CC BY
45
СТАРЕНИЕ И ДОЛГОЛЕТИЕ, БОЛЕЗНИ ЗРЕЛОГО ВОЗРАСТА
О.Е. Цапонина,
A.Г. Лада, А.А. Рубель,
B.В. Наволоцкая, И.Т. Петрова,
C.Г. Инге-Вечтомов,
А.П. Галкин
Биологический НИИ Санкт-Петербургского государственного университета, отдел генетики, лаборатория генетики животных; Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, Санкт-Петербург
Ар-пептид является основным компонентом амилоидных бляшек, вызывающих нейротокси-ческий эффект при болезни Альцгеймера. Мы сконструировали дрожжевой штамм, содержащий плазмиду с гибридным геном Аf.-SUP35MC на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35. Полученные данные свидетельствуют о том, что гибридный белок Ар-Бир35МС является дрожжевым прионом.
^ Ключевые слова: болезнь Альцгеймера; пептид Ар; SUP35; дрожжи; тест-система; нонсенс-супрессия; прионы; терминация трансляции.
АНАЛИЗ ЭФФЕКТОВ ПРОДУКЦИИ ГИБРИДНОГО БЕЛКА Ap-Sup35MC В ДРОЖЖАХ SACCHArOmYCES CEREVISIAE
ВВЕДЕНИЕ
В связи с увеличением средней продолжительности жизни человека, исследования болезней зрелого возраста стали одним из приоритетных направлений современной биомедицины. Целый ряд возрастных нейродегенеративных заболеваний связан с формированием в тканях головного мозга высокомолекулярных белковых тяжей. Наибольший практический интерес представляет болезнь Альцгеймера (одна из широко распространенных форм старческого маразма). У людей среднего возраста это заболевание встречается достаточно редко, однако после 85 лет болезнь Альцгеймера настигает каждого третьего [20]. По оценкам специалистов в настоящее время в мире насчитывается более 12 миллионов людей, страдающих этим неизлечимым недугом [5] и с увеличением средней продолжительности жизни их число будет возрастать. По прогнозам нобелевского лауреата Стенли Прусинера к 2050-му году только в США число больных этой формой старческого маразма составит 20 миллионов [20]. Наряду со спонтанными формами заболевания описаны мутации, вызывающие наследственную предрасположенность к возникновению болезни Альцгеймера у относительно молодых людей. Есть основания полагать, что развитию этого нейродегенеративного заболевания может способствовать ушиб головного мозга [17].
Болезнь Альцгеймера связана с накоплением в тканях центральной нервной системы так называемых амилоидных бляшек, основным компонентом которых является амилоидный ^-пептид (далее V Ар -пептид состоит из 40 или 42-х аминокислот и представляет собой продукт одного из двух путей протеолиза белка APP (Amyloid Precusor Protein) [29]. Некоторые авторы связывают формирование амилоидных бляшек с увеличением количества мономеров А„-пеп-тида, которое наблюдается при нарушения процессинга APP [4, 23, 24]. В олигомерной изоформе А„-пептид представлен в виде р-слоев и вызывает нейротоксический эффект [19].
Поиск факторов, контролирующих агрегацию Ар, проводится в экспериментах на млекопитающих, в культуре клеток или в системе in
vitro. Совершенно очевидно, что эти подходы не позволяют осуществлять масштабный скрининг агентов, блокирующих формирование амилоидных тяжей. Сравнительно недавно было показано, что Ар-пептид человека способен образовывать агрегаты в дрожжевой клетке [12]. Дрожжи являются удобным модельным объектом для анализа факторов, контролирующих процесс амилоидогенеза. К сожалению, агрегация Ар в дрожжах не имеет фенотипического проявления, а проводить масштабный скрининг агентов, блокирующих амилоидоге-нез, опираясь лишь на биохимические критерии, практически невозможно.
Мы разрабатываем тест-систему, в которой агрегация Ар-пептида человека должна иметь фенотипическое проявление по критерию «рост—отсутствие роста дрожжей на селективной среде». С этой целью мы модифицировали хорошо известную систему для анализа прионоподобной агрегации дрожжевого белка Sup35, играющего роль вспомогательного фактора терминации трансляции [30]. Белок Sup35 имеет 3 домена — N, M и C [25]. Домен С выполняет функцию фактора терминации трансляции. Он может работать и в отсутствие доменов N и M [25, 11]. Домен М, по всей вероятности, является своеобразным шарниром и обеспечивает независимую укладку N и C доменов. Кроме того, с последовательностью домена М связывается дрожжевой шаперон Hsp104 [14], контролирующий воспроизведение прионной изоформы Sup35p [7]. Домен N отвечает за прионоподобную агрегацию Sup35p [25]. В прионной олигомерной изоформе [PSI+ ] белок Sup35 частично инактивирован, что приводит к повышению вероятности считывания стоп-кодонов и, как следствие, проявлению нонсенс-суп-рессорного фенотипа.
Для анализа эффектов конформационных переключений пептида Ар мы решили сконструировать дрожжевой штамм, содержащий плазмиду с гибридным геном Ар-SUP35MC на фоне делеции хромосомной копии SUP35. Данный штамм должен быть маркирован нонсенс мутацией ade1-14, что позволит оценивать уровень точности терминации трансляции в соответствии с ростом штамма на среде без аденина. Согласно нашей гипотезе олигомеризация гибридного фактора терминации трансляции Ар-Sup35MC за счет агрегации последовательностей Ар должна вызывать супрессию нонсенс-мутации ade1-14(UGA). В этом случае данный стоп-кодон с определенной частотой будет прочитываться как значащий, что приведет к синтезу полноразмерного белка Ade1 и росту штамма в среде без аденина. Таким образом, агрегация Ар-пептида может иметь фенотипическое
проявление в гетерологичной системе. Предложенный подход позволит исследовать механизм агрегации Ар-пептида, а также может быть использован для массового скрининга белков, пептидов и других агентов, регулирующих и блокирующих агрегацию амилоидного пептида.
