CC BY
57
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК РЕСПУБЛИКИ ТАДЖИКИСТАН ________________________________2009, том 52, №11___________________________
ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 581.132:577.1
Академик АН Республики Таджикистан Х.Х.Каримов, член-корреспондент АН Республики Таджикистан Х.А.Абдуллаев, М.А.Бободжанова , член-корреспондент АН Республики Таджикистан К.А.Алиев, Ш.А.Эсаналиева ,
Б.А.Солиева
АКТИВНОСТЬ РИБУЛОЗО-1,5-БИСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗЫ/ОКСИГЕНАЗЫ У СТАРОДАВНИХ И СОВРЕМЕННЫХ СОРТОВ ТОНКОВОЛОКНИСТОГО ХЛОПЧАТНИКА в088УР1иМ БАКБАВЕШЕ Ь.
В работе [1] при сравнительном анализе литературных и наших собственных экспериментальных данных по СО2-газообмену листьев некоторых видов и сортов растений в связи с их эволюцией и селекцией новых сортов было показано, что у пшеницы [2], риса [3], хлопчатника [4], гороха [5], арабидопсиса [6] томата [7] и некоторых других видов растений уровень интенсивности фотосинтеза в процессе их многовековой эволюции и многолетней селекции не претерпел существенных изменений. Так как ключевым ферментом фотосинтеза, определяющим скорость фиксации СО2, является рибулозо-1,5-
бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФК/О) (КФ 4.1.1.39), а также мультиферментные комплексы, включающие в себя помимо этого фермента рибозофосфатизомеразу, фосфори-булокиназу, фосфоглицераткиназу и глицеральдегидфосфатдегидрогеназу [8], то интересно было выявить, изменился ли в течение столетней селекции хлопчатника уровень активности РБФК/О.
В этой связи целью настоящей работы явилось сравнительное изучение карбоксилаз-ной активности фермента РБФК/О у стародавних и новых сортов тонковолокнистого хлопчатника.
Объекты и методы исследований
Объектами исследований служили генотипы тонковолокнистого хлопчатника Gossy-р1пш ЪагЪаёете Ь.: американо-египетский сорт Пима (сорт столетней давности, возделывался с 1907 г.), сорта первой сортосмены (23), третьей сортосмены (5595-В) и шестой сортосмены (9336-В). Эти сорта были любезно предоставлены в наше распоряжение кандидатом сельскохозяйственных наук А.С.Сангиновым и академиком Б.С.Сангиновым из генетической коллекции тонковолокнистого хлопчатника Вахшского филиала им. В.П.Красичкова Института земледелия Таджикской академии сельскохозяйственных наук.
Все сорта выращивались в одинаковых агроклиматических и агротехнических условиях на экспериментальном участке Института физиологии растений и генетики АН Респуб-
лики Таджикистан (г.Душанбе), согласно агроуказаниям по возделыванию хлопчатника в Таджикистане [9].
Для опытов брали листья 20-25-дневного возраста (4-5 листья от точки роста). Кар-боксилазную активность рибулозобисфосфаткарбок-силазы/оксигеназы мультиферментных комплексов определяли в экстрактах из листьев на спектрофотометре Ultrospec II (LKB, Швеция) по методике Рэккера, модифицированной А.К.Романовой [10]. В качестве субстрата использовали рибозо-5-фосфат+АТФ.
Все опыты проводились в трех биологических повторностях и четырех параллельных аналитических определениях. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием программы «STATGRAPШCS» (версия 2 Windows, 2001). В таблицах приведены среднеарифметические величины и их стандартные ошибки. Достоверность различий определяли по ^критерию Стьюдента при уровне значимости Р=0.01.
Результаты исследований
Результаты анализа рибулозобисфосфатной активности мультиферментного комплекса цикла Кальвина-Бенсона у сортов тонковолокнистого хлопчатника различной сортосмены в течение дня и в различные фазы развития растений представлены в табл. 1-3.
