Аллельный полиморфизм генов факторов ангиогенеза при генитальном эндометриозе

Кублинский Константин Сергеевич; Евтушенко Ирина Дмитриевна; Новицкий Вячеслав Викторович; Уразова Ольга Ивановна; Колобовникова Юлия Владимировна; Ковалева Анна Сергеевна

DOI: 10.12731/wSD-2016-1-24-35 УДК 618.146/.16-007.61:575.174.015.3

АЛЛЕЛЬНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ФАКТОРОВ АНГИОГЕНЕЗА ПРИ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ

Кублинский К.С., Евтушенко И.Д., Новицкий В.В., Уразова О.И., Колобовникова Ю.В., Ковалева А.С.

С привлечением современных молекулярно-генетических методов исследования показано, что к развитию генитального эндометриоза у женщин предрасполагает носительство аллеля С и генотипов GC и CC полиморфного варианта G-405C гена VEGF, аллеля А и генотипов GA и АА полиморфного участка G-1154A гена VEGF, аллеля С и генотипов ТС и СС полиморфизма T-604C гена KDR, а также аллеля А и генотипов СА и GА полиморфизма G-735A гена Ang2.

Ключевые слова: генитальный эндометриоз; лапароскопия; аллель-ный полиморфизм генов факторов ангиогенеза.

ALLELIC POLYMORPHISM OF GENES OF FACTORS OF ANGIOGENESIS IN CASE OF GENITAL ENDOMETRIOSIS

Kublinskiy K.S., Evtushenko I.D., Novitskiy V.V., Urazova O.I., KolobovnikovaY.V., Kovaleva A.S.

With the using modern molecular-genetic methods for the study it was shown that the allele C and genotypes GC and CC of the polymorphic variant G-405C of VEGF gene, allele A and genotypes GA and AA of the polymorphic region G-1154A of VEGF gene, allele C and genotypes ТС and СС of polymorphism T-604C of KDR gene as well as allele A and genotypes СА and GА ofpolymorphism G-735A of Ang2 gene predisposes to the development of genital endometriosis in women.

Keywords: genital endometriosis; laparoscopy; allelic polymorphism of genes of factors of angiogenesis.

Введение

Эндометриоз - это дисгормональное, иммунозависимое, генетически детерминированное заболевание, связанное с доброкачественным разрастанием ткани, морфологически и функционально подобной эндометрию, за пределами полости матки [1]. После воспалительных заболеваний и миомы матки относится к числу наиболее распространенных гинекологических заболеваний, поражая до 10% женщин репродуктивного возраста [3, 6].

Ангиогенез является одним из ключевых звеньев развития различных форм генитального эндометриоза. Дисбаланс факторов ангиогенеза, в том числе генетически обусловленный, способствует усилению проли-феративной активности сосудов и росту эктопированного эндометрия. В связи с этим представляется актуальным анализ аллельного полиморфизма генов факторов ангиогенеза с целью оценки возможного их вклада в этиологию и патогенез заболевания [3, 4].

Цель исследования - оценить предрасполагающую роль аллельных вариантов генов факторов ангиогенеза VEGF, KDR, Ang2 в развитии ге-нитального эндометриоза.

Материал и методы исследования

В исследование были включены 529 женщин в возрасте от 21 до 40 лет (средний возраст 31±1,2 года).

В основную группу вошли 417 пациенток, страдающих эндометри-озом, которые были госпитализированы в гинекологическую клинику ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России в период 2009-2012 гг. для проведения диагностической, либо оперативной лапароскопии и гистероскопии. Лапароскопию и гистероскопию выполняли по стандартной методике с использованием аппаратуры фирмы «Karl Storz» (Германия).

Группу контроля составили 112 женщин без эндометриоза.

У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор и использование крови для проведения исследований. Кровь для молекулярно-генетических методов исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях (у женщин с эндометриозом утром в день операции). Образцы крови хранили при -70°С до момента исследования.

Выделение ДНК из периферической крови проводили сорбентным методом согласно инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «ДНК-сорб-В» (ООО «ИнтерЛабСервис», г. Москва).

