CC BY
138
хронизации и затяжного течения заболевания, распространения инфекции. При этом увеличение как базальной, так и ВСО-индуцированной секреции И-10 также является неблагоприятным прогностическим признаком, поскольку его избыток ведет к снижению противоинфекционной защиты, формированию туберкулиновой анергии, недостаточному подавлению туберкулезной инфекции и развитию хронического процесса [3].
Заключение. Полученные нами данные позволяют думать о том, что ведущую роль в формировании иммуносупрессии при инфильтративном туберкулезе легких играют Тге -клетки с фенотипом СБ4+СВ25+Рохр3+. При этом отмечается дисбаланс в количестве субпопуляций Тге с супрессорной активностью. При инфильтративном туберкулезе увеличивается количество С04+СВ25+Рохр3+-клеток с супрессорной активностью, причем данные изменения наиболее выражены у ту-беркулинотрицательных пациентов, что свидетельствует об их непосредственной роли в формировании туберкулиновой анергии.
При инфильтративном туберкулезе легких иммуносу-прессия, опосредованная цитокинопродукцией, связана с увеличением как базальной, так и ВСО-индуцированной секреции И-10, при этом происходит снижение уровня базаль-
ной и ВСО-индуцированной продукции TGFp мононуклеар-ными лейкоцитами in vitro.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев А. А., Быковская С. Н., Пашков Е. П., Быков А. С. // Вестн. РАМН. - 2006. - № 9-10. - С. 24-29.
2. Мишин В. Ю., Борисов С. Е., Аксенов В. А. // Пробл. туб. - 2005. - № 3. - С. 47-64.
3. Новицкий В. В., Синицына В. А., Воронкова О. В. и др. // Пробл. туб. - 2005. - № 6. - С. 39-42.
4. Beissert S., Schwarz A., Schwarz T. // J. Invest. Dermatol. - 2006. -Vol. 126. - P. 15-24.
5. Cassetti R., Martino A. // Cell Mol. Immunol. - 2008. - Vol. 5. - P. 161-170.
6. Jameson J., Havran W. // Immunol. Rev. - 2007. - Vol. 15. - P. 114122.
7. Kapp J., KappL., McKennaK. // Immunol. Res. - 2004. - Vol. 9. - P. 93-102.
8. Minz C, Steinman R., Fujii S. // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - P 203-207.
9. Wands J., Roark C, AydintungM. // J. Leukocyte Biol. - 2005. - Vol. 78. - P. 1086-1096.
Поступила 08.10.10
© КОЛЛЕКТИв АвТОРОв, 2012
УДК 612.118.221.2:612.6.02.017.1].083
м. А. Логинова12, Н. П. Трофимова1, И. в. Парамонов1
анализ частоты выявления неоднозначностей локусов при проведении HLA-типировлния по технологии SSO
Лаборатория Н^А-типирования ФГУ Приволжский окружной медицинский центр экспертизы качества препаратов крови и исследования фракционирования донорской плазмы Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития, 2вятский государственный университет , г. Киров
Проведено HLA-типирование 1829 человек по локусам HLA-A, HLA-В, HLA-DRB1 с использованием наборов реагентов LABType SSO (One Lambda, США). Определены показатели неоднозначности каждого локуса: 4,43% для локуса HLA-A, 4,43% для локуса HLA-В, 0,16% для локуса HLA-DRB1. Используя лист "редких" аллелей, проанализировали 13 типов выявленных неоднозначностей по локусу HLA-A, 27 типов - по локусу HLA-В и 3 типа - по локусу HLA-DRB1.
Ключевые слова: локусы, HLA-типирование
M.A. Loginova, N.P. Trofimova, I.V. Paramonov
THE ANALYSIS OF DETECTION RATE OF AMBIGUITY OF LOCI UNDER HLA-TYPING BY SSO TECHNOLOGY
The article deals with the results of HLA-typing of 1829 patients on loci HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 using kits of LABType SSO reagents (One Lambada, USA). The indicators of each locus ambiguity are determined: locus HLA-A - 4.43%%, locus HLA-B - 4.43%%, locus HLA-DRB1 - 0.16%%. The list of "rare" alleles was applied to analyze 13 types of determined ambiguities on locus HLA-A, 27 types on locus HLA-B, 3 types on locus HLA-DRB1.