Анализ уровня карбоксилазной активности РБФК/О в дневной динамике в фазу бутонизации - начала цветения (табл.1) показал, что у всех исследованных нами сортов, как стародавних, так и новых, начиная с 9 ч уровень активности РБФК/О повышался и достигал максимальной величины к 11 ч, затем к 15 ч снижался до утреннего уровня. При этом между сортами при различных способах расчёта активности фермента - на белок, массу и площадь листа, достоверные различия при уровне значимости Р=0.01 не были выявлены, за исключением сорта 23, у которого различие было установлено в 9 ч только в пересчёте на площадь листа (табл. 1).
В фазы массового плодоношения (табл.2) и начала раскрытия коробочек (табл.3) уровень карбоксилазной активности РБФК/О у всех изученных нами сортов уменьшился в 2-3 раза. В дневной динамике в изменчивости уровня активности РБФК/О в фазе массового плодоношения чёткой картины обнаружить не удалось. Однако общий итог опытов был один и тот же - карбоксилазная активность РБФК/О в течение дня у сравниваемых стародавних и новых сортов была одинаковой, за исключением сорта 23 (в 9 ч) и у сорта 9326-В (в 15 ч), у которых при всех способах расчёта по сравнению с другими сортами выявилась достоверная разница при Р=0.01 (табл.2 и 3).
Таблица 1
Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментного комплекса цикла Кальвина-Бенсона в листьях сортов тонковолокнистого хлопчатника различной сортосмены. Фаза массовой бутонизации - начала цветения. 2009 г.
Сортосмена, годы Сорт Активность РБф >-карбоксилазы, мкмоль СО2/мин на:
общее содержание белка в 1 г навески мг белка (УА) г сырой массы листа дм2 листа
9 ч
0 1929-1938 Пима 19.24±0.28 0.067±0.001 3.84±0.05 10.93±0.14
I 1938-1948 23 16.86±0.25 0.060±0.002 3.37±0.05 8.51±0.12*
III 1964-1973 5595-В 18.41±0.27 0.091±0.001 3.68±0.06 12.35±0.17
VI 1991 по н.вр. 9326-В 19.41±0.29 0.079±0.001 3.88±0.05 10.55±0.15
11 ч
0 1929-1938 Пима 23.45±0.35 0.097±0.001 4.69±0.07 12.12±0.16
I 1938-1948 23 26.12±0.36 0.105±0.001 5.22±0.08 12.38±0.17
III 1964-1973 5595-В 25.68±0.35 0.086±0.001 5.14±0.07 13.96±0.19
VI 1991 по н.вр. 9326-В 26.76±0.37 0.094±0.001 5.35±0.07 13.79±0.19
15 ч
0 1929-1938 Пима 20.86±0.31 0.077±0.004 4.17±0.05 9.48±0.14
I 1938-1948 23 (1938) 22.33±0.33 0.137±0.006 4.46±0.06 10.15±0.15
III 1964-1973 5595-В 20.39±0.30 0.116±0.003 4.08±0.06 10.51±0.15
VI 1991 по н.вр. 9326-В 19.42±0.29 0.087±0.004 3.88±0.06 11.04±0.15
Примечание: 0 - сортосмена по тонковолокнистому хлопчатнику не проводилась, возделывание сорта Пима началось в Таджикистане с 1935 г. * - разница в сравнении с другими сортами достоверна при Р=0.01.
Следует отметить, что в трёх сериях опытов, проведённых в три фазы развития растений хлопчатника, в 112 аналитических измерениях и 336 расчетных определениях были выявлены только 12 случаев (2.6%) статистически достоверных различий по уровню карбокси-лазной активности РБФК/О у сортов 23 (5), 5595-В (3) и 9326 (4).
Можно допустить, что эти различия являются результатом случайных ошибок, допущенных при проведении экспериментов вследствие того, что при определении активности фермента моглит быть использованы физиологически разновозрастные растения или листья, имеющие внешне одинаковое сходство.