Исследование полиморфных участков генов факторов ангиогенеза G-405C VEGF, G-1154A VEGF, T-604C KDR и G-735A Ang2 проводили с использованием ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) в два этапа. На первом этапе проводили амплификацию фрагмента:

- гена VEGF, используя олигонуклеотидные праймеры к специфическому участку гена (forward 5'-TAG-GAG-TCT-TGT-CTC-ATG-CC-3' и reverse 5'-GCA-CTT-AAG-CAG-TCT-GTT-TGA-G-3');

- гена VEGF, используя олигонуклеотидные праймеры к специфическому участку гена (forward 5'-GAA-CTG-CCA-CTT-CAG-CTG-TCT-3' и reverse: 5'-GAA-AGA-CCT-CCC-AGC-GGT-CA-3');

- гена KDR, используя олигонуклеотидные праймеры к специфическому участку гена (forward 5'-TGG-GAA-CTG-TAC-CTG-TCA-CTC-3' и reverse: 5'-GGC-CCA-GGA-TCC-TGA-GCC-3');

- гена Ang2, используя олигонуклеотидные праймеры к специфическому участку гена (forward 5'-GAA-AGA-CCT-CCC-AGC-GGT-CCA-3' и reverse: 5'-GAA-CTG-CCA-CTT-CAG-CTG-CT-3').

Смесь для амплификации объёмом 20 мкл содержала 100-200 нг ДНК, 2,5 нМ каждого праймера, 1 мМ смесь четырёх dNTP, 1мМ MgCl2, 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы («Лаборатория Медиген», г. Новосибирск) и 10х буфер, поставляемый производителем с ферментом.

Программа амплификации включала 5 мин предварительной денатурации при 95 °С и 35 циклов: 95 °С - 40 с, 55 °С - 15 с, 72 °С - 40 с. Программу завершала элонгация при 72 °С в течение 5 мин.

На втором этапе исследования проводили инкубацию ампликона с добавлением рестриктазы MspI (для VEGF), рестриктазы MteI (для KDR) и рестриктазы BlsI (для Ang2) («СибЭнзим», г. Новосибирск) при 37 °С в течение 5 ч.

Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей в группах исследования использовали критерий х2 Пирсона с поправкой Йетса. Обработка результатов генетических исследований осуществлялась с использованием критерия отношения шансов OR (oddsratio) с расчетом для него 95% доверительного интервала.

Результаты исследования и их обсуждение

Последнее время актуальность приобретают исследования по оценке генетического риска развития генитального эндометриоза. Поиск маркеров предрасположенности к эндометриозу среди аллелей генов факторов ангиогенеза - новый и перспективный раздел исследований [7].

Доказана роль ангиогенеза и ангиогенных факторов в развитии проли-феративных заболеваний женской половой сферы. Из множества проан-гиогенных факторов, участвующих в физиологическом и патологическом ангиогенезе, наиболее важным является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF, Vascular endothelial growth factor) A. Являясь гликозилированным митогеном, он специфически воздействует на эндотелиальные клетки и обладает плейотропными эффектами, в том числе опосредует повышение проницаемости стенки сосудов, индуцирует рост эндотелиальных клеток, ингибирует их апоптоз. Ген KDR кодирует один из трех рецепторов VEGF - VEGFR-2, при связывании с которым VEGF проявляет свою активность, ориентированную на активацию пролиферации эндотелиоци-тов, поддержание их жизнеспособности и миграции, трубчатого морфогенеза и прорастания сосудов. Активация эндотелиоцитов и образование новых кровеносных сосудов - строго регулируемые процессы; эндоте-лиоциты, утратившие способность к межклеточным и клеточно-матрикс-

ным взаимодействиям, погибают. Взаимодействие эндотелиоцитов с перицитами (клетки Руже - отростчатые клетки соединительной ткани) и гладкомышечными клетками осуществляется как за счет ростовых факторов, так и посредством ангиопоэтинов. Ангиопоэтин-1 высвобождается перицитами (входят в состав стенки микрососудов, в частности капилляров) и усиливает ангиогенез. Ангиопоэтин-2 связывается с тем же рецептором, что и ангиопоэтин-1, однако является его антагонистом, поскольку под его влиянием происходит атрофия сосудов. По мнению ряда авторов, в основе патогенеза эндометриоза лежит дисбаланс между факторами, регулирующими процессы пролиферации клеток и ангиогенеза [2, 4, 5]. Очевидно, что гены, вовлечённые в ангиогенез, оказывают значительное влияние на подверженность к эндометриозу.

Таблица 1.

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G-405C гена VEGF (абс., %) у женщин с эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма G-405C гена VEGF Группы обследованных лиц х2;р OR (95% С1)

Женщины без эндометриоза (п=108) Женщины с эндометриозом (п=251)

ОС 82 (75,93) 146 (58,17) 10,380; 0,006 0,44 (0,26-0,75)

GC 21 (19,44) 88 (35,06) 2,24 (1,26-3,99)

^ 5 (4,63) 17 (6,77) 1,50 (0,50-4,78)

C 31 (14,35) 122 (24,30) 8,334; 0,004 1,92 (1,22-3,02)

Примечание. Здесь и в табл. 2, 3, 4: п - количество человек в группе. Анализ качественных независимых данных проводили с помощью критерия х2 Пирсона. р - уровень статистической значимости различий между группами. Статистически значимыми различия считали при р<0,05. OR - критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с группой контроля с 95% доверительным интервалом.