В этой статье представлены результаты первого этапа работы по генетическому анализу фенотипических эффектов продукции гибридного белка Ар-Sup35MC в дрожжевой клетке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовались стандартные генетические методы трансформации дрожжей с использованием ацетата лития и ДНК-носителя [21] и трансформации бактерий [15]. Реакции рестрикции и лигирования осуществляли с помощью ферментов компаний «Promega» и «Fermentas» согласно протоколу производителей.
Среды и условия культивирования
Для культивирования E. coli использовали жидкую и твердую среду LB и жидкую среду SOB [15]. Дрожжи культивировали при 30 °С на стандартных твердых и жидких средах [2, 1, 22]. Использовали полную среду YAPD, а также селективные среды на основе MD, в которые добавляли витамины, микроэлементы и необходимые аминокислоты в стандартных концентрациях. Для экспрессии гибридного гена Ар-SUP35MC, находящегося под контролем индуцибильного промотора CUP1, в среды добавляли CuSO4 в концентрации от 3-х до 300 цМ. Для элиминации прионных детерминант использовали твердую среду YAPD с добавлением 5мМ хлорида гуанидина (GuHCl).
Штаммы
Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм E. coli HB101 [15]. В работе использованы автодиплоидные штаммы Saccharomyces cerevisiae GT109, GT111 и GT113, полученные нами ранее [8]. Генотипы штаммов представлены в табл. 1. Последовательность гена Sup35 в одном из гомологов хромосомы 4 заменена последовательностью гена HIS3. Штаммы гомозиготны по нонсенс-мутации ade1-14(UGA) и маркированы рядом других мутаций. Штаммы GT109 и GT111 содержат фактор [PIN+ ], в отличие от штамма GT113, который имеет статус [pin-]. Фактор [PIN+] представляет собой при-онную изоформу белка Rnq1. Прионоподобные аг-
регаты Rnq1 способствуют индукции фактора [РБ1+ ] при сверхпродукции белкаSup35 [10].
Для получения гаплоидных штаммов Asup35::HIS3 [PCUP1-Аp-SUP35MC(URA3)] авто-диплоидные изогенные штаммы GT109, GT111 и GT113 были трансформированы плазмидой [РсиР1-Ав-БиР35МС(иЯА3)] (см. далее). Трансформантов отбирали на синтетической селективной среде без урацила. Полученные штаммы были обозначены GT109-1, GT111-1 и GT113-1 соответственно. С помощью случайной выборки аскос-пор в мейотическом потомстве диплоидных трансформантов были получены гаплоидные сегреганты А^ир35::Н1Б3 [РсирГАв-БиР35МС(и№3)]. Эти гаплоидные штаммы были названы 1-GT109-1, 1-GT111-1 и 1-GT113-1 соответственно. Жизнеспособность гаплоидных штаммов, несущих деле-цию хромосомной копии БиР35, обеспечивается за счет экспрессии гибридного гена А-БиР35МС.
Штамм GT111 был также трансформирован плазмидой [РсиР1-БиР35МС(иЯА3)] (см. далее). Из полученных трансформантов ^^11-2) с помощью случайной выборки аскоспор был получен гаплоидный штамм 1-GT111-2 (Азир35::Н1Б3 [РсиР1-БиР35МС(ЦЯА3)]). Генотипы полученных штаммов представлены в табл.1.
Плазмиды
Плазмида pKT218,620 [18] содержит мутантную последовательность НБР104 под контролем индуцибельного промотора ОАТ1, бактериальный и дрожжевой районы инициации репликации, ген
устойчивости к ампициллину — AmpR и ген LEU2. Экспрессия мутантной последовательности имеет доминантный эффект и приводит к инактивации АТФ-й активности всего клеточного пула Hsp104p. Плазмида любезно предоставлена Ю. Черновым (Inst. of Technology, Atlanta, Georgia, USA).
Однокопийные центромерные плазмиды — [Psup35-SUP35MC( URA3)]
[P SUp35-SUP35MC(LEU2)] — сконструированные на базе векторов pRS316 и pRS315 соответственно, содержат последовательность SUP35MC под контролем конститутивного промотора гена SUP35 (PSUP35), бактериальный и дрожжевой районы инициации репликации, ген устойчивости к ампициллину — AmpR, гены URA3 (LEU2) и полилинкер. Плазмиды любезно предоставлены Ю. Черновым.
Плазмиды
[PCUP1-SUP35MC(URA3)]
и [PCUP1-Ap-SUP35MC(URA3)] были сконструированы в данной работе. Промотор SUP35 в плазмиде [PSUP35-SUP35MC(URA3)] фланкирован сайтами рестрикции Xho1 и BamH1. Мы заместили этот фрагмент на последовательность, кодирующую промотор CUP1 (в дальнейшем PCUP1), фланкированную такими же сайтами рестрикции. Плазмида [PcUp/-SUP35MC(URA3)] содержит последовательность P cupi-SUP35MC, бактериальный и дрожжевой районы инициации репликации, ген устойчивости к ампициллину — AmpR, ген URA3 и полилинкер.