Таблица 2
Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментного комплекса цикла Кальвина-Бенсона в листьях сортов тонковолокнистого хлопчатника различной сортосмены. Фаза массового плодоношения. 2009 г.
Сортосмена, годы Сорт Активность РБФ-карбоксилазы, мкмоль СО2/мин на:
общее содержание белка в 5 г навески мг белка (УА) г сырой массы листа дм2 листа
9 ч
0 1929-1938 Пима 9.73±0.14 0.031±0.002 1.95±0.02 6.14±0.09
I 1938-1948 23 5.83±0.08* 0.020±0.004 * 1. 17±0.01* 4.07±0.06*
III 1964-1973 5595-В 11.54±0.16 0.040±0.002 2.31±0.03* 7.53±0.11
VI 1991 по н.вр. 9326-В 8.86±0.13 0.032±0.003 1.77±0.02 6.18±0.09
11 ч
0 1929-1938 Пима 8.30±0.16 0.029±0.005 1.66±0.03 4.62±0.06
I 1938-1948 23 9.19±0.56 0.037±0.002 1.84±0.05 4.98±0.07
III 1964-1973 5595-В 9.02±0.48 0.032±0.003 1.81±0.05 4.89±0.09
VI 1991 по н.вр. 9326-В 7.18±0.09 0.027±0.009 1.44±0.03 4.31±0.06
15 ч
0 1929-1938 Пима 9.06±0.48 0.040±0.002 1.85±0.01 5.38±0.08
I 1938-1948 23 7.82±0.10 0.033±0.04 1.56±0.02 4.25±0.04
III 1964-1973 5595-В 8.34±0.12 0.031±0.006 1.66±0.02 4.97±0.07
VI 1991 по н.вр. 9326-В 11.10±0.16* 0.041±0.003 2.22±0.03* 6.50±0.09*
Примечание:* - разница в сравнении с другими сортами достоверна при Р=0.01.
Результаты анализа данных, приведённых в табл. 2, показали, что в фазе массового плодоношения у сорта 23 достоверная разница по уровню карбоксилазной активности РБФК/О в сравнении с другими сортами обнаруживалась только в 9 ч, а в другое время дня -в 11 и 15 ч достоверное различие между сортами не выявилось. У сорта 9326-В достоверное различие по этому показателю между сортами проявилось только после полудня - в 15 ч, а в двух предыдущих сериях опытов - в 9 ч и 11 ч достоверные различия между сортами не установлены. Если бы достоверные различия по уровню активности РБФК/О повторялись постоянно в течение дня - в 9, 11 и 15 ч, то можно было бы говорить об истинных различиях, обусловленных генотипом сорта. Поэтому эти различия, скорее всего, могут быть результа-
том случайного использования физиологически разновозрастных растений или листьев для анализов у сортов 23 и 9326-В.
Таблица 3
Рибулозобисфосфаткарбоксилазная активность мультиферментного комплекса цикла Кальвина-Бенсона в листьях сортов тонковолокнистого хлопчатника различной сортосмены. Время проведения опыта - 9 ч. Фаза начала раскрытия коробочек. 2009 г.
Сортосмена, годы Активность РБФ-карбоксилазы, мкмоль СО2/мин на:
Сорт общее содержание белка в 5 г навески мг белка (УА) г сырой массы листа дм2 листа
0 1929-1938 Пима 8.64±0.09 0.029±0.00 4 1.75±0.03 6.12±0.06
I 1938-1948 23 8.64±0.08 0.031±0.00 2 1.76±0.02 6.23±0.05
III 1964-1973 5595-В 11.39±0.09* 0.030±0.00 4 2.78±0.02* 6.74±0.09
VI 1991 по н.вр. 9326-В 10.04±0.09* 0.032±0.00 6 1.88±0.05 6.63±0.06
Примечание: * - разница в сравнении с другими сортами достоверна при Р Р=0.01.
