACGACGATTACGGCTA
Ucp2 RTL CATCAATCATCATCGCTGTTAGAGAGAA
Ucp2 RTR GCGAAATCTGGAGAAGCACCGA
Ucp3 RTL GAGCCGAGTGACCAGAGAAGCA
Ucp3 RTR GGAAACGTAACTGACTCTGCAACCAT
Результаты исследований и их обсуждение
Количество мРНК гена NDB2 в клетках суспензионной культуры линии AS5 было снижено в 8,2 раза по сравнению с контролем, Col-0 (рисунок, А).
Показано, что митохондрии, выделенные из зелёных листьев арабидопсиса линии Atndb2 со сниженной экспрессией гена NDB2, резко снижали скорость окисления экзогенного NADH [22]. Авторы предположили, что небольшое количество окислительной активности NADH, оставшееся в растениях Atndb2, вероятно, связано с другими внешними NADH деги-
дрогеназами, скорее всего, с NDB4. В наших экспериментах подавление экспрессии гена NDB2 в клетках суспензионной культуры арабидопсиса линии AS5 приводило к увеличению количества транскриптов не только гена NDB4, но и NDB1, а также NDA2 и NDC1 ; в то же время экспрессия генов NDB3 и NDA1 снижалась по сравнению с клетками Col-0 (рисунок, Б).
Мы не обнаружили изменения уровней экспрессии генов AOXla, AOXlb и AOXld в клетках линии AS5 по сравнению с контролем, однако количество транскриптов гена AOXlc несколько увеличивалось (рисунок, В). При анализе уровней экспрессии генов, кодирующих разобщающие белки, было обнаружено увеличение экспрессии гена UCP1 в клетках линии AS5 (рисунок, В). Разобщающие белки действуют только в присутствии АФК, вероятно, при этом контролируя и модулируя окислительно-восстановительный статус цепи переноса электронов [20].
А
Б
Рис. Сравнительный анализ количества мРНК различных генов в контрольных (Col-0) и трансгенных (AS5) клетках суспензионных культур арабидопсиса. n=3, m±S.E
Продукция АФК рассматривается как вероятный триггер синтеза БТШ, а митохондрии могут быть её основным источником [1]. В клетках суспензионной культуры линии AS5 повышались уровни экспрессии всех исследуемых нами генов БТШ, кроме HSP17.7 (рисунок, Г).
Таким образом, полученные результаты предполагают, что подавление экспрессии гена NDB2 в гетеротрофных клетках арабидопсиса в отсутствие стресса изменяет редокс-статус клетки, что, в свою очередь, приводит к изменениям уровней накопления транскриптов других генов НАДН-дегидрогеназ и увеличению экспрессии генов БТШ, при этом экспрессия ключевых генов AOX не изменяется.
Информация о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Conflict of interests information. We have no conflict of interest to declare.
Благодарности. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Биоаналитика» и коллекций ЦКП «Биоресурсный центр» СИФИБР СО РАН.
Acknowledgments. This research was done using the equipment of The Core Facilities Center "Bioanalitika" and the collections of The Core Facilities Center "Bioresource Center" at the Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS (Irkutsk, Russia).
Список литературы
1. Рихванов Е.Г., Федосеева И.В., Пятрикас Д.В., Степанов А.В., Боровский Г.Б., Войников В.К. Механизм функционирования кальциевой сигнальной системы у растений при действии теплового стресса. Роль митохондрий в этом процессе // Физиология растений. 2014. Т. 61, N° 2. С. 155-169. https:// doi.org/10.1134/S1021443714020125
2. Шишлова-Соколовская А.М., Урбанович О.Ю., Федосеева И.В., Боровский Г.Б. Трансформация Nicotiana tabacum конструкцией, несущей ген NDB2 из Arabidopsis thaliana в антисмысловой ориентации // Молекулярная и прикладная генетика. 2017. Т. 22. С. 76-83.