Таблица 1
Генотипы штаммов, использованных в работе
Штамм Генотип Источник
GT109 MATa/MATa ade1-14(UGA)/ade1-14(UGA) Ahis3/Ahis3 leu2-3, 122/leu2-3, 112 lys2/lys2 ura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 SUP35/Asup35::HIS3 [PSI+] [PIN+] (СИегпоГГ Ы а1., 2000)
GT111 [psf] [PIN+] дериват GT109 (СИегпоГГ е! а1., 2000)
GT113 [psf] [pin] дериват GT109 (СИегпоГГ е! а1., 2000)
GT109-1 GT109 [PcuP1-Ae-SUP35MC(URA3)] Получен в данной работе
GT111-1 GT111 [PcUP1-Ae-SUP35MC(URA3)] Получен в данной работе
GT113-1 GT113 [PcUP1-Ae-SUP35MC(URA3)] Получен в данной работе
GT111-2 GT111 [Pcup1-SUP35MC(URA3)] Получен в данной работе
1-GT109-1 MATa ade1-14(UGA) Ahis3 leu2-3 lys2 ura3-52 trp1-289 Д sup35::HIS3 [Pcupj-A^-SUP35MC(URA3)] [PIN+] (гаплоидный сегрегант GT109) Получен в данной работе
1-GT111-1 MATa ade1-14(UGA) Ahis3 leu2-3 lys2 ura3-52 trp1-289A sup35::HIS3 [Pcupj-A^-SUP35MC(URA3)] [PIN+] (гаплоидный сегрегант GT111) Получен в данной работе
1-GT113-1 MATa ade1-14(UGA) Ahis3 leu2-3 lys2 ura3-52 trp1-289 Д sup35::HIS3 [PcUP1-Ap-SUP35MC(URA3)] [pin-] (гаплоидный сегрегант GT113) Получен в данной работе
1-GT111-2 MATa ade1-14(UGA) Ahis3 leu2-3 lys2 ura3-52 trp1-289 Д sup35::HIS3 [Pcup1-SUP35MC(URA3)] [PIN+] (гаплоидный сегрегант GT111-2) Получен в данной работе
Последовательность, кодирующая Ар-пептид человека, была получена из тотальной РНК мозга абортуса при помощи метода RT-PCR (обратной полимеразной цепной реакции). Синтез кДНК проводился с помощью набора реактивов и согласно протоколу фирмы «Fermentas». Праймеры содержат регуляторные последовательности, сайты рестрикции BamH1 и Sac1 и последовательности комплементарные 5’ и 3’ концам Ар, кодирующего 40 аминокислот.
• F-primer:
5’GGGTCCAC GGATCC TAT ATG TCT GATGCAGAATTCCGACAT 3’
• R-primer:
5’ GTTATAAA GGATCC
GACAACACCGCCCACCAT 3’
Амплифицированная последовательность была секвенирована и встроена в плазмиду [PCUP1-SUP35MC(URA3 )] по сайту BamHI распо-ложенномувслед за промотором CUP1. Центромерная плазмида [PCUP1-A e-SUP35MC( URA3) ] содержит последовательность A^-SUP35MC под контролем индуцибельного промотора CUP1, бактериальный и дрожжевой районы инициации репликации, ген устойчивости к ампициллину — AmpR и ген URA3.
Учет нонсенс-супрессии
Нонсенс-супрессия в гаплоидных штаммах Asup35 [PCUP1-Ae-SUP35MC(URA3)], несущих нонсенс-мутацию ade1-14, оценивали визуально по росту штамма на твердой среде без аденина. Уровень нонсенс-супрессии в данной системе зависит от уровня экспрессии гена PCUP1-A„-SUP35MC. Используемый нами промотор CuP1 дает возможность регулировать экспрессию A-SUP35MC при помощи изменения концентрации ионов меди в питательной среде. Штаммы выращивали на твердой синтетической среде, содержащей необходимые добавки, а также CuSO4 в концентрациях 3, 50, 100, 150, 200, 250 и 300цМ и затем перепечатывали на среду без аденина с такой же концентрацией CuSO4. Рост штаммов учитывали ежедневно в течение 14 дней.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Эффект экспрессии гибридного гена A-SUP35MC на фоне делеции хромосомной копии гена SUP35
Гаплоидные штаммы, содержащие гибридный ген PCUP1-A^-SUP35MC на фоне делеции хромо-
сомной копии БиР35, жизнеспособны на полной среде YAPD и синтетических средах. Жизнеспособность исследуемых штаммов свидетельствует о том, что гибридная последовательность Ав-БиРЗвМС компенсирует отсутствие интактно-го гена БиР35.
Изменяя концентрацию ионов меди в питательной среде, мы провели анализ влияния уровня экспрессии гибридного гена А^-БиР35МС на супрессию нонсенс-мутации айв1-14(иОА). Результаты приведены в табл. 2.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при увеличении продукции химерного белка Ар-БирЭбМС закономерно повышается эффективность терминации трансляции (см. табл. 2). Все три штамма (1^Т109-1, 1^Т111-1 и 1^Т11Э-1), содержащие химерный ген, имеют одинаковые характеристики роста на среде без аденина. Таким образом, [Р/А]-статус гаплоидных штаммов, а также наличие или отсутствие [РБ/+ ]-фактора в исходных диплоидных штаммах не влияют на эффективность работы гибридного фактора терминации трансляции Ар-БирЭБМСр.
В штаммах, несущих гибридный ген РС^Р1-А^-БиР35МС, даже при высоком уровне продукции Ар-БирЭБМСр (150цМ СиБ04) нонсенс-супрессия ингибируется не полностью — рост на среде без аденина наблюдается на 5-й, 6-й день. В контроле у штамма 1-ОТ111-2, содержащего плазмиду с конструкцией РсиР1-БиР35МС, нонсенс-супрессия не отмечается при добавлении 100 цМ СиБ04 (см. табл. 2). Очевидно, при одинаковом уровне продукции БирЭ5МСр обеспечивает более высокую эффективность терминации трансляции, чем гибридный белок Ар-8ирЭ5МС.