Активность РБФК/О как динамичный фотосинтетический признак закономерно изменялась и в течение вегетационного периода. Как видно из данных табл. 1-3, у всех исследованных сортов хлопчатника максимальная карбоксилазная активность РБФК/О наблюдалась в фазе массовой бутонизации - начала цветения (табл.1), а в фазах массового плодоношения (табл.2) и начала раскрытия коробочек (табл.3) активность фермента уменьшалась почти в 1.5-2.0 раза. При этом во все фазы развития растений хлопчатника карбоксилазная активность РБФК/О, независимо от способов расчёта, у сопоставляемых сортов хлопчатника различной сортосмены была одинаковой.
Таким образом, подводя итоги анализа данных, полученных при определении уровня карбоксилазной активности РБФК/О у стародавних и современных сортов тонковолокнистого хлопчатника, можно сделать вывод о том, что в процессе многолетней селекции этой культуры уровень активности РБФК/О как консервативный признак существенно не изменялся.
Обсуждение результатов исследований
На наш взгляд, представляется интересным обсудить два аспекта результатов наших экспериментальных исследований: изменчивость уровня карбоксилазной активности фермента РБФК/О в течение дня и вегетации растений и консервативность этого признака фото-синтетического аппарата в процессе многолетней селекции новых сортов.
Изменчивость уровня карбоксилазной активности РБФК/О в течение дня и вегетации. Как показали результаты наших исследований, уровень активности РБФК/О изменялся в
течение дня и в процессе вегетации растений. Как уже отмечалось, чёткая закономерность в изменении активности РБФК/О в течение дня в фазу массового плодоношения не проявилась. Возможно это объясняется особенностями регуляции активности фермента у разных генотипов: неодинаковой реакцией на действие температуры и освещённости, неодинаковым изменением диффузионного сопротивления устьиц СО2 - потоку, динамикой содержания крахмала и т.д. Изменения карбоксилазной активности РБФК/О в течение дня могут быть связаны с эндогенными факторами: с функционированием устьичного аппарата, определяющего скорость поступления и диффузии СО2-потока к центрам карбоксилирования; с интенсивностью самого процесса карбоксилирования в цикле Кальвина-Бенсона; со скоростью регенерации акцептора СО2-рибулозо-1,5-бисфосфата (РБФ); с накоплением крахмала в хлоропластах и его метаболизацией в течение всего дня и т.д. Ограничивающим или усиливающим активность РБФК/О фактором может выступить любой из вышеперечисленных компонентов фотосинтетического аппарата. Так, максимальная карбоксилазная активность фермента РБФК/О в начале дня (к 11 ч), возможно, связана с тем, что открытость и низкое диффузионное сопротивление устьиц СО2-потоку приводили к увеличению концентрации СО2 в межклетниках листа и в центрах карбоксилирования, а это, в свою очередь, обусловило повышение активности РБФК/О и скорости регенерации акцептора СО2- РБФ.
Незначительное снижение уровня активности РБФК/О к 15 ч у некоторых сортов, возможно, объясняется повышением температуры воздуха в дневное время, что приводит к закрытию устьичной щели, с накоплением большого количества крахмала в хлоропластах, препятствующим доступ СО2 к центрам карбоксилирования.
Как было отмечено выше, уровень активности РБФК/О закономерно изменяется и в течение вегетационного периода растений.
Нам представляется, что изменчивость уровня активности РБФК/О в течение вегетации теснейшим образом связана с изменением физиологического состояния растений и с периодом функционирования зрелых листьев.
Таблица 4
Температура воздуха (оС) и интенсивность освещения (ФАР, цЕ/м^сек) в дни и часы проведения опытов (показания автоматизированной станции сбора метеопараметров HOBO Station). 2009 г.
Дата проведения опытов Метеопараметры Время взятия проб, ч
9 11 15
30 июля температура 29.5 34.8 37.0
освещённость 971.2 1246.2 1326.2
31 августа температура 27.4 31.4 33.8
освещённость 548.7 1173.7 1123.7
14 октября температура 20.1 26.6 27.5
освещенность 478.7 998.7 748.7
Высокая активность РБФК/О в фазу бутонизации - начала цветения, возможно, обусловлена интенсивным ростом и развитием растений, а некоторое понижение уровня активности РБФК/О в фазы плодоношения и созревания - с переходом растений в репродуктивный период и со старением листьев.