В результате проведенного нами молекулярно-генетического исследования установлено, что среди женщин контрольной группы превалировал генотип ОО (75,93%) полиморфного участка G-405C гена VEGF, реже обнаруживались генотипы GC и CC (табл. 1). У женщин с эндометриозом распределение аллелей (х2=10,380; р=0,006) и генотипов (Х2=8,334; р=0,004) полиморфизма G-405C гена VEGF отличалось от такового в группе сравнения. Генотип ОО полиморфного участка G-405C гена VEGF у них также был преобладающим (в 58,17% случаев), однако частота генотипов GC и CC была выше, чем в контрольной группе. Кроме того, выявлялась положительная ассоциация эндометриоза с аллелем C (OR=1,92) и генотипом GC (OR=2,24) данного полиморфизма, в то время как генотип ОО промоторного региона G-405C гена VEGF оказывал про-тективный эффект в отношении заболевания (OR=0,44) (табл. 1).

Что касается полиморфизма G-1154A гена VEGF, то у пациенток с эн-дометриозом, как и у женщин контрольной группы, генотип ОО встречался наиболее часто - у 87,96% и 53,39% соответственно, однако распределение аллелей (х2=39,288; р<0,001) и генотипов (х2=40,719; р<0,001) данного полиморфизма у них различалось (табл. 2). Частота регистрации генотипов GА и АА полиморфизма G-1154A гена VEGF при эндометриозе была выше, чем в группе сравнения. Носительство аллеля А (OR=5,44) и указанных генотипов предрасполагало к эндометриозу (OR=4,84 при генотипе GА и OR=6,65 при генотипе АА), а гомозиготного генотипа ОО полиморфизма G-1154A гена VEGF - напротив, обусловливало протек-тивный эффект в отношении его развития (OR=0,16) (табл. 2).

У женщин с эндометриозом распределение генотипов (х2=25,099; р<0,001) и аллелей (х2=27,552; р<0,001) полиморфизма T-604C гена КОК существенно отличалось от такового в группе контроля. По результатам молекулярно-ге-нетического исследования было установлено, что среди женщин без эндоме-триоза превалировал генотип ТТ (80,33%) полиморфного участка T-604C гена КОК, генотип ТС обнаруживался у 12,96%, а генотип СС - у 3,70% женщин. У пациенток с генитальным эндометриозом генотип ТТ полиморфного участка T-604C гена КОК также был преобладающим и встречался в 55,78% слу-

чаев, а частота генотипов ТС и СС оказалась существенно выше, чем в контрольной группе (31,47% и 12,75% соответственно). Кроме того, выявлялась ассоциация аллеля С ^=3,51) и генотипов ТС ^=3,08) и СС ^=3,80) полиморфизма Т-604С гена KDR с эндометриозом. При этом фактором, обусловливающим протективный эффект в отношении заболевания, оказался генотип ТТ (OR=0,25) полиморфизма Т-604С гена KDR (табл. 3).

Таблица 2.

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма О-1154А гена VEGF (абс., %) у женщин с эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма О-1154А гена VEGF Группы обследованных лиц х2;р OR (95% С1)

Женщины без эндометриоза (п=108) Женщины с эндометриозом (п=251)

ОС 95 (87,96) 134 (53,39) 39,288; <0,001 0,16 (0,08-0,31)

ОА 11 (10,19) 89 (35,46) 4,84 (2,37-10,11)

АА 2 (1,85) 28 (11,16) 6,65 (1,50-41,19)

А 15 (6,94) 145 (28,88) 40,719; <0,001 5,44 (3,03-9,93)

Таблица 3.

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма T-604C гена KDR (абс., %) у женщин с эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма T-604C генаKDR Группы обследованных лиц х2;р OR (95% С1)

Женщины без эндометриоза (п=108) Женщины с эндометриозом (п=251)

^ 90 (83,33) 140 (55,78) 25,099; <0,001 0,25 (0,14-0,46)

К 14 (12,96) 79 (31,47) 3,08 (1,60-6,04)

^ 4 (3,70) 32 (12,75) 3,80 (1,24-13,02)

C 22 (10,19) 143 (28,49) 27,552; <0,001 3,51 (2,12-5,86)

Анализ распределения аллелей и генотипов полиморфизма G-735A гена Ang2 также выявил статистически значимые различия между контрольной и основной группами обследованных женщин (х2=207,560; р<0,001 и х2=297,017; р<0,001 соответственно) (табл. 4). Гомозиготный генотип АА встречался существенно чаще у пациенток с эндометриозом (62,55%), реже выявлялись генотипы ОО и ОА (табл. 4). Носительство аллеля А ^=56,81) и генотипов АА ^=178,71) и ОА ^=3,76) полиморфизма G-735A гена Ang2 предрасполагало к развитию эндометриоза (табл. 4).

