CC BY
9
Материалы III Санкт-Петербургского международного экологического форума
Инфекция и иммунитет
пыриной, M.R.J. Clokie, A.M. Kropinski, Э. Каттер, А. Сулаквелидзе, C.P. Sword, M.J. Pickett, С.Н. Золотухина.
В качестве тест-штамма для оптимизации параметров индукции использовали вирулентный штамм L. Monocytogenes — 766, индикаторным служил референс-штамм L. monocytogenes 9-127. В качестве индуцирующего агента использовали ультрафиолетовые лучи (УФ-лучи), источником которых служила ртутно-кварцевая лампа, дающая не менее 90 % излучаемой энергии в виде УФ-лучей с длиной волны 254 нм. Плотность среды при облучении, время экспозиции и расстояние до источника света варьировали.
В результате проведенных исследований выделены три листериозных бактериофага, разработана оптимальная схема выделения методом индукции УФ-лучами. Экспериментально установлено, что для облучения наилучшим образом подходит жидкая слабощелочная среда, время экспозиции — 30 с, расстояние до источника излучения — 40 см.
Т018 АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ БОРДЕТЕЛЛЁЗА ЖИВОТНЫХ И БРОНХОСЕПТИКОЗА ЛЮДЕЙ
Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова
ФГБОУВПО УГСХА им. П.А Столыпина
В России отсутствуют официальные статистические данные по распространению бордетеллёза животных и бронхосептикоза людей, что, по-нашему мнению, обусловлено отсутствием эффективных мер детекции возбудителя.
Мы разработали тест-систему индикации и идентификации бактерий B. bronchiseptica (ТСИИ), включающую бактериологический, иммунологический, молекулярно-генетический и фаговый компоненты.
Бактериологическая детекция бактерий B. bronchiseptica включает взятие глубоких мазков из глотки на 2 чашки Петри с дифференциально-диагностической средой с селективными компонентами и без них и культивирование в течение 24—48 ч при t 35—37°С. Далее проведение отбора характерных колоний и дополнительное изучение их свойств. Срок проведения исследования 72—96 ч. Иммунологическая детекция бактерий B. bronchiseptica проводится как дополнение бактериологической идентификации при помощи пластинчатой реакции агглютинации на предметном стекле или реакции диффузной пре-цепитации. Максимальный срок проведения анализа в течение часа. Молекулярно-генетическая детекция бактерий B. bronchiseptica включает выделение нуклеиновых кислот из культур сорбентным способом, проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции с системами праймеров, детекция с помощью горизонтального электрофореза и в режиме «реального времени». Программа проведения ПЦР с электрофоретической детекцией — 1) 95°С—5 мин,
2) 95°С—10 сек, 62°С—10 сек, 72°С—20 сек — 40 циклов,
3) 72°С—2 мин; для детекции в режиме реального времени — 1) 95°С - 5 мин, 2) 95°С - 10 сек, 62°С -15 сек — 40 циклов, 3) 72°С — 1 мин. Детекция бактерий B. bronchiseptica специфическими фагами осуществляют с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием биопрепарата «ББР-117 УГСХА». РНФ позволяет обнаружить бордетеллы в концентрации от 103 м.к. в 1 мл исследуемого биома-
териала за 26 часов без выделения чистой культуры. В качестве дополнения к бактериологической детекции проводят реакцию «стекающей капли». Срок исследования составляет до 66 ч.
ТСИИ возможно использовать для подтверждения клинического диагноза, выявления атипичных форм заболевания, обнаружения бактерионосителей в окружении больных животных, а также для установления ретроспективного диагноза.
Т019 БИОПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БАКТЕРИЙ BORDETELLA BRONCHISEPTICA
Ю.Б. Васильева, Д.А. Васильев, А.В. Мастиленко, Д.Г. Сверкалова
ФГБОУ ВПО УГСХА им. П.А. Столыпина
Для детекции бактерий Bordetella bronchiseptica мы разработали биопрепараты.
Для выделения чистой культуры бактерий B. bronchiseptica сконструирована дифференциально-диагностическая среда (состав г/л: пептон ферментативный 20,0; сернокислое железо — 0,02 г/л, сернокислый магний — 0,4 г/л, хлорид натрия 4,5—6,5 г/л, крахмал 5,0 г/л, мочевина 5,0 г/л, лактоза — 0,7; бромтимоловый синий — 0,02; хлорид бария — 0,4); селективные добавки (цефазолин — 0,004 г/л, ампициллин — 0,0025 г/л, флуконазол, миконазол — 0,002 г/л. рН среды 7,0+0,2. Для антигенной детекции возбудителя бордетеллёза предлагаем использовать антиген B. bronchiseptica, получаемый методом ультразвуковой дезинтеграцией (частота 23 кГц, амплитуда колебаний 7 микрон, в течение 1 мин. на 1 мл суспензии бактериальной массы с постоянным охлаждением в смеси спирта со льдом) и иммунную сыворотку, получаемую гипериммунизацией кроликов (предварительное внутримышечное введение смеси адъюванта Фрейнда с бордетеллёзным антигеном 1:1 в дозе 0,5 мл с последующим внутривенным введением антигена кроликам в дозах 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 и 1,5 мл с интервалом 3 дня и забором крови через 20 дней).
Для обнаружения ДНК бактерий B.bronchiseptica в биоматериале без выделения чистой культуры или как подтверждение бактериологического исследования рекомендуем праймеры (Pr1-1 (5' ccttccagcacctggcggtacgagttgctcc 3'), Pr1-2 (5' ccccgtgccggggtgcctggacctgggcg 3') для гена BfrAДHКB.bronchisepft'ca; Pr3-1 (5'ggacgaccaggatcacatcttcc 3'), Pr3-2 (5' gctttcctggtagttgg-cgtagg 3') для гена BfrZ; Pr4-1 (5' gcattgctccatcctgttgtgcg 3'), Pr4-2 (5' gatgggttatctgagcgcgc 3') для гена Cytochrom—C—oxidase и Pr5-1 (5' ctacgggggaaagcggggga 3'), Pr5-1 (5' gaccgtactccccaggcggt 3') для гена 16S rRNA), флуоресцентный зонд для системы праймеров участка гена bfrZ.
Для обнаружения бактерий B. bronchiseptica реакцией нарастания титра фага (РНФ) без выделения чистой культуры или в качестве подтверждения бактериологического исследования методом «стекающей капли» рекомендуем применять фаговый биопрепарат ББР—117 УГСХА. Технологические параметры изготовления препарата: получение борде-теллёзных фагов ультрафиолетовой детекцией культуры, соотношение количества фаговых корпускул и бактериальных клеток индикаторных штаммов В. bronchiseptica — 1:2, время инкубации при температуре 37°С — 7 ч, обработка хлороформом в пропорции 1:10 в течение 15 мин.