Key words: locus, HLA-typing
За годы, прошедшие с момента открытия Жаном Доссе системы HLA (human leukocyte antigen), представления о ее биологической роли расширились [3, 11]. В настоящее время HLA-типирование проводят для решения следующих задач: подбор доноров для трансплантации органов и тканей [12, 14], определение предрасположенности к различным заболеваниям [11], биологическая идентификация (HLA-
Для корреспонденции:
Логинова Мария Александровна, канд. биол. наук, биолог лаб. HLA-типирования
Адрес: 610002, Киров, ул. Ленина, 104 Телефон: 8-8332-36-80-77 E-mail: [email protected]
генотип наследуется вместе с родительскими генами), диагностика случаев бесплодия [11] и др. Выбор технологии проведения HLA-типирования во многом зависит от поставленной задачи.
В настоящее время HLA-типирование проводят серологическими и молекулярно-генетическими методами. Последние более предпочтительны, так как позволяют выявлять и изучать непосредственно гены HLA. Молекулярно-генетические методы представлены тремя основными технологиями - SSP (sequence specific primers), SBT (sequence-based typing) и SSO (sequence specific oligonucleotides).
При проведении HLA-типирования по технологии SSP искомые HLA-участки ДНК "улавливаются" специфическими праймерами в процессе амплификации. Основными достоинствами технологии SSP являются возможность осуществлять
Таблица 1
Показатели неоднозначности локусов
№ п/п HLA-локус Число образцов с выявленными неоднозначностями Показатель неоднозначности, %
1 HLA-A 81 4,43
2 HLA-В 81 4,43
3 HLA-DRB1 3 0,16
Таблица 2
Типы неоднозначностей по локусу HLA-A
№ п/п Тип неоднозначности Число образцов с данным типом неоднозначности
1 A*01+A*11 или A*36:04+A*11 18
2 A*03+A*32 или A*74:13+A*32:04 18
3 A*01+A*26 или A*36:04+A*26:29 12
4 A*24+A*33 или A*31:08+A*33:19 7
5 A*02+A*66 или A*02:135+A*69:01 7
6 A*23+A*24 или A*24:13+A*24:71 6
7 A*30+A*31 или A*30+A*33:21 4
8 A*25+A*25 или A*25+A*26:33 2
9 A*26+A*29 или A*66:11+A*29:20 2
10 A*01+A*66 или A*36:04+A*69:01 2
11 A'03+A*23 или A*03:07+A*24:71 1
12 A*31+A*31 или A*31+A*33:21 1
13 A*26:23+A*68 или A*66+A*68 1
типирование как на низком, так и на экстравысоком уровне разрешения, определяя точечный аллельный полиморфизм (практически сравнимый с секвенированием), доступность и сравнительно низкая стоимость оборудование для электрофореза. Основным недостатком SSP является его низкая производительность. В настоящее время реагенты для проведения типирования по технологии SSP выпускают следующие производители: Protrans, OneLambda, Dynal и др.
Принцип технологии SSO-типирования основан на амплификации общей геномной ДНК образца с последующей гибридизацией (олигонуклеотидные зонды наносятся на стрипы или микросферы) и анализом. Данная технология отличается высоким уровнем автоматизации, высокой производительностью и относительно низкой трудоемкостью, что объясняет ее востребованность при создании банков пуповинной крови, регистров доноров стволовых клеток, работе крупных трансплантационных центров. Технология SSO на отечественном рынке представлена реагентами фирм oneLambda, Dynal, GenProbe.
HLA-типирование по технологии SBT - метод, позволяющий установить первичную последовательность ДНК и обладающий максимальной разрешающей способностью. Это единственный метод, позволяющий выявлять новые (ранее неописанные) и очень редкие аллели. Применение этого метода требует использования автоматизированных секвенаторов ДНК. На отечественном рынке технология SBT представлена наборами реагентов фирм Abbott, Applied Biosystems, Protrans и др. Технология SBT является самой дорогой на сегодняшний день и в связи с этим самой малораспространенной.