3. Amirsadeghi S., Robson C.A., Vanlerberghe G.C. The role of the mitochondrion in plant responses to biotic stress // Physiologia Plantarum, 2007, vol. 129, no. 1, pp. 253-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2006.00775.x
4. Brand M.D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling // Free Radic. Biol. Med., 2016, vol. 100, pp. 14-31. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.04.001
5. Clifton R., Millar A.H., Whelan J. Alternative oxidases in Arabidopsis: a comparative analysis of differential expression in the gene family provides new insights into function of non-phosphorylating bypasses // Biochimica et Bio-physica Acta (BBA): Bioenergetics, 2006, vol. 1757, no. 7, pp. 730-741. https:// doi.org/10.1016/j.bbabio.2006.03.009
6. Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-me-diated transformation of Arabidopsis thaliana // Plant J., 1998, vol. 16, no. 6, pp. 735-743. https://doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x
7. Considine M.J., Goodman M., Echtay K.S., Laloi M., Whelan J., Brand M.D., Sweetlove L.J. Superoxide stimulates a proton leak in potato mitochondria that is related to the activity of uncoupling protein // J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, no. 25, pp. 22298-22302. https://doi.org/10.1074/jbc.M301075200
8. Czechowski T., Stitt M., Altmann T., Udvardi M.K., Scheible W.R. Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis // Plant Physiology, 2005, vol. 139, no. 1, pp. 5-17. https://doi.org/10.1104/pp.105.063743
9. Echtay K.S., Roussel D., St-Pierre J., Jekabsons M.B., Cadenas S., Stuart J.A., Harper J.A., Roebuck S.J., Morrison A., Pickering S., Clapham J.C., Brand M.D. Superoxide activates mitochondrial uncoupling proteins // Nature, 2002, vol. 415, pp. 96-99. https://doi.org/10.1038/415096a
10. Elhafez D., Murcha M.W., Clifton R., Soole K.L., Day D.A., Whelan J. Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in Arabi-dopsis: intraorganelle location and expression // Plant Cell Physiology, 2006, vol. 47, no. 1, pp. 43-54. https://doi.org/10.1093/pcp/pci221
11. Fatihi A., Latimer S., Schmollinger S., Block A., Dussault P.H., Vermaas W.F.J., Merchant S.S., Basset G.J. A dedicated type II NADPH dehydrogenase performs the penultimate step in the biosynthesis of vitamin K1 in Synechocystis and Arabidopsis // Plant Cell, 2015, vol. 27, no. 6, pp. 1730-1741. https://doi. org/10.1105/tpc.15.00103
12. Finnegan P.M., Soole K.L., Umbach A.L. Alternative mitochondrial electron transport proteins in higher plants / Eds.: Day D.A., Millar H., Whelan J. // Plant mitochondria: from genome to function. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 2004, pp. 163-230.
13. Michalecka A.M., Svensson A.S., Johansson F.I., Agius S.C., Johanson U., Brennicke A., Binder S., Rasmusson A.G. Arabidopsis genes encoding mito-chondrial type II NAD(P)H dehydrogenases have different evolutionary origin and show distinct responses to light // Plant Physiol., 2003, vol. 133, no. 2, pp. 642-652. https://doi.org/10.1104/pp.103.024208
14. Millar A.H., Whelan J., Soole K.L., Day D.A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants / Eds.: Merchant S.S., Briggs W.R., Ort D. // Annual Review of Plant Biology, 2011, vol. 62, pp. 79-104. https://doi.org/10.1146/ annurev-arplant-042110-103857
15. Polidoros A.N., Mylona P. V., Arnholdt-Schmitt B. Aox gene structure, transcript variation and expression in plants // Physiol. Plant., 2009, vol. 137, no. 4, pp. 342-353. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2009.01284.x
16. Rasmusson A.G., Soole K.L., Elthon T.E. Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria // Annu. Rev. Plant Biol., 2004, vol. 55, pp. 23-39. https:// doi.org/10.1146/annurev.arplant.55.031903.141720
17. Rasmusson A.G., Moller I.M. Mitochondrial electron transport and plant stress // Plant Mitochondria; Ed.: Kempken F. NY: Springer, New York, 2011, pp. 357-381.