Увеличение продукции Ар-8ирЭ5МС (250 и Э00 цМ СиБ04) вызывает почти полное подавление нонсенс-супрессии (см. табл. 2). При этом выявляются лишь отдельные редкие колонии, демонстрирующие активный рост на среде без аденина. Такие колонии были отобраны, рассеяны истощающим штрихом на полной среде и отдельные клоны были отпечатаны на среду без аденина с добавлением 150цМ СиБ04. В потомстве некоторых колоний все полученные клоны демонстрировали рост на этой селективной среде на вторые сутки инкубации (рис. 1). Этот признак стабильно наследовался в ряду клеточных поколений.
Таким образом, были отобраны штаммы, характеризующиеся высоким уровнем нонсенс-супрессии. Один из таких гаплоидных штаммов (п1-1-ОТ111-1) был выбран нами для дальнейшей работы. Во всех экспериментах, описанных далее, во все среды добавляли 150 цМ СиБ04 для обес-
Таблица 2
Рост штаммов на среде без аденина с различной концентрацией CuSO4
Штамм Концентрация Си804 в среде, цМ Начало роста на среде без аденина, дни
3 2
50 4
1-GT109-1, 1-GT111-1 100 4
и 1-GT113-1* 150 6
(Asup35 [PCUPI-Ae-SUP35MC(URA3')]) 200 7
250 10
300 14
3 6
50 10
1-GT111-2 100 _**
150 —
(Asup35 [PcuP1-SUP35MC(URA3)]) 200
250 —
300 -
Примечание: * — для всех трех штаммов отмечены одинаковые характеристики роста на среде без аденина; ** — символ « — » обозначает, что за 14 дней наблюдений рост на селективной среде отмечен не был.
Рис. 1. Рост штамма 1-ОТ111-1 на среде без аденина, содержащей 150 тМ СиБ04 (третий день учета на селективной среде):
А — клоны, полученные из одной колонии, в которой произошла индукция нонсенс-супрессии; Б — клоны исходного штамма 1-ОТ111-1.
Рис. 2. Рост на среде без аденина, содержащей 150 тМ СиБ04(третий день учета на селективной среде):
А — штамм П.1-1-ОТ111-1 характеризуется высоким уровнем нонсенс-супрессии; Б — штамм 1-ОТ111-2; В — в штамме 1-ОТ111-2 плазмида [РСиР1-БиР35МС(ЬБи2)] замещена на плазмиду [РСиР1 -Ав~БиР35МС( ЦЯА3)], выделенную из штамма П.1-1-ОТ111-1.
печения стабильного уровня продукции белка Ар^ир35МС.
2. Анализ факторов, индуцирующих нонсенс-супрессию на фоне продукции гибридного белка А-Бир35МС
Индукция нонсенс-супрессии в штамме п1-1^Т111-1 может объясняться следующими факторами:
1) нонсенс-супрессия вызвана мутацией в плазмиде, содержащей гибридный ген Ав~БиР35МС;
2) снижение точности терминации трансляции является следствием мутации в геноме штамма п1-1^Т111-1;
3) нонсенс-супрессия связана с прионизацией и, как следствие, частичной инактивацией гибридного белка Ар^ир35МС.
Для проверки первой гипотезы плазмида РсиР>1-А^-БиР35МС(иЙА3) была выделена из клеток штамма п1-1^Т111-1 и использована для трансформации штамма 1^Т111-2, который имеет идентичный генотип, но содержит плазмиду РСиР1-БиР35МС(ЬБи2). На следующем этапе плазмида с маркерным геном ЬБи2 была утрачена, и дрожжи содержали лишь плазмиду РСиР1-Ав-БиР35МС(11ЯА3). Если штамм п1-1^Т111-1 растет на среде без аденина уже на вторые сутки, то штамм, полученный в результате данного эксперимента и содержащий ту же самую плазмиду, начинает расти лишь на 5—6 день (рис. 2). На основании представленных данных можно заключить, что нонсенс-супрессия, характерная для штамма п1-1^Т111-1, не связана с возникновением каких-либо мутаций в последовательности плазмиды, кодирующей гибридный белок Ар^ир35МС.
Для анализа возможного влияния мутаций или цитоплазматических детерминант, которые могли возникнуть или имелись в исследуемом штамме, на индукцию нонсенс-супрессорного фенотипа был проведен эксперимент, схема которого представлена на рис. 3.
Штамм п1-1^Т111-1 был трансформирован центромерной плазмидой РБиР35-БиР35МС(ЬБи2). Из четырех индивидуальных трансформантов было отобрано по восемь клонов, потерявших плазмиду РсиР1-БиР35МС(иЯА3). Анализ роста на среде без аденина показал, что экспрессия последовательности БиР35МС приводит к элиминации нонсенс-супрессии (рис. 4б). Если бы нонсенс-супрессия в штамме п1-1-ОТ111-1 была вызвана мутацией в генах, контролирующих точность терминации трансляции (например, в гене БиР45), то описанная замена плазмид не повлияла бы на характер роста штамма на среде без аденина. Эти данные дают основание полагать, что
1 2 3
п1-1-ОТ111-1
Рис. 3. Схема последовательной замены плазмид в штамме п1-1-ОТ111-1:
1 — штамм п1-1-ОТ111-1 содержит плазмиду [РСРР1-Ар-5РР3-МС(РЖА3)]; 2 — исходная плазмида заменена на [Р5рр3--8РР3-МС(1ЕР2')]; 3 — после замены плазмид штамм вновь содержит плазмиду [РСиР1-Ар-5РР3-МС(РМ3)].