Однако следует указать еще один важный недостаток, общий для всех технологий, - выявление аллельных неоднозначностей ("двоякостей"), комбинаций нескольких возможных пар аллелей, которые не могут быть определены с помощью данного набора реагентов. Наличие неоднозначностей в генотипах снижает эффективность работы лаборатории HLA-типирования, деятельность которой направлена прежде всего на создание регистра потенциальных доноров гемопоэ-тических клеток (большое количество исследований за относительно короткий период), в связи с тем что внесение таких образцов в базу данных не представляется возможным [10].
Каждая технология, более того, каждый набор реагентов, применяемый на конкретной популяции, будет иметь свой показатель неоднозначности по каждому из HLA-локусов [4, 6, 13].
Проведение анализа типов неоднозначностей, выявляемых при HLA-типировании в конкретной популяции, в первую очередь необходимо для выбора лабораторией второго метода HLA-типирования, ориентированного на выявление конкретных типов неоднозначностей и позволяющего разрешать неоднозначности всех определяемых локусов. Кроме того, анализ типов выявляемых неоднозначностей будет полезен для поиска альтернативного метода скринингового генотипирования, дающего меньшие показатели неоднозначности локусов при приблизительно одинаковых стоимости и трудозатратах [4], а также для обмена опытом между лабораториями подобного профиля.
Целью данного исследования явился анализ частоты выявления и типов неоднозначностей по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1, выявляемых наборами реагентов LABTуре SSO у населения Приволжского федерального округа.
Материалы и методы. В ходе исследования проведено HLA-типирование 1829 человек, являющихся потенциальными донорами гемопоэтических стволовых клеток, проживающих на территории Приволжского федерального округа.
Препараты ДНК для проведения HLA-типирования были получены из замороженных образцов цельной крови (антикоагулянт ЭДТА) методом колоночной фильтрации с помощью станции QIAcube с использованием наборов QIAamp DMA Blood Mini Kit (QIAGEN) и станции BioRobot МШ с использованием наборов QIAamp DMA Blood BioRobot MDx Kit (QIAGEN). Концентрация препаратов ДНК, определенная спектрофотометрически, составляла в среднем 15-30 нг/мкл
при соотношении А0„„/А00„ 1,65-1,90.
А 260 280 ' '
HLA-типирование по локусам HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 (до второго знака) было осуществлено по технологии гибридизации с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на микросферах (SSO), на проточном флюориметре Luminex 200 (в модификации LABScan 200 с XY-платформой), интегрированной в рабочую станцию для автоматизации постамплификационных этапов муль-типараметрического флюоресцентного анализа LABX-press, с использованием наборов реагентов LABType SSO (OneLambda, США) с разрешением от среднего к высокому. Для обработки данных, полученных на проточном флюориметре Luminex 200, использовали программное обеспечение HLA Fusion v.1.2.
Показатель неоднозначности типирования локуса рассчитывали по отношению числа образцов с выявленными неоднозначностями к общему числу образцов.
Результаты и обсуждение. В ходе проведения исследований для ряда генотипов были выявлены неоднозначности по всем исследуемым локусам. Ранее при изучении локусов II класса неоднозначности по локусу HLA-DRB1 авторами [1, 2] не выявлялись.
Показатели неоднозначности, рассчитанные по каждому из локусов, представлены в табл. 1, из которой следует, что наименьший показатель неоднозначности имеет локус II класса HLA-DRB1 (0,16%), локусы I класса ^А-А и HLA-B характеризуются одинаковым показателем неоднозначности, равным 4,43%. Выявление неоднозначностей по локусу HLA-DRB1 только у трех образцов свидетельствует прежде всего о меньшем генетическом разнообразии этого локуса в сравнении с локусами HLA-A и HLA-В (по данным на октябрь 2010 г 831 аллель локуса HLA-DRB1 [9]).
Типы неоднозначностей, выявленных при проведении HLA-типирования по локусам HLA-А, HLA-В и HLA-DRB1, представлены в табл. 2, 3 и 4 соответственно.