Кроме того, изменение активности РБФК/О в течение вегетации происходит под влиянием сезонных изменений температуры воздуха и интенсивности освещения. Так, по показаниям автоматизированной станции сбора метеопараметров HOBO Station (табл. 4) на месте проведения опытов в 2009 г. в конце июля температура воздуха составляла 29.5...37.0°С, а приход фотосинтетически активной радиации (ФАР) -971.2-1326.2 цЕ/м •сек. В конце августа - начале сентября температура воздуха постепенно стала снижаться и в середине октября она понизилась на 9-10оС, а интенсивность освещения уменьшилась на 25-50%. В соответствии с этим максимальная активность РБФК/О наблюдалась в конце июля, в фазе бутонизации - начала цветения (табл. 1), а в фазах плодоношения (табл. 2) и созревания (табл. 3) уровень карбоксилазной активности РБФК/О уменьшился в 2-3 раза. Эти данные свидетельствуют о том, что изменения уровня активности РБФК/О в течение вегетации обуславливаются изменениями температуры окружающей среды и прихода ФАР.
О консервативности уровня карбоксилазной активности РБФК/О. Результаты наших опытов показали, что между стародавним сортом тонковолокнистого хлопчатника Пима и сортами первой сортосмены - 23, третьей сортосмены - 5595-В и последней, шестой сортосмены - 9326-В этой культуры по уровню карбоксилазной активности фермента РБФК/О в течение дня и вегетации, различий нет. Напрашивается естественный вопрос: чем обусловлена такая высокая консервативность этого важнейшего показателя функционирования фо-тосинтетического аппарата у тонковолокнистого хлопчатника в течение столетней селекции новых сортов этой культуры.
На наш взгляд, это объясняется тем, что структурная организация хлоропластов контролируется кооперативным взаимодействием двух генетических систем клетки - геномом и пластомом.
Все использованные в работе сорта тонковолокнистого хлопчатника имеют гомологичные ядерные АД2 геномы. Это говорит об общности структурно-функциональной организации ядерных генов исследованных стародавних и современных сортов тонковолокнистого хлопчатника, регулирующих биогенез хлоропластов, в том числе синтез и функционирование малых субъединиц РБФК/О.
У высших растений большая субъединица (rboL) ключевого фермента фиксации СО2 - РБФК/О детерминируется высококонсервативным генетическим аппаратом самих хлоро-
пластов-пластомом, который трудно поддаётся изменениям (пластомные мутации в природе возникают с очень низкой частотой -10" ).
В пользу высокой консервативности уровня карбоксилазной активности фермента РБФК/О свидетельствуют также данные, полученные при молекулярно-генетическом анализе ДНК хлоропластов. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК хло-ропластов (хпДНК) растений фасоли и вигны из семейства бобовых показал, что хпДНК у этих растений имеет 94-95% гомологичных нуклеотидных последовательностей [11]. Сравнение аминокислотной последовательности пластидного гена (пластогена) большой субъединицы РБФК/О (гЬсЬ) у хлопчатника с продуктами аналогичных генов растений табака, шпината и кукурузы показало, что они имеют одинаковое количество аминокислотных остатков [12]. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что гены пластома, детерминирующие карбоксилазную активность РБФК/О, у многих видов могут быть идентичными.
На основе приведённых выше данных можно предположить, что гомологичность молекулярно-генетической организации хлоропластов исследованных стародавних и новых сортов тонковолокнистого хлопчатника обуславливает у них одинаковый уровень энзиматической активности РБФК/О.