нонсенс-супрессорный фенотип не связан с возникновением супрессорных мутаций в геноме исследуемого штамма. Тем не менее остается вероятность того, что мутация или неизвестный при-онный детерминант, влияющие на точность терминации трансляции, проявляются лишь на фоне продукции гибридного белка Ар-8ирЭ5МС. Для проверки такой возможности мы вновь заместили плазмиды:
Ршр---БРР3-МС(1ЕР2) -► РаРП-А--8иР35МОЦЩ (см. рис. 3).
Следует отметить, что в этом эксперименте штамм трансформировали ДНК плазмиды РСРР1-Ав-БРР3-МС(РкА3), выделенной из бактерий, которую использовали ранее для получения штамма 1^Т111-1. На следующем этапе плазмида РзиР3--БРР3-МС(ЬЕР2) была утрачена, и трансформанты были отпечатаны на среду без аденина. Штамм, полученный в результате эксперимента с заменами плазмид, генетически идентичен исходному штамму п1-1^Т111-1 и характеризуется таким же высоким уровнем нонсенс-супрессии (рис. 4в).
На основании полученных данных можно заключить, что в штамме п1-1^Т111-1 имеется некий фактор, вызывающий нонсенс-супрессию при продукции белка Ар-БирЭ5МС.
Для проверки гипотезы о прионной природе данного фактора штамм п1-1^Т111-1 пассировали на среде с дрожжевым антиприонным агентом GuHCl. Известно, что использование GuHCl приводит к элиминации дрожжевых прионоподобных факторов [РБ1+ ], [РШ+] и [Р££3] [9, 26, 28]. После трех последовательных пересевов на среде YAPD с добавлением 5цМ GuHCl дрожжи клонировали истощающим штрихом на среде YAPD. Отдельные клоны были пересеяны на полную среду и затем от-
Рис. 4. Рост на среде без аденина, содержащей 1-0 цМ СиБ04 в эксперименте с последовательной заменой плазмид (третий день учета на селективной среде):
А — штамм п1 -1-ОТ111 -1 содержит плазмиду [РсррГА|Г5РР3-МС(РМЕ3)];
Б — замена плазмиды [РСРР1-А„-5РР3-МС(РМ3)] на плазмиду [Р5РР3--8РР3-МС(ЬЕР2)];
В —замена плазмиды [РШР3--8РР3-МС(ЬЕР2)] на плазмиду [РСРР1-Ав-8РР3-МС(Р№3)].
печатаны на среду без аденина. Пассирование на среде с GuHCl привело к элиминации нонсенс-супрессии у 97% из 128-ми проанализированных клонов (рис. 5).
В деривате штамма п1-1-ОТ111-1, утратившем нонсенс-супрессорный фенотип в результате пассирования на GuHCl, была проведена последовательная замена плазмид по схеме, приведенной на рис. 3. В этом случае после плазмидных замен нонсенес-супрессия не наблюдалась (результаты не представлены). Таким образом, использование GuHCl приводит к элиминации некоего дрожжевого детерминанта, который способен взаимодействовать с гибридным белком Лр-Бир35МСр.
На наш взгляд можно предложить лишь одно непротиворечивое объяснение полученных результатов — в штамме п1-1^Т111-1 произошла ин-
Рис. -. Рост штамма п1-1-0Т111-1 на среде —Айв + Рис. 6. Рост на среде —Айв + 1-0цМ СиБ04 (А) клонов
+ 1-0 цМ СиБ04 до (А) и после (Б) пассирования на среде штамма п1-1-0Т111-1 и (Б) клонов этого же штамма
с ОинС1 (третий день учета на селективной среде) после временной инактивацииШр104р (третий день уче-
та на селективной среде)
дукция неизвестного дрожжевого прионоподобно-го фактора, который сам по себе не вызывает нонсенс-супрессии (рис. 4б), однако его присутствие индуцирует прионизацию и, как следствие, частичную инактивацию Ар-8ирЭ5МСр. Это приводит к проявлению нонсенс-супрессорного фенотипа.
3. Влияние шаперона Н$р104 на проявление нонсенс-супрессии
Мы показали, что нонсенс-супрессия, характерная для штамма, несущего гибридный ген Ав-БРР3-МС, элиминируется под действием ан-типрионного агента GuHCl. Известно, что GuHCl инактивирует ГТФ-азную активность дрожжевого шаперона Hsp104, который играет ключевую роль в стабильной передаче прионных агрегатов в ряду клеточных поколений [6, 7, 16]. По всей вероятности в штаммах [РБ/+] №р104р «расщепляет» крупные агрегаты Sup35p на олигомеры, которые передаются при клеточных делениях и служат в качестве затравки для прионизации новых мономеров [13]. Делеция НБР104 или инактивация соответствующего белка приводят к формированию крупных прионных агрегатов, которые не могут передаваться из клетки в клетку [3]. Как уже было сказано, полученные нами данные свидетельствуют о том, что нонсенс-супрессия, наблюдаемая в нашей системе, определяется при-онизацией гибридного белка Аp-Sup35MC. Поскольку нонсенс-супрессия, характерная для штамма п1-1^Т111-1, элиминируется под воздействием GuHCl, то следует ожидать, что аналогичный эффект будет наблюдаться и в случае инактивации №р104р. Для проверки этой гипотезы штамм п1-1^Т111-1 был трансформирован плазмидой рКТ218,620, несущей маркерный ген ЬЕР2 и мутантный вариант гена НБР104 под контролем индуцибельного ОАЫ-промотора. Известно, что данная мутация имеет доминантный эффект и приводит к инактивации всего клеточ-
ного пула белка №р104 [27]. Трансформантов отбирали на синтетической среде без лейцина и отсевали на среду без лейцина с галактозой для активации экспрессии мутантного варианта гена НБР104. В качестве контроля тех же трансформантов отсевали на среду без лейцина с добавлением глюкозы. После трех последовательных пассажей на указанных средах трансформантов клонировали истощающим штрихом на полной среде YAPD, отбирали отдельные клоны и методом отпечатков переносили на среду без аденина. Всего был проанализирован 71 клон. Инактивация клеточного пула №р104р привела к потере нонсенс-супрессорного фенотипа у 64 клонов (90%), в то время как в контроле нонсенс-супрессорный фенотип стабильно наследуется (рис. 6). Таким образом, инактивация №р104р, как и воздействие GuHCl, приводит к элиминации нонсенс-супрессии, что подтверждает гипотезу о прионной конверсии гибридного белка Ap-Sup35MC.