Для локуса HLA-А было выявлено 13 типов неоднозначностей (см. табл. 2). Наиболее часто выявляемыми типами неоднозначностей являются А*01+А*11 или А*36:04+А*11, А*03+А*32 или А*74:13+А*32:04, А*01+А*26 или А*36:04+А*26:29, которые составляют 59,25% от общего числа выявленных неоднозначностей. Неоднозначности типов А*03+А*23 или А*03:07+А*24:71, А*31+А*31 или А*31+А*33:21, А*26:23+А*68 или А*66+А*68 оказались наиболее редко встречающимися и были выявлены всего по одному разу.
Зачастую первым этапом «раскрытия» аллельных неоднозначностей может стать их анализ с использованием листа «редких» аллелей («редкими» считаются аллели, частота встречаемости которых ниже чем 1:50 000), доступного в режиме on-line в глобальной сети Интернет [8]. Так, аллели А*02:135 и А*26:23, входящие в состав неоднозначностей типов 5 и 13 (см. табл. 2), соответственно относятся к "редким" аллелям и выявлены у японцев. Вероятность их определения у населения, проживающего на территории Приволжского федерального округа, приближается к нулю. Аналогично раскрываем неоднозначности типов 4 и 6, так как "редкие" аллели А*33:19 и А*24:13 были выявлены у индейца Северной Америки и аборигена Австралии соответственно.
Таким образом, использование листа "редких" аллелей позволяет нам устранить 4 типа неоднозначностей по локусу HLA-А (номера 4, 5, 6 и 13 (см. табл. 2), тем самым снизив показатель неоднозначности локуса HLA-А с 4,43% (81 образец с неоднозначностями) до 3,28% (60 образцов с неоднозначностями). Однако раскрывать неоднозначности вышеуказанным способом допускается лишь в том случае, когда речь идет о типировании в низком или среднем разрешении и определена этническая принадлежность каждого индивидуума, в генотипе которого выявлена неоднозначность, что не всегда доступно при формировании регистров неродственных доноров гемопоэтических стволовых клеток.
Аллели А*26:29, А*26:33, А*29:20, А*33:21, А*66:11 также в настоящее время находятся в листе "редких" аллелей, однако исключить вероятность их появления у обследуемых нами людей также нельзя, так как первые два из них выявлены у европеоидов, по трем остальным данных нет, а данных о распределении аллелей среди населения России крайне мало. Кроме того, необходимо указать, что из 1381 аллеля, известного на настоящий момент (по данным на октябрь 2010 г.) [9], 933 (67,56%) являются "редкими" [9, 13].
Для раскрытия выявленных типов неоднозначностей в лаборатории следует использовать второй метод HLA-типирования. Ранее нами была предпринята попытка раскрытия неоднозначностей по технологии SВТ с использованием базовых наборов реагентов AlleleSEQR Sequencing в сочетании с наборами реагентов AlleleSEQR HARPs (Heterozygous ambiguity resolution primers - праймеры для разрешения гетерозиготных неоднозначностей) [2]. Экспериментально показано, что применение вышеуказанных наборов реагентов не позволяет раскрыть неоднозначности типов А*03+А*32 или А*74:13+А*32:04 и А*01+А*11 или А*36:04+А*11, поэтому необходимо дальнейшее изучение рынка наборов реагентов для проведения HLA-типирования с целью поиска технологии, позволяющей раскрывать все типы выявляемых неоднозначностей.
Для локуса HLA-В было выявлено 27 типов неоднозначностей (см. табл. 3). Значительное увеличение количества типов неоднозначностей по локусу HLA-В по сравнению с HLA-А при таком же показателе неоднозначности - 4,43% (см. табл. 1) связано с наибольшим по сравнению с другими локусами генетическим разнообразием локуса HLA-В (по данным на октябрь 2010 г. известно 1927 аллелей [9]).