18. Reczek C.R., Chandel N.S. ROS-dependent signal transduction // Curr. Opin. Cell Biol., 2015, vol. 33, pp. 8-13. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2014.09.010
19. Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V., Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nuclear-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture // Plant J., 2007, vol. 52, no. 4, pp. 763-778. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03275.x
20. Smith A.M., Ratcliffe R.G., Sweetlove L.J. Activation and function of mitochondrial uncoupling protein in plants // J. Biol. Chem., 2004, vol. 279, no. 50, pp. 51944-51952. https://doi.org/10.1074/jbc.M408920200
21. Smith C., Barthet M., Melino V., Smith P., Day D., Soole K. Alterations in the mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenase NDB4 lead to changes in mitochondrial electron transport chain composition, plant growth and response to oxidative stress // Plant Cell Physiol., 2011, vol. 52, no. 7, pp. 1222-1237. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr073
22. Sweetman C., Waterman C.D., Rainbird B.M., Smith P.M.C., Jenkins C.D., Day D.A., Soole K.L. AtNDB2 is the main external NADH dehydrogenase in mitochondria and is important for tolerance to environmental stress // Plant Physiology, 2019, vol. 181, no. 2, pp. 774-788. https://doi.org/10.1104/pp.19.00877
23. Vanlerberghe G.C. Alternative oxidase: a mitochondrial respiratory pathway to maintain metabolic and signaling homeostasis during abiotic and biotic stress in plants // Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 4, pp. 6805-6847. https://doi. org/10.3390/ijms14046805
24. Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araüjo W.L., Aidemark M., Fernan-dez-Fernandez M., Fernie A.R, Ribas-Carbo M., Rasmusson A.G. Suppression of
the external mitochondrial NADPH dehydrogenase, NDB1, in Arabidopsis thaliana affects central metabolism and vegetative growth // Mol. Plant., 2014a, vol. 7, no. 2, pp. 356-368. https://doi.org/10.1093/mp/sst115
25. Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araùjo W.L., Escobar M.A., Geisler D.A., Aidemark M., Lager I., Fernie A.R., Ribas-Carbo M., Rasmusson A.G. Suppression of NDA-type alternative mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis thaliana modifies growth and metabolism, but not high light stimulation of mitochondrial electron transport // Plant Cell Physiol., 2014, vol. 55, no. 5, pp. 881-896. https://doi.org/10.1093/pcp/pcu021
References
1. Rikhvanov E.G., Fedoseeva I.V., Pyatrikas D.V., Stepanov A.V., Borovskiy G.B., Voynikov V.K. Fiziologiya rasteniy, 2014, vol. 61, no. 2, pp. 155-169. https://doi.org/10.1134/S1021443714020125
2. Shishlova-Sokolovskaya A.M., Urbanovich O.Yu., Fedoseeva I.V., Bo-rovskiy G.B. Molekulyarnaya iprikladnayagenetika, 2017, vol. 22, pp. 76-83.
3. Amirsadeghi S., Robson C.A., Vanlerberghe G.C. The role of the mitochondrion in plant responses to biotic stress. Physiologia Plantarum, 2007, vol. 129, no. 1, pp. 253-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2006.00775.x
4. Brand M.D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic. Biol. Med., 2016, vol. 100, pp. 14-31. https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed.2016.04.001
5. Clifton R., Millar A.H., Whelan J. ¿Alternative oxidases in ¿Arabidopsis: a comparative analysis of differential expression in the gene family provides new insights into function of non-phosphorylating bypasses. Biochimica et Biophys-ica Acta (BBA): Bioenergetics, 2006, vol. 1757, no. 7, pp. 730-741. https://doi. org/10.1016/j.bbabio.2006.03.009
6. Clough S.J., Bent A.F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-medi-ated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J., 1998, vol. 16, no. 6, pp. 735-743. https://doi.org/10.1046/j.1365-313x.1998.00343.x
7. Considine M.J., Goodman M., Echtay K.S., Laloi M., Whelan J., Brand M.D., Sweetlove L.J. Superoxide stimulates a proton leak in potato mitochondria that is related to the activity of uncoupling protein. J. Biol. Chem., 2003, vol. 278, no. 25, pp. 22298-22302. https://doi.org/10.1074/jbc.M301075200
8. Czechowski T., Stitt M., Altmann T., Udvardi M.K., Scheible W.R. Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiology, 2005, vol. 139, no. 1, pp. 5-17. https://doi.org/10.1104/pp.105.063743
9. Echtay K.S., Roussel D., St-Pierre J., Jekabsons M.B., Cadenas S., Stuart J.A., Harper J.A., Roebuck S.J., Morrison A., Pickering S., Clapham J.C., Brand M.D. Superoxide activates mitochondrial uncoupling proteins. Nature, 2002, vol. 415, pp. 96-99. https://doi.org/10.1038/415096a
10. Elhafez D., Murcha M.W., Clifton R., Soole K.L., Day D.A., Whelan J. Characterization of mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis: intraorganelle location and expression. Plant Cell Physiology, 2006, vol. 47, no. 1, pp. 43-54. https://doi.org/10.1093/pcp/pci221
11. Fatihi A., Latimer S., Schmollinger S., Block A., Dussault P.H., Vermaas W.F.J., Merchant S.S., Basset G.J. A dedicated type II NADPH dehydrogenase performs the penultimate step in the biosynthesis of vitamin K1 in Synechocystis and Arabidopsis. Plant Cell, 2015, vol. 27, no. 6, pp. 1730-1741. https://doi. org/10.1105/tpc.15.00103
12. Finnegan P.M., Soole K.L., Umbach A.L. Alternative mitochondrial electron transport proteins in higher plants / Eds.: Day D.A., Millar H., Whelan J. Plant mitochondria: from genome to function. Kluwer Academic Publishers: Dordrecht, The Netherlands, 2004, pp. 163-230.