ОБСУЖДЕНИЕ
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что гибридный белок Аp-Sup35MC выполняет функцию дрожжевого фактора терминации трансляции и обеспечивает жизнеспособность штаммов на фоне делеции БРР3-. Эффективность терминации трансляции закономерно повышается с увеличением уровня продукции Ap-Sup35MCp (см. табл. 2). Следует отметить, что исследуемый гибридный белок выполняет функцию фактора терминации трансляции менее эффективно, чем полноразмерный Sup35p или его делетированный вариант Sup35MC (см. табл. 2). По всей вероятности, активность гибридного белка в первую очередь зависит от его третичной структуры. Теоретически можно предположить, что последовательность Ap, замеща-
ющая N домен, взаимодействует с C доменом, что приводит к снижению активности гибридного белка. Кроме того, в результате нарушения третичной структуры может быть нарушено взаимодействие гибридного белка с функциональными партнерами Sup35p. Нельзя также исключить, что некоторые последовательности, замещающие N домен, подвергаются атаке дрожжевых протеаз, что дестабилизирует гибридный белок и приводит к снижению его активности.
Мы показали, что нонсенс-супрессия на фоне продукции гибридного белка Ap-SupЭ5MC не связана с супрессорными мутациям в геноме исследуемого штамма или мутациями в плазмиде Pсuрl-Ap-SUP35MC(РRA3). Пассирование штамма на среде с универсальным антиприонным агентом GuHCl приводит к элиминации нонсенс-супрессии. Полученные результаты свидетельствуют в пользу гипотезы, согласно которой индукция нонсенс-супрессии вызвана прионизацией и частичной инактивацией гибридного белка Ap-Sup35MC. Известно, что белок Sup35MC без ^домена не агрегирует даже при сверхпродукциии [25], следовательно прионизация Ap-SupЭ5MCp возможна лишь за счет конформационных переключений Ар-пептида, который играет роль прионизую-щего домена. Фактор, вызывающий нонсенс-супрессию в результате прионизации Ap-SupЭ5MCp, был назван нами [Ар+]. Штаммы, не содержащие данный фактор, или утратившие нонсенс-супрес-сорный фенотип после обработки ГГХ были обозначены как [Ар-]. Вместе с тем полученные результаты не укладываются в простую схему, согласно которой нонсенс-супрессия объясняется лишь появлением прионной изоформы Ap-Sup35MCp (фактора [Ар+]). Согласно общепринятым представлениям, прионный олигомер является своеобразной конформационной матрицей для присоединения и конверсии новых мономеров. В одном из экспериментов в штамме, содержащем фактор [Ар+], проводилась последовательная замена плазмид: РшрГА--БРР3-МС(Р№3) — Ри]р---БРР3-МС(1ЕР2) — — РСиР1-Ар-БРР3-МС(РЛА3).
Как можно видеть из этой схемы, на одном из этапов в исследуемом штамме гибридный ген Ав-БРР3-МС был замещен на последовательность БРР3-МС. Таким образом, матрица для прионной конверсии (белок Ap-Sup35MC) была утрачена. Это вполне объяснимо привело к исчезновению эффекта нонсенс-супрессии (см. рис. 4б).
Однако при последующей обратной замене РБиР3--БРР3-МС(ЬЕР2) — РСир1-А-БРР3-МС(Ш3) произошло восстановление нонсенс-супрессорного фенотипа (см. рис. 4в). Возникает вопрос: что спо-
собствует индукции нонсенс-супрессии de novo в отсутствие прионной изоформы белка Ap-Sup35MC?
Все наблюдаемые эффекты объясняются в рамках гипотезы, согласно которой прионизация и частичная инактивация гибридного белка Ap-Sup35MC происходит только на фоне индукции неизвестного дрожжевого прионоподобного фактора, названного нами [ABA+] (от Amyloid Beta Agregase). Мы полагаем, что в штамме nl-1-GTlll-l произошла спонтанная индукция фактора [ABA+], что вызвало прионоподобную агрегацию Аp-Sup35MCp и, как следствие, нон-сенс-супрессорный фенотип. Фактор [ABA+] элиминируется под действием GuHCl, что блокирует возможность повторной индукции [Ар+]. Возможно фактор [ABA + ] лишь инициирует агрегацию Ap-Sup35MCp, а затем гибридный фактор терми-нации трансляции поддерживается в изоформе [Ар+] самостоятельно. Также нельзя исключить, что Ap-Sup35MCp способен агрегировать лишь в присутствии олигомеров, соответствующих фактору [ABA+].