Наиболее часто встречающимися являются неоднозначности типов В*07+В*39 или В*07:85+В*67:01, В*15+В*40
Таблица 3
типы неоднозначностей по локусу HLA-В
№ п/п Тип неоднозначности Число образцов с данным типом неоднозначности
1 В*07+В*39 или В*07:85+В*67:01 11
2 В*15+В*40 или В*46+В*40 8
3 В*08+В*40:88 или В*08+В*41 7
4 В*07+В*48 или В*81+В*48:08 4
5 В*15+В*15 или В*15+В*46 4
6 В*44+В*50:01 или В*44:09+В*49:02 4
7 В*35+В*35:63 или В*41+В*35:87 4
8 В*08+В*55 или В*08:53+В*56:19М 4
9 В*13+В*56 или В*13:03+В*55:02 4
10 В*08+В*51 или В*08:03+В*78:01 3
11 В*35+В*51 или В*53+В*78:02 3
12 В*07+В*41 или В*40:32+В*42 3
13 В*18+В*56 или В*18:36+В'55 3
14 В*13+В*50:01 или В*13:09+В*49:02 3
15 В*18+В*55 или В*18:15+В*56:19Н 3
16 В*15+В*41 или В*6+В*41 2
17 В*40:88+В*50 или В*50+В*50 1
18 В*15+В*55 или В*15:50+В*56:25 1
19 В*39+В*55 или В*39:35+В*56:19М 1
20 В*08+В*53 или В*08:03+В*35 1
21 В*38+В*44:75 или В*39+В*44 1
22 В*37+В*39 или В*37:05+В*38:17 1
23 В*40:88+В*49 или В*50+В*49 1
24 В*37+В*55 или В*37:13+В*56:19М 1
25 В*55+В*57 или В*56+В*57:26 1
26 B*15+B*50 или В*46+В*50 1
27 В*44+В*50 или В*44:46+В*49:02 1
или В*46+В*40, В*08+В*40:88 или В*08+В*41, которые были выявлены в 11, 8 и 7 случаях соответственно. Применение листа «редких» аллелей позволило бы раскрыть 9 типов неоднозначностей под номерами 3, 7, 8, 11, 15, 17, 19, 23 и 24; поскольку аллели В*40:88, В*35:63, В*78:02, В*56:19И являются "редкими" и были выявлены у представителей азиатской популяции (Китай, Корея, Япония), показатель неоднозначности локуса снижается с 4,43 до 3,06%. Более того, в неоднозначностях типов 8 и 24 выявляются по два "редких" аллеля одновременно - В*08:53+В*56:19И и В*37:13+В*56:19И соответственно.
Аллели В*07:85, В*55:02, В*18:36, В*56:25, В*44:75, В*38:17, В*57:26 обнаруживаются в листе "редких" аллелей, но исключение их на основании только этих данных недопустимо на основании причин, изложенных нами ранее при исследовании неоднозначностей по локусу HLA-А. Это требует применения другого метода проведения HLA-типирования с целью раскрытия данных типов неоднозначностей. При этом опыт использования наборов реагентов AlleleSEQR Sequencing в сочетании с наборами реагентов AlleleSEQR HARPs [2] в отношении неоднозначностей по локусу HLA-В оказался успешным.
При исследовании 1829 образцов по локусу HLA-DRE1 выявлено всего 3 типа неоднозначностей, причем каждый из них был выявлен всего один раз (см. табл. 4).
Таблица 4
типы неоднозначностей по локусу HLA-DRВ1
№ п/п Тип неоднозначности Число образцов с данным типом неоднозначности
1 DRB1*03+DRB*14 или 1
DRB1*14:79+DRB1*14:95
2 DRB1*08+DRB1*14:06 или 1
DRB1*13:55+DRB1*14:52
3 DRB1*01:22+DRB1*04 или DRB 1*04+DRB 1*04 1
При проведении анализа неоднозначностей с применением листа "редких" аллелей в неоднозначности типа 1 присутствует один "редкий" аллель - DRB1*14:79 (нет данных о популяционной принадлежности индивидуума, у которого аллель был выявлен), в неоднозначности типа 3 также присутствует один "редкий" аллель - DRB1*01:22 (нет данных о популяционной принадлежности индивидуума, у которого аллель был выявлен). В неоднозначности типа 2 выявлено сразу два "редких" аллеля - DRB1*14:06 (нет данных о попу-ляционной принадлежности индивидуума, у которого аллель был выявлен) и DRB1*13:55 (выявлен у представителя латиноамериканской популяции). Несмотря на то что в последнем случае теоретическое раскрытие неоднозначности возможно, принято решение о повторном типировании данного образца по локусу HLA-DRB1 другим методом, т. е. показатель неоднозначности локуса HLA-DRB1 остается прежним.