13. Michalecka A.M., Svensson A.S., Johansson F.I., Agius S.C., Johanson U., Brennicke A., Binder S., Rasmusson A.G. Arabidopsis genes encoding mitochondrial type II NAD(P)H dehydrogenases have different evolutionary origin and show distinct responses to light. Plant Physiol., 2003, vol. 133, no. 2, pp. 642-652. https://doi.org/10.1104/pp.103.024208
14. Millar A.H., Whelan J., Soole K.L., Day D.A. Organization and regulation of mitochondrial respiration in plants / Eds.: Merchant S.S., Briggs W.R., Ort D. Annual Review of Plant Biology, 2011, vol. 62, pp. 79-104. https://doi.org/10.1146/ annurev-arplant-042110-103857
15. Polidoros A.N., Mylona P. V., Arnholdt-Schmitt B. Aox gene structure, transcript variation and expression in plants. Physiol. Plant., 2009, vol. 137, no. 4, pp. 342-353. https://doi.org/10.1111/j.1399-3054.2009.01284.x
16. Rasmusson A.G., Soole K.L., Elthon T.E. Alternative NAD(P)H dehydrogenases of plant mitochondria. Annu. Rev. Plant Biol., 2004, vol. 55, pp. 23-39. https:// doi.org/10.1146/annurev.arplant.55.031903.141720
17. Rasmusson A.G., Moller I.M. Mitochondrial electron transport and plant stress. Plant Mitochondria; Ed.: Kempken F. NY: Springer, New York, 2011, pp. 357-381.
18. Reczek C.R., Chandel N.S. ROS-dependent signal transduction. Curr. Opin. Cell Biol., 2015, vol. 33, pp. 8-13. https://doi.org/10.1016/j.ceb.2014.09.010
19. Rikhvanov E.G., Gamburg K.Z., Varakina N.N., Rusaleva T.M., Fedoseeva I.V., Tauson E.L., Stupnikova I.V., Stepanov A.V, Borovskii G.B., Voinikov V.K. Nucle-
ar-mitochondrial cross-talk during heat shock in Arabidopsis cell culture. Plant J., 2007, vol. 52, no. 4, pp. 763-778. https://doi.org/10.1111/j.1365-313X.2007.03275.x
20. Smith A.M., Ratcliffe R.G., Sweetlove L.J. Activation and function of mitochondrial uncoupling protein in plants. J. Biol. Chem., 2004, vol. 279, no. 50, pp. 51944-51952. https://doi.org/10.1074/jbc.M408920200
21. Smith C., Barthet M., Melino V., Smith P., Day D., Soole K. Alterations in the mitochondrial alternative NAD(P)H dehydrogenase NDB4 lead to changes in mitochondrial electron transport chain composition, plant growth and response to oxidative stress. Plant Cell Physiol., 2011, vol. 52, no. 7, pp. 1222-1237. https://doi.org/10.1093/pcp/pcr073
22. Sweetman C., Waterman C.D., Rainbird B.M., Smith P.M.C., Jenkins C.D., Day D.A., Soole K.L. AtNDB2 is the main external NADH dehydrogenase in mitochondria and is important for tolerance to environmental stress. Plant Physiology, 2019, vol. 181, no. 2, pp. 774-788. https://doi.org/10.1104/pp.19.00877
23. Vanlerberghe G.C. Alternative oxidase: a mitochondrial respiratory pathway to maintain metabolic and signaling homeostasis during abiotic and biotic stress in plants. Int. J. Mol. Sci., 2013, vol. 14, no. 4, pp. 6805-6847. https://doi. org/10.3390/ijms14046805
24. Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araùjo W.L., Aidemark M., Fernan-dez-Fernandez M., Fernie A.R, Ribas-Carbo M., Rasmusson A.G. Suppression of the external mitochondrial NADPH dehydrogenase, NDB1, in Arabidopsis thaliana affects central metabolism and vegetative growth.Mol. Plant., 2014a, vol. 7, no. 2, pp. 356-368. https://doi.org/10.1093/mp/sst115
25. Wallström S.V., Florez-Sarasa I., Araùjo W.L., Escobar M.A., Geisler D.A., Aidemark M., Lager I., Fernie A.R., Ribas-Carbo M., Rasmusson A.G. Suppression of NDA-type alternative mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases in Arabidopsis thaliana modifies growth and metabolism, but not high light stimulation of mitochondrial electron transport. Plant Cell Physiol., 2014, vol. 55, no. 5, pp. 881-896. https://doi.org/10.1093/pcp/pcu021
ВКЛАД АВТОРОВ
Федосеева И.В.: выделение РНК и синтез кДНК; планирование и проведение экспериментов методом ПЦР-РВ, написание рукописи.