Надо отметить, что прион-прионные взаимодействия уже описаны в дрожжевой системе. Так, сверхпродукция полноразмерного белка Sup35 приводит к индукции фактора [PS/+] лишь при наличии в клетке прионной изоформы белка Rnql/ [P/N+] [10]. В дальнейшем фактор [PS/+] стабильно наследуется даже в случае делеции гена, кодирующего белок Rnql [10]. Таким образом, прионизация Rnql необходима только для индукции прионизации Sup35p. Возможно, в нашем случае имеет место аналогичное взаимодействие фактора [ABA+] и белка Ap-Sup35MC.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что Л^-пептид, не обладающий свойствами приона в организме млекопитающих, является прионфор-мирующим доменом в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Нонсенс-супрессия, наблюдаемая в нашей системе, элиминируется в результате инактивации Hspl04p. Исходя из этих результатов, можно предположить, что Hspl04p является кофактором, расщепляющим прионные агрегаты Ap-Sup35MCp на олигомерные «инфекционные зерна». Отсутствие инфекционных свойств Лр-пептида в организме млекопитающих может объясняться тем, что дрожжевой шаперон Hspl04 не имеет гомолога у высших эукариот. Однако следует учитывать, что на данном этапе исследования можно говорить лишь о прионных характеристиках полипептидной последовательности Лр в составе гибридного белка Ap-Sup35MCp, а не самого по себе Лв-пептида. Взаимодействие Hspl04p с Ap-Sup35MCp может определяться наличием до-
мена M Sup35p в составе гибридного белка. Как уже упоминалось, домен M, по всей вероятности, играет важную роль в связывании шаперона Hsp104 с прионной изоформой Sup35p [14]. С другой стороны можно допустить, что Hsp104p взаимодействует с прионом [ABA+], а инактивация этого шаперона приводит к потере фактора [ABA+], который необходим для поддержания прионной изоформы Ap-Sup35MCp.
На следующем этапе работы необходимо выявить наличие или отсутствие прионоподобных агрегатов Ap-Sup35MC в разработанной нами системе с помощью биохимических методов. Кроме того, планируется исследовать характер наследования нонсенс-супрессорного фенотипа в мейоти-ческих делениях и возможность передачи фактора [Ар+] путем цитодукции. В настоящий момент утверждение о прионизации гибридного белка Ap-Sup35MC следует рассматривать как наиболее вероятную гипотезу, имеющую экспериментальные подтверждения.
БЛАГОДАРНОСТИ
Авторы выражают особую благодарность профессору кафедры генетики и селекции СПбГУ А.Ф. Смирнову за помощь в организации и проведении работы и профессору Ю.О. Чернову (Georgia Inst. of Technology, Atlanta, USA) за предоставленные плазмиды и участие в обсуждении экспериментов. Мы благодарны К.В. Волкову за предложения по выбору стратегии контрольных экспериментов, а также А.С. Борхсениусу, С.П. Задорскому, Ю.В. Соповой и Л.Н. Мироновой за критическое обсуждение результатов. Работа поддержана грантами CRDF — Министерства Образования № ST-012 и РФФИ № 04-04-49002-a, Министерства Образования А04-2.12-649, Научные школы № НШ-2214.2003.4 и Министерства образования «Ведущие научные школы».
Литература
1. Захаров И.А., Кожин С.А., Кожина Т.Н., Федорова И.В. Сборник методик по генетике дрожжей-сахаромицетов. — Л.: Наука, 1984. — 143 с.
2. Инге-Вечтомов С.Г. Идентификация некоторых групп сцепления у Петергофских генетических линий дрожжей // Генетика. — 1971.— Т. 7. — C. 113-124.
3. Borchsenius A.S., Wegrzyn R.D., Newnam G.P., et al. Yeast prion protein derivative defective in aggregate shearing and production of new «seeds»// EMBO J. — 2001. — Vol. 20, N 23. — P 6683-6691.
4. Cai X.D., Golde T.E., Younkin S.G. Release of excess amyloid beta protein from a mutant amyloid beta protein precursor// Science. —
1993. — Vol. 259, N 5094. — P. 514-516.
5. Citron M. Alzheimer’s disease: treatments in discovery and development // Nat. Neurosci. — 2002. — Suppl. — P 1055-1057.
6. Chernoff Y.O., Derkatch I.L., Inge-Vechtomov S.G. Multicopy Sup35 gene induces de novo appearance of psi-like factors in yeast Saccharomyces cerevisiae // Curr. Genet. — 1993. — Vol. 24. — P 268-270.
7. Chernoff Y.O., Lindquist S.L., Ono B., Inge-Vechtomov S.G., Liebman S.W. Role of the chaperone HSP104 in prppagation of the yeast prion-like factor [PSI+] //Science. — 1995. — Vol. 268. — P. 880-884.
8. Chernoff Y.O., Galkin A.P., Lewitin E., Chernova T.A., Newnam G.P., Belenkiy S.M. Evolutionary conservation of prion-forming abilities of the yeast Sup35 protein //Mol. Microbiol. —
2000. — Vol. 35, N 4. — P 865-876.
9. Derkatch I.L., Bradley M.E., Zhou P., Chernoff Y.O., Liebman S.W. Genetic and environmental factors affecting the de novo appearance of the [PSI + ] prion in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. — 1997. — Vol. 147, N 2. — P 507-519.
10. DerkatchI..L., Bradley M.E., HongJ.Y., Liebman S.W. Prions affect the appearance of other prions: the story of [PIN+ ]// Cell. —
2001.— Vol. 106, N 2. — P 171-182.