Таким образом, наборы реагентов LABType SSO (One Lambda, США) с разрешением от среднего к высокому применительно к населению Приволжского федерального округа характеризуются относительно высокими показателями неоднозначности по локусам HLA-A и HLA-B. Поэтому дальнейшие исследования целесообразно направить на выбор второго метода HLA-типирования, оптимального для раскрытия выявленных типов неоднозначностей, и по-
следующего определения относительной частоты встречаемости каждой пары аллельных вариантов из неоднозначности. Определение относительной частоты встречаемости каждой пары аллельных вариантов из неоднозначности и установление порога прекращения разрешения неоднозначности (случай, когда вероятность появления одной пары аллельных вариантов примерно в 20 000 раз ниже вероятности появления другой [5]) позволят сократить долю неоднозначностей, требующих разрешения, с минимальным риском ошибки.
ЛИТЕРАТУРА
1. Логинова М. А., Парамонов И. В., Трофимова Н. П. // Вестн. службы крови России. - 2010. - № 3. - С. 27-31.
2. Логинова М. А., Парамонов И. В., Трофимова Н. П. // Вестн. трансплантол. и искусственных органов. - 2010. - Т. 12, №-4. -С. 33-38.
3. Пальцев М. А., Хаитов Р. М., Алексеев Л. П. Иммуногенетика человека и биобезопасность. - М., 2009.
4. Abdulwahab N., Lake S., DiPaolaN. et al. // Hum. Immunol. - 2010.
- Vol. 71 (suppl. 1). - P. S97.
5. Adams S. D., Barracchini K. C., Chen D. et al. // J. Translational Med. - 2004. - Vol. 2. - P. 30-36.
6. DeOliveiraA., Balgansuren G., Holeman B. et al. // Hum. Immunol.
- 2010. - Vol. 71(suppl. 1). - P. S87.
7. Hibbet S., Willey P., Mohanakumar T. et al. // Hum. Immunol. -2010. - Vol. 71 (suppl.). - P. S11.
8. http://allelefrequencies.net.
9. http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html.
10. http://www.bmdw.org.
11. Mackay I., Rosen F. S. // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 343, № 11.
- P. 782-787.
12. Mayr W. R. // ISBT Science Series. - 2010. - Vol. 5. - P. 176-178.
13. MiddletonD., GonzalezF., Fernandez-Vina M. et al. // Tissiue Antigens. - 2009. - Vol. 74, № 6. - P. 480-485.
14. Morishima Y. // ISBT Science Series. - 2009. - Vol. 4. - P. 318-322.
Поступила 25.01.11
© М. В. КУВШИНОВ, А. П. ОБРЯДИНА, 2012 УДК 615.373:57.083.33.083.185
М. В. Кувшинов, А. П. Обрядина
актуальные проблемы сравнения результатов количественных иммуноферментных тестов
ООО НПО "Диагностические системы'; Нижний Новгород
Проведен анализ ситуации на отечественном рынке иммуноферментных диагностикумов с количественным учетом результатов. Рассмотрены проблемы совпадения и интерпретации их результатов, проанализированы причины их несовпадения. Объяснены понятия биологической неопределенности и метрологической прослеживаемости.
Ключевые слова: иммуноферментные диагностикумы, совпадение результатов, неопределенность результатов, метрологическая прослеживаемость
M.V. Kuvshinov, A.P. Obryadina THE ACTUAL ISSUES OF COMPARING THE RESULTS OF QUANTITATIVE IMMUNE-ENZYME TESTS The analysis was applied to the situation on national market of immune-enzyme diagnosticums with further quantitative reporting of results. The issues of coincidence and interpretation of results and causes of discrepancy are considered. The notions of biologic ambiguity and metrological traceability are explained.
Key words: immune-enzyme diagnosticum, coincidence of results, ambiguity of results, metrological traceability