Катышев А.И.: агробактериальная трансформация растений араби-допсиса; подбор последовательностей олигонуклеотидов; обсуждение и анализ полученных результатов.
Федяева А.В.: селекция трансгенных растений, сбор и размножение семенного материала.
Степанов А.В.: получение и культивирование клеток суспензионных культур.
Боровский Г.Б.: планирование экспериментов, обсуждение и анализ полученных результатов.
AUTHOR CONTRIBUTIONS
Irina V. Fedoseeva: RNA isolation and cDNA synthesis; designed and performed the experiments by the RT-PCR method and wrote the manuscript.
Alexander I. Katyshev: agrobacterial transformation of Arabidopsis plants; selection of oligonucleotide sequences; discussed and analysis of the results obtained.
Anna V. Fedyaeva: selection of transgenic plants, collection and propagation of seed material.
Alexey V. Stepanov: preparation and cultivation of suspension culture cells; Gennadii B. Borovskii: planning of experiments, discussed and analysis of the results obtained.
ДАННЫЕ ОБ АВТОРАХ Федосеева Ирина Владимировна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук (СИФИБР СО РАН) ул. Лермонтова, 132, г. Иркутск, 664033, Российская Федерация [email protected]
Катышев Александр Игоревич, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики
Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук
ул. Лермонтова, 132, г. Иркутск, 664033, Российская Федерация [email protected]
Федяева Анна Валерьевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории физиологической генетики
Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук
ул. Лермонтова, 132, г. Иркутск, 664033, Российская Федерация [email protected]
Степанов Алексей Владимирович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории физиологической генетики
Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук
ул. Лермонтова, 132, г. Иркутск, 664033, Российская Федерация [email protected]
Боровский Геннадий Борисович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории физиологической генетики
Федеральное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук
ул. Лермонтова, 132, г. Иркутск, 664033, Российская Федерация borovskii@sifibr. irk.ru
DATA ABOUT THE AUTHORS Irina V. Fedoseeva, Ph.D., Senior Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 132, Lermontov Str., Irkutsk, 664033, Russian Federation [email protected] ORCID: 0000-0001-6529-9304 ResearcherID: J-4468-2018 Scopus Author ID: 22956847000
Alexander I. Katyshev, Ph.D., Senior Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov Str., Irkutsk, 664033, Russian Federation
SPIN-code: 7140-4427
ORCID: 0000-0001-7856-0460
ResearcherID: F-8419-2016
Scopus Author ID: 13408667600
Anna V. Fedyaeva, Ph.D., Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS 132, Lermontov Str., Irkutsk, 664033, Russian Federation [email protected] SPIN-code: 5521-2563 ResearcherlD: J-3262-2018 Scopus Author ID: 56025492900
Alexey V. Stepanov, Ph.D., Senior Researcher of the Laboratory of Physiological Genetics
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov Str., Irkutsk, 664033, Russian Federation
SPIN-code: 3572-8670
ORCID: 0000-0002-0456-3690
ResearcherID: J-4355-2018
Scopus Author ID: 57213473032
Gennadii B. Borovskii, Dr. Sci. (Biology), Principal Research Scientist of the Laboratory of Physiological Genetics
Siberian Institute of Plant Physiology and Biochemistry SB RAS
132, Lermontov Str., Irkutsk, 664033, Russian Federation
borovskii@sifibr. irk.ru
SPIN-code: 7462-7535
ORCID: 0000-0002-5089-5311
ResearcherID: A-5147-2016
Scopus Author ID: 7003990731