11. Doel S.M., McCready S.J., Nierras C.R., Cox B.S. The dominant PNM2-mutation which eliminates the psi factor of Saccharomyces cerevisiae is the result of a missense mutation in the SUP35 gene // Genetics. — 1994. — Vol. 137, N 3. — P 659-670.
12. HughesS.R., GoyalS., Sun J.E., Gonzalez-DeWhittP., FortesM.A, Riedel N.G., Sahasrabudhe S.R. Two-hybrid system as a model to study the interaction of beta-amyloid peptide monomers // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 93, N 5. — P 2065-2070.
13. KryndushkinD.S., Smirnov V.N., Ter-AvanesyanM.D.,Kushnirov V.V. Increased expression of Hsp40 chaperones, transcriptional factors, and ribosomal protein Rpp0 can cure yeast prions // J. Biol. Chem. —
2002. — Vol. 277, N 26. — P 23702-23708.
14. Liu J.J., Sondheimer N., Lindquist S.L. Changes in the middle region of Sup35 profoundly alter the nature of epigenetic inheritance for the yeast prion [PSI+]// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2002. — Vol. 99. — P 16446-16453.
15. Maniatis T., FritschE.E., Sambrook J. Molecular cloning. A laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory. — 1982. — 479 p.
16. MoriyamaH., EdskesH.K., Wickner R.B. [URE3] prion propagation in Saccharomyces cerevisiae: requirement for chaperone Hsp104 and curing by overexpressed chaperone Ydj1p // Mol. Cell Biol. — 2000. — Vol. 20, N 23. — P 8916-22.
17. Olsson A., Csajbok L., Ost M., Hoglund K., Nylen K., Rosengren L., Nellgard B., Blennow K. Marked increase of beta-amyloid(1-42) and amyloid precursor protein in ventricular cerebrospinal fluid after severe traumatic brain injury // J. Neurol. — 2004. — Vol. 251, N 7. — P 870-876.
18. Parsell D.A., Sanchez Y., Stitzel J. D., Lindquist S. Hsp104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites//Nature. — 1991. — Vol. 353. — P 270-273.
19. Price D.L. and Sisodia S.S. Mutant genes in familial Alzheimer s disease and transgenic models //Ann. Rev. Neurosci. — 1998. — Vol. 21. — P 479-505.
20. Prusiner S.B. Shattuck lecture —neurodegenerative deseases and prions //
N. Eng. J. Med. — 2001. — Vol. 344, N 20. — P 1516-1526.
21. Rose M.D., Winstone F., Hieter P. Methods in yeast genetics. —
CSHL Press, 1990. — 198 p.
22. ShermanF., Fink G.R., Hinks J.B. Methods in Yeast Genetics // Cold Spring Harbor. — N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 1986.
23. Suzuki N., Cheung T.T., Cai X.D., Odaka A. et al. An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants // Science. —
1994. — Vol. 264. — P 1336-1340.
24. Tamaoka A., Odaka A., Ishibashi Y., Usami M. et al. APP717 missense mutation affects the ratio of amyloid beta protein species
(A beta 1-42/43 and a beta 1-40) in familial Alzheimer’s disease brain//J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269, N 52. — P. 32721 — 32724.
25. Ter-Avanesyan M.D., Dagkesamanskaya A.R., Kushnirov V.V., Smirnov V.N. The Sup3- omnipotent suppressor gene is involved in the maintenance of the non-Mendelian determinant [PS/+] in the yeast Saccharomyces cerevisiae // Genetics. — 1994. — Vol. 137. — P. 671-676.
26. Tuite M.F., Mundy C.R., Cox B.S. Agents that cause a high frequency of genetic change from [psi + ] to [psi-] in Saccharomyces cerevisiae // Genetics. — 1981. — Vol. 98, N 4. — P. 691-711.
27. Wegrzyn R.D., Bapat K., Newman G.P., Zink A.D., Chernoff Y.O. Mechanisn of prion loss after Hspl04 inactivation in yeast//Mol. Cell Biol. — 2001. — Vol. 21. — P. 4656-4669.
28. Wickner R.B. [URE3] as an altered URE2 protein: evidence for a prion analog in Saccharomyces cerevisiae//Science. — 1994. — Vol. 264, N 5158. — P. 566-569.
29. Wisniewski T., Ghiso J., Frangione B. Bilology of Ap amyloid in Alzheimer’s disease // Neurobiology of disease. — 1997. — Vol. 4. — P. 313-328.
30. Zhouravleva G., Frolova L., Le Goff X., Le Guellec R., /nge-Vechtomov S., Kisselev L., Philippe M. Termination of translation in eukaryotes is governed by two interacting polypeptide chain release factors, eRFl and eRF3 // EMBO J. — 1995. — Vol. 14. — P 4065-4072.
Analysis of effects of Ap-Sup35 hybrid protein production in yeast Saccharomyces cerevisiae
Tsaponina O.E., Lada A.G., Rubel A.A., Navolotskaya V.V., Petrova /.T., /nge-Vechtomov S.G., Galkin A.P.
'S? SUMMARY: Ap-peptide is the main component of amyloid plaque that leads to neurodegeneration in case of Alzheimer disease. We have constructed yeast strain containing a chimeric Ар-SUP36MC gene on the plasmid and deletion of the chromosomal copy of SUP35. Our data indicate that hybrid protein А|i-Sup35MC is a yeast prion.
'S? KEY WORDS: Alzheimer's disease; Ap-peptid; SUP35; yeast; test-system; nonsense-suppression; prion; translation termination.