Таблица 4.

Распределение генотипов и аллелей полиморфизмав-735А гена Ащ2 (абс., %) у женщин с эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма в-735А гена Ащ2 Группы обследованных лиц х2;р OR (95% С1)

Женщины без эндо-метриоза (п=108) Женщины с эндоме-триозом (п=251)

ОС 98 (90,74) 30 (11,59) 207,560; <0,001 0,01 (0,01-0,03)

ОА 9 (8,33) 64 (25,50) 3,76 (1,72-8,48)

АА 1 (0,93) 157 (62,55) 178,71 (26,41-3505,18)

А 11 (5,09) 378 (75,30) 297,017; <0,001 56,81 (29,03-114,00)

На основании полученных результатов можно сделать вывод о том, что к развитию генитального эндометриоза у женщин предрасполагает носительство аллеля С и генотипов GC и CC полиморфного варианта G-405C гена VEGF, аллеля А и генотипов ОА и АА полиморфного участка G-1154A гена VEGF, аллеля С и генотипов ТС и СС полиморфизма T-604C гена КОК, а также аллеля А и генотипов СА и GА полиморфизма G-735A гена Ang2.

Список литературы

1. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы: Руководство для врачей. М.: Медицина, 2006. 416 с.

2. Волкова Л.В., Аляутдина О.С. Клинико-диагностическое значение сосу-дисто-эндотелиального фактора роста при неудачных попытках ЭКО // Акушерство и гинекология. 2011. № 4. С. 126-129.

3. Дамиров М.М. Современная тактика ведения больных с аденомиозом: практическое руководство. М.: Издательство БИНОМ; 2015. 112 с.

4. Кузнецова И.В. Роль ангиогенеза в патогенезе эндометриоза // Акушерство и гинекология. 2011. № 5. С. 16-22.

5. Чехонин В.П., Шеин С.А., Корчагина А.А. , Гурина О.И. Роль VEGF в развитии неопластического ангиогенеза // Вестник РАМН. 2012. № 2. С. 23-34

6. Iwabe T., Harada T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis-associated infertility // Gynec. Obstet. Invest. 2002. Vol. 53, №1. P. 19-25.

7. Nisolle M., Alvarez M.L., Colombo M., Foidart J.M. Pathogenesis of endometriosis. Gynecol. Obstet. Fertil., 2007, no. 35 (9), pp. 898-903.

References

1. Adamyan L.V., Kulakov V.I., Andreeva E.N. Endometriozy [Endometriosis]: A Guide for Physicians. Moscow: Meditsina, 2006, 416 р.

2. Volkova L.V., Alyautdina O.S. Kliniko-diagnosticheskoe znachenie sosudis-to-endotelial'nogo faktora rosta pri neudachnykh popytkakh EKO [Clinical diagnostic value of vascular endothelial growth factor in the unsuccessful attempts of IVF]. Akusherstvo iginekologiya. 2011, no. 4, рр. 126-129.

3. Damirov M.M. Sovremennaya taktika vedeniya bol'nykh s adenomiozom: prakticheskoe rukovodstvo [Modern tactics of patients with adenomyosis: a practical guide]. Moscow: BINOM; 2015. 112 р.

4. Kuznetsova I.V. Rol' angiogeneza v patogeneze endometrioza [The role of an-giogenesis in the pathogenesis of endometriosis]. Akusherstvo i ginekologiya, 2011, no. 5, рр. 16-22.

5. Chekhonin V.P., Shein S.A., Korchagina A.A. , Gurina O.I. Rol' VEGF v raz-vitii neoplasticheskogo angiogeneza [The role of VEGF in the development of neoplastic angiogenesis]. VestnikRAMN, 2012, no. 2, pp. 23-34.

6. Iwabe T., Harada T., Terakawa N. Role of cytokines in endometriosis-associat-ed infertility. Gynec. Obstet. Invest., 2002, no. 1, pp. 19-25.

7. Nisolle M., Alvarez M.L., Colombo M., Foidart J.M. Pathogenesis of endometriosis. Gynecol. Obstet. Fertil., 2007, no. 35 (9), pp. 898-903.

ДАННЫЕ ОБ АВТОРАХ

Кублинский Константин Сергеевич, докторант кафедры акушерства и гинекологии, кандидат медицинских наук