Заключение
Таким образом, полученные в настоящей работе результаты по сравнительному анализу карбоксилазной активности РБФК/О у стародавних и новых сортов тонковолокнистого хлопчатника позволяют заключить, что в процессе почти вековой селекции новых сортов этой культуры уровень карбоксилазной активности ключевого фермента фиксации СО2 - ри-булозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы не претерпел существенных изменений, то есть практическая селекция не затронула структурной организации этого фермента.
Институт физиологии растений Поступило 06.10.2009 г
и генетики АН Республики Таджикистан,
H«
Таджикский национальный университет
ЛИТЕРАТУРА
1. Миракилов Х.М., Абдуллаев Х.А., Каримов Х.Х. - Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. наук, 2009, №1 (166), с. 50-61.
2. Беликов П.С., Моторина М.В., Куркова Е.Б. - Изв. ТСХА, 1961, №5 (42), с. 44-54.
3. Evans L.T., Vísperas R.M., Vergasa D.S. - Field Crops Research. 1984, v.8, рр. 105-124.
4. Абдуллаев Х.А., Каримов Х.Х. - Изв. АН РТ. Отд. биол. и мед. наук, 2007, №4 (161), с. 31-39.
5. Логинов М.А., Касьяненко А.Г. - Тезисы докл. Второй науч. конф. Тадж. биохим. общ-ва. - Душанбе, 1964, с.13.
6. Усманов П.Д. - Генотипическая изменчивость фотосинтетического аппарата высших растений: Автореф. дис.. д.б.н. Ин-т общей генетики АН СССР. - М., 1984, 45 с.
7. Родионов В.С. - Физиология растений, 1963, т. 10, вып. 6, с. 644-651.
8. Бабаджанова М.П., Бабаджанова М.А., Алиев К.А. - Физиология растений, 1997, т.53, №1,
с. 38-44.
9. Научно-обоснованная система земледелия Таджикской ССР. - Душанбе: Ирфон, 1984, 498 с.
10. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микроорганизмов. - М.: Наука, 1980, 158 с.
11. Palmer J.D., Sing G.P., Pillay D.TN. - Mol. Gen. Genet., 1983, v. 190, рр. 13-19.
12. Гулов М.К. - Клонирование и характеристика гена rtoL хлопчатника Gossypium hirsutum L. сорта 108-Ф: Автореф. дис.к.б.н. - Минск, 1990, 24 с.
Х.Х,.Каримов, Х,.А.Абдуллоев, М.А.Бобочонова, ^.А.Алиев, Ш.А.Эсаналиева,
Б.А.Солиева
ФАЪОЛНОКИИ РИБУЛОЗО-1,5-БИОСФОСФАТКАРБОКСИЛАЗА/ОКСИГЕНАЗА ДАР НАВЪХ,ОИ КУХ,НАТАРИН ВА НАВИНИ ПАХТАИ МА^ИННАХ GOSSYPIUM BARBADENSE L.
Тахлили мук;оисавии фаъолнокии ферменти рибулозо-1,5-
биосфаткарбоксилаза/оксигеназа дар навъхои кухнатарин ва навини пахтаи махиннах нишон дод, ки дар давоми селексияи садсолаи навъхои нави ин зироат дарачаи фаъолнокии ин ферменти мухими протсесси фотосинтез хамчун аломати нихоят пойдор (консервативй) ба таври назаррас тагйир наёфтааст, яъне селексияи амалй ба сохтори ин фермент таъсир нарасондааст.
Kh.Kh.Karimov, Kh.A.Abdullaev, M.A.Babadjanova, K.A.Aliev, Sh.A. Esanalieva,
B.A.Solieva
RIBULOSE-1,5-BISPHOSPHATECARBOXYLASE/OXYGENASE ACTIVITY OF OBSOLETE AND MODERN LONG-STAPLE COTTON VARIETIES
GOSSYPIUM BARBADENSE L.
Comparatives analysis of carboxylase activity of Rubisko of obsolete and modern long-staple cotton varieties showed that during the one hundred years of new varieties selection of this cultures the Rubisko activity as a conservative traits is not changed significantly, and the practical selection did not affect the structural organization of this enzyme.